CN108918493B - 一种pH荧光染料、pH荧光探针、制备方法和应用 - Google Patents
一种pH荧光染料、pH荧光探针、制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医用材料技术领域,涉及一种pH荧光染料、pH荧光探针、制备方法和应用。本发明的pH荧光染料,包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液。本发明的pH荧光探针,包括载体以及包裹于所述载体中的所述的荧光染料;所述pH荧光探针为微米级的pH荧光探针。本发明能够实现对pH值做出实时、快速、准确的分析,获得较好的比率计量效果;将该pH荧光探针与细胞共培养可以较长时间内存在荧光,实时检测细胞的微环境,有效反应体内微环境的变化。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,涉及荧光探针,具体而言,涉及一种pH荧光染料、pH荧光探针、制备方法和应用。
背景技术
细胞内的pH在生命体中扮演着重要的角色,它与细胞维持正常的功能息息相关。化学反应的进行或完成,细胞和细胞器的许多重要生理过程等都与pH值密切相关。如细胞内的pH在酶活性、细胞增殖和凋亡、抗药性、离子运输、内吞作用和肌肉收缩等一系列组织活动中起着至关重要的作用。不正常的细胞功能、生长和分裂通常与不正常的pH值直接或间接相关,酸性和碱性过强会导致心、肺病变或神经类疾病,还可能会引发如癌症和阿莫兹海默综合症等疾病,严重时甚至会有生命危险。因此,pH值的精确测量对化学生物学的研究十分重要。
目前,细胞内pH的监测方法主要包括弱酸弱碱分布法、核磁共振法、微电极法以及荧光探针法。弱酸弱碱分布法中弱电解质在细胞内外达到分布平衡需要的时间较长,不能测定短期内细胞内pH值的变化;并且这种方法对细胞的创伤较大,对细胞内结构的破坏会引起细胞内pH值发生变化。核磁共振法细胞敏感性低,测量时需要的细胞浓度较高;时间分辨率低,而长时间难维持细胞稳定的生理状态。微电极法技术操作复杂且难度较大;不适合胞径较小的细胞的测定。荧光探针检测法是基于光学信号变化的pH值测定方法,是利用一些有机化合物的荧光特性来指示目标介质酸碱度的变化。用荧光探针测定pH值是一种非侵入性的方法,既不会破坏样品,同时具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性低、细胞膜透过性好及测试方法简单等特点。荧光探针检测法不仅可以用于荧光显微学研究,而且可实时检测细胞内pH的动态分布和区域变化。
目前比率型荧光探针的应用越来越广泛,应用在比率型荧光探针上的荧光染料的研究也越来越受到重视。然而现有的该类荧光染料在实际应用中普遍存在一些不足,例如对pH变化敏感的敏感试剂和对pH变化不敏感的参比试剂分布不均匀,不利于比率计量,影响了检测结果的准确性;受环境因素影响较大,对pH值的变化具有较窄的pH响应范围,灵敏度、选择性和光稳定性较差等。现有的pH检测的探针大多也是基于上述染料得到的,存在这些染料拥有的不足;此外,现有的pH荧光探针还存在以下缺点:纳米颗粒探针容易被分泌囊泡包裹或附着在核内体上,限制了其在生物体系中的进一步应用;小分子探针体系荧光不强并且对光不稳定,易淬灭;与细胞内其他的分子发生螯合,使得荧光光谱偏移。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种pH荧光染料,以至少缓解现有技术中所存在的对pH变化敏感的敏感试剂和对pH变化不敏感的参比试剂分布不均匀,不利于比率计量的问题。
本发明的另一个目的在于提供一种pH荧光染料的制备方法,该方法操作简单,易于实施,效率高。
本发明的又一个目的在于提供一种pH荧光染料在荧光探针中的应用;以及,包含上述pH荧光染料的pH荧光探针;该荧光探针中对pH敏感和对pH不敏感的染料分布均匀,能够实现对pH值做出实时、快速、准确的分析,获得较好的比率计量效果;并且将该pH荧光探针与细胞共培养可以较长时间内存在荧光,实时检测细胞的微环境,有效反应体内微环境的变化。
本发明的又一个目的在于提供一种pH荧光探针的制备方法,该方法简单易行,原料易得,成本低廉,产率较高,光稳定性好。
本发明的又一个目的在于提供一种pH荧光染料和pH荧光探针的应用,本发明的pH荧光染料和pH荧光探针能够实现快速、准确检测出体内微环境的pH值,并且可以有效防止荧光染料进入细胞,可在较长时间内观察到荧光,因而能够应用在生物成像检测、pH值检测或细胞微环境检测中。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
根据本发明的一个方面,本发明提供一种pH荧光染料,包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液。
作为进一步优选技术方案,所述pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液的体积比为40~60:1,优选为45~55:1,进一步优选为50:1;
优选地,所述pH敏感性蛋白包括牛血清蛋白、人血清蛋白、酪蛋白和乳球蛋白中的至少一种,优选为牛血清蛋白;
优选地,采用低碳醇变性、丙酮变性、加热变性、加入重金属盐变性、加入SDS变性或加入尿素变性的方式对蛋白质进行变性,得到pH敏感性蛋白;
优选地,所述低碳醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和乙二醇中的至少一种,所述低碳醇优选为乙醇;
优选地,采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性;
优选地,所述参比pH敏感的荧光染料包括尼罗红、荧光素、菁染料和苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物中的至少一种,优选为尼罗红;
优选地,所述荧光素包括异硫氰酸荧光素、羧基荧光素及其衍生物中的一种或多种;和/或,所述菁染料包括菁染料Cy3、菁染料Cy5和菁染料Cy7中的一种或多种;和/或,所述苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物包括1,2-二氨基蒽醌、硝基苯并氧杂恶二唑和二苯基蒽系列中的一种或多种;
优选地,所述参比pH敏感的荧光染料的浓度为0.05~0.2mg/mL,优选为0.08~0.15mg/mL,进一步优选为0.1mg/mL。
根据本发明的另一个方面,本发明提供一种所述的pH荧光染料的制备方法,将pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液混合均匀,得到所述pH荧光染料。
作为进一步优选技术方案,所述pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液的体积比为40~60:1,优选为45~55:1,进一步优选为50:1;
优选地,所述pH敏感性蛋白包括牛血清蛋白、人血清蛋白、酪蛋白和乳球蛋白中的至少一种,优选为牛血清蛋白;
优选地,采用低碳醇变性、丙酮变性、加热变性、加入重金属盐变性、加入SDS变性或加入尿素变性的方式对蛋白质进行变性,得到pH敏感性蛋白;
优选地,所述低碳醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和乙二醇中的至少一种,所述低碳醇优选为乙醇;
优选地,采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性;
优选地,采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性,包括:
将蛋白质溶于水中,除去气泡;然后在搅拌下向其中逐滴加入质量分数为70~80%的乙醇,得到溶液A;
向溶液A中滴加质量分数为6~10%的交联剂,避光,搅拌交联15~20h;然后离心,分离,得到蛋白溶液;
优选地,每400~600mg蛋白质溶于8~12mL水中,乙醇的加入量为12~30mL,交联剂的加入量为150~300μL;
优选地,所述交联剂包括戊二醛、乙二醛和乙醇醛中的至少一种,优选为戊二醛。
作为进一步优选技术方案,所述参比pH敏感的荧光染料包括尼罗红、荧光素、菁染料和苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物中的至少一种,优选为尼罗红;
优选地,所述荧光素包括异硫氰酸荧光素、羧基荧光素及其衍生物中的一种或多种;和/或,所述菁染料包括菁染料Cy3、菁染料Cy5和菁染料Cy7中的一种或多种;和/或,所述苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物包括1,2-二氨基蒽醌、硝基苯并氧杂恶二唑和二苯基蒽系列中的一种或多种;
优选地,所述参比pH敏感的荧光染料的浓度为0.05~0.2mg/mL,优选为0.08~0.15mg/mL,进一步优选为0.1mg/mL。
根据本发明的另一个方面,本发明提供一种所述的pH荧光染料在荧光探针中的应用;
优选地,所述荧光探针为pH荧光探针。
根据本发明的另一个方面,本发明提供一种包括载体以及包裹于所述载体中的上述的pH荧光染料;所述pH荧光探针为微米级的pH荧光探针。
作为进一步优选技术方案,所述载体包括聚氨酯、环氧树脂、聚苯乙烯和聚酰胺中的至少一种,优选为聚氨酯;
优选地,所述微米级的pH荧光探针的粒径为1~500μm,优选为20~200μm;
优选地,所述载体的粒径为1~500μm,优选为20~200μm;
优选地,所述载体和所述pH荧光染料的质量比为500:1~100:1,优选为200:1~100:1。
根据本发明的另一个方面,本发明提供一种所述的pH荧光探针的制备方法将载体溶液与pH荧光染料混合均匀,得到混合溶液;
将所述混合溶液滴加到含有表面活性剂的水中,混合均匀,得到所述pH荧光探针;
优选地,所述载体溶液的浓度为0.08~0.2g/mL;和/或,所述载体溶液与所述pH荧光染料的体积比为1:8~15;
优选地,载体的制备方法包括自乳化-固化法、静电喷雾法、微流控法和离子凝聚法中的任意一种,优选为自乳化-固化法;
优选地,载体为聚氨酯微球,采用自乳化-固化法制备聚氨酯微球包括:将聚氨酯溶液作为油相滴加到水相中,混合,溶剂挥发使得聚氨酯自固化成球,其中,聚氨酯溶液的浓度优选为5%~10%,搅拌的速度优选为200~800rpm;
优选地,所述表面活性剂包括吐温20和/或吐温80,优选为吐温20。
根据本发明的另一个方面,本发明提供一种所述的pH荧光染料和所述的pH荧光探针在生物成像检测、pH值检测或细胞微环境检测中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1、本发明的提供的pH荧光染料包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液,其中参比pH敏感的荧光染料即为对pH变化不敏感的荧光染料,能够做到pH变化敏感的敏感试剂和对pH变化不敏感的参比试剂分布均匀,获得较好的比率计量效果;同时,二者的结合可以对pH值的变化具有较宽的pH响应范围,受周围环境影响小,光稳定好。
2、本发明的比率型pH荧光探针,将载体包裹的pH荧光染料作为pH荧光探针监测细胞pH,以反应体内微环境的变化。即,本发明将对pH敏感的变性蛋白和对pH不敏感的荧光染料均匀混合包裹于载体微球中,能够做到对pH敏感和对pH不敏感的染料或探针的均匀分布,便于计量比率荧光,可以获得较好的比率计量效果,提高了检测结果的准确性。
3、本发明的微米级的pH荧光探针不会进入到细胞内部,因此也不会被分泌囊泡包裹或附着在核内体上而限制了其在生物体系中的进一步应用。将pH荧光染料包裹于载体中,由于外层载体的保护荧光物质不易被分解,较为稳定地存在,对光稳定,不易淬灭,进一步提高了检测准确性。
4、本发明的pH荧光染料和荧光探针的制备方法工艺流程简单,操作简便、易于实施,处理原料来源广、经济易得,操作成本低;能够实现快速检测出体内微环境的pH值,并且可以有效防止荧光染料进入细胞,可在较长时间内观察到荧光,更加有利于临床上的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的变性蛋白的荧光光谱图;
图2为本发明实施例1提供的pH荧光染料的荧光光谱图;
图3为本发明实施例1提供的pH荧光探针的微球形貌图;
图4为本发明实施例1提供的pH荧光探针对不同的pH的响应荧光图;
图5为本发明实施例2提供的变性蛋白的荧光光谱图;
图6为本发明实施例3提供的pH荧光染料的荧光光谱图;
图7为本发明实施例4提供的pH荧光探针的微球形貌图;
图8为本发明实施例5提供的pH荧光探针的微球形貌图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施方式和实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面,在至少一个实施例中提供一种pH荧光染料,包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液。
目前,比率型荧光传感器或荧光探针越来越受到重视,其主要包括两种实现方式,一种是利用荧光试剂能对底物产生两个荧光强度(不同激发或发射波长处)的变化,从而消除设备本身条件和外界环境变化引起的测量误差;另一种是利用两种荧光试剂,即对pH变化敏感的敏感试剂和对pH变化不敏感的参比试剂实现荧光比率测量。然而目前这种具有双波长的、对pH敏感的荧光试剂还很少,不同批次产品的荧光强度存在差异,不适于大规模、连续的实际应用。另外,现有的对pH变化敏感的敏感试剂和对pH变化不敏感的参比试剂很难做到均匀分布,不利于比率计量,影响了检测结果的准确性。鉴于此,本发明提出了一种包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液的复合型荧光染料,能够使得二者均匀的分布,可以通过比率荧光法更加准确地测定pH值,获得更好的比率计量效果,准确度高,受环境因素的影响较小,且对pH值的变化具有较宽的pH响应范围,能够准确反映周围环境的pH,灵敏度高、选择性好、对光稳定。并且原料价格低廉,来源广,容易获得,利用效率高。同时包含蛋白的荧光染料具有很高的应用价值,对医学和生命科学具有重大意义。
需要说明的是,所述的“pH敏感”为本领域的常规术语,按照本领域的常规理解即可,本发明对此不做特殊限制,例如可以理解为对pH值在一定范围内的变化敏感。“参比pH敏感的荧光染料”即为相对于pH敏感性蛋白而言,对pH变化不敏感的荧光染料或者是pH惰性的荧光染料。
在一种优选的实施方式中,所述pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液的体积比为40~60:1,优选为45~55:1,进一步优选为50:1;典型但非限制的,pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液的体积比例如可以为40:1、45:1、50:1、55:1或60:1;适宜的体积比可以获得更好的比率计量效果,选择性及可靠性更好。
优选地,所述pH敏感性蛋白包括牛血清蛋白(BSA蛋白)、人血清蛋白、酪蛋白和乳球蛋白中的至少一种,优选为牛血清蛋白。
本发明中,pH敏感性蛋白所采用的蛋白质原料优选为BSA;将蛋白质BSA(sigma82064-50g)进行变性,得到对pH敏感的蛋白,具有原料价格低廉,来源广,容易获得,且利用效率高,pH动态测试范围较宽的优势,缓解了现有的对pH敏感的染料分子存在价格昂贵、利用效率低,以及与对pH不敏感的荧光染料分布不均等问题。
优选地,采用低碳醇变性、丙酮变性、加热变性、加入重金属盐变性、加入SDS变性或加入尿素变性的方式对蛋白质进行变性,得到pH敏感性蛋白,所述低碳醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和乙二醇中的至少一种,所述低碳醇优选为乙醇;
优选地,采用低碳醇变性的方式对蛋白质进行变性,进一步优选采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性;
本发明中,对于蛋白变性的具体操作方式不做特殊限定,可采用本领域常用的变性方式对BSA蛋白质进行变性,以得到具有一定荧光强度、对pH变化敏感的pH敏感性蛋白溶液。
可以理解的是,本发明对于低碳醇也没有特殊限制,可采用在蛋白变性领域常用的低碳醇,包括但不限于乙醇、甲醇、丙醇等,实际应用中,可根据需求选择适宜的低碳醇。考虑到原料来源的广泛性和操作的便捷性,优选采用的是乙醇变性的方式对蛋白质进行变性,具有操作简单,易于实施,原料来源广、成本低等特点。
优选地,所述参比pH敏感的荧光染料包括尼罗红、荧光素、菁染料和苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物中的至少一种,优选为尼罗红;
优选地,所述荧光素包括但不限于异硫氰酸荧光素、羧基荧光素及其衍生物中的一种或多种;和/或,所述菁染料包括但不限于菁染料Cy3、菁染料Cy5和菁染料Cy7中的一种或多种;和/或,所述苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物包括但不限于1,2-二氨基蒽醌、硝基苯并氧杂恶二唑和二苯基蒽系列中的一种或多种;
优选地,所述参比pH敏感的荧光染料的浓度为0.05~0.2mg/mL,优选为0.08~0.15mg/mL,进一步优选为0.1mg/mL;典型但非限制的,该荧光染料的浓度例如可以为0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.12mg/mL、0.15mg/mL或0.2mg/mL。适宜的参比pH敏感的荧光染料的浓度便于与蛋白溶液混合,可以获得更好的比率计量效果,容易操作,稳定性更好。
可以理解的是,本发明对于参比pH敏感的荧光染料没有特殊限制,可以根据需要选择本领域常用的荧光染料中的一种或多种,例如可以为尼罗红、荧光素、菁染料、苯并氧杂蔥类化合物等。优选采用的是尼罗红,具有来源广、使用方便,价格低等特点。
对于尼罗红、荧光素、菁染料和苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物的具体类型也没有特殊限制,可以采用上述的荧光素、菁染料等,也可以根据实际情况,选择具有类似性质和功能的其他的荧光素、菁染料等。
需要说明的是,本发明对于蛋白质BSA、尼罗红、荧光素、菁染料和苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物等的来源没有特殊限制,如可以采用其市售商品。
第二方面,在至少一个实施例中提供一种所述的pH荧光染料的制备方法,将pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液混合均匀,得到所述pH荧光染料。
该方法操作简单,将两种原料混合均匀,即可,操作步骤少,混合均匀程度好,对设备要求低,生产成本低,还有助于提高生产效率。
在一种优选的实施方式中,所述pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液的体积比为40~60:1,优选为45~55:1,进一步优选为50:1;
优选地,所述pH敏感性蛋白包括牛血清蛋白、人血清蛋白、酪蛋白和乳球蛋白中的至少一种,优选为牛血清蛋白;
优选地,采用低碳醇变性、丙酮变性、加热变性、加入重金属盐变性、加入SDS变性或加入尿素变性的方式对蛋白质进行变性,得到pH敏感性蛋白,所述低碳醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和乙二醇中的至少一种,所述低碳醇优选为乙醇;
优选地,采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性。
可以理解的是,本发明对于蛋白质的变性方法没有特殊限制,可以采用本领域常用的方法进行变性,以获得较好的荧光强度。优选采用的是乙醇变性的方式,但不限于此,实际应用中,可以根据需要替换成其他变性方法,例如加热变性、加入重金属盐变性等方式。
优选地,采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性,包括:
将蛋白质溶于水中,除去气泡;然后在搅拌下向其中逐滴加入质量分数为70~80%的乙醇,得到溶液A;
向溶液A中滴加质量分数为6~10%的交联剂,避光,搅拌交联15~20h;然后离心,分离,得到蛋白溶液。
进一步优选地,采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性,包括:
将蛋白质溶于水中,静置,除去气泡;然后在搅拌下向其中逐滴加入质量分数为70~80%的乙醇,得到溶液A;典型但非限制的,所用的乙醇的质量分数例如可以为70%、72%、74%、75%、76%、78%或80%;
向溶液A中滴加质量分数为6~10%的戊二醛,避光,搅拌交联15~20h;然后离心,分离,得到蛋白溶液;典型但非限制的,所用的戊二醛的质量分数例如可以为6%、7%、8%、9%或10%,搅拌交联的时间例如可以为15h、16h、17h、18h、19h或20h;
优选地,所述交联剂包括戊二醛、乙二醛和乙醇醛中的至少一种,优选为戊二醛。采用适宜的交联剂例如戊二醛进行交联蛋白质中的氨基,可以增强蛋白质的变性效果,进一步获得性能优异的pH荧光染料。
优选地,每400~600mg蛋白质溶于8~12mL水中,乙醇的加入量为12~30mL,戊二醛的加入量为150~300μL;典型但非限制的,蛋白质的加入量例如可以为400mg、450mg、400mg、550mg或600mg,水的量例如可以为8mL、9mL、10mL、11mL或12mL,乙醇的加入量为12mL、14mL、15mL、16mL、18mL、20mL、22mL、25mL、28mL或30mL,戊二醛的加入量例如可以为150μL、180μL、200μL、220μL、250μL或300μL;
和/或,离心的转速为3000~4000rpm,时间为10~30min;典型但非限制的,离心的转速例如可为3000rpm、3200rpm、3500rpm、3600rpm、3800rpm或4000rpm,时间例如可以为10min、15min、20min、25min或30min。
作为一种优选的实施方式,采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性,包括以下步骤:
称取蛋白质(BSA)400~600mg置于15mL离心管中,并溶于8~12mL双蒸水中,上下倒置使其充分溶解;静置,除去气泡;吸取配好的BSA溶液8mL置于烧杯中,于室温下中速搅拌,往里面逐滴滴加12~30mL75%的乙醇;往上述溶液中滴加150~300μL8%的戊二醛(w:w%),避光,中速搅拌交联15~20h;将变性的BSA溶液在3000~4000rpm下离心10~30min,除去沉淀杂质。
采用乙醇变性的方式具有操作简单,易于实施,成本低,效率高,且获得的产品稳定性好,性能优异等特点。
在一种优选的实施方式中,参比pH敏感的荧光染料溶液的浓度为0.05~0.2mg/mL,优选为0.08~0.15mg/mL,进一步优选为0.1mg/mL;典型但非限制的,该溶液的浓度例如可以为0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.12mg/mL、0.15mg/mL或0.2mg/mL。本发明对于溶解参比pH敏感的荧光染料的溶剂也没有特殊限制,例如可采用本领域常用的有机溶剂丙酮、十二烷、十六烷、苯等,只要该荧光染料在该溶剂中具有适宜的溶解度即可。例如可以将尼罗红溶于丙酮中,形成浓度为0.1mg/mL的溶液。
优选地,pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液混合搅拌的时间为2~4h;典型但非限制的,搅拌时间例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h和或4h,搅拌的速度优选为中速。
作为一种优选的实施方式,混合荧光染料的制备方式包括:称取一定量的尼罗红溶于丙酮中,配制成浓度为0.1mg/mL的荧光染料溶液。将蛋白溶液与尼罗红溶液按照体积比50:1的比例混合,中速搅拌2~4h。
第三方面,在至少一个实施例中提供一种所述的pH荧光染料在荧光探针中的应用;
优选地,所述荧光探针为pH荧光探针。
第四方面,在至少一个实施例中提供一种pH荧光探针,包括载体以及包裹于所述载体中的上述的pH荧光染料;所述pH荧光探针为微米级的pH荧光探针。
本发明的pH荧光探针为比率型pH荧光探针,本发明的pH荧光染料包裹于载体中。将载体包裹的荧光染料作为pH荧光探针监测细胞pH,以反应体内微环境的变化。本发明将对pH敏感的变性蛋白和对pH不敏感的荧光染料如尼罗红等均匀混合包裹于载体微球中,能够做到对pH敏感和对pH不敏感的染料或探针的均匀分布,便于计量比率荧光,可以获得较好的比率计量效果。
本发明的微米级的荧光探针不会进入到细胞内部,因此也不会被分泌囊泡包裹或附着在核内体上而限制了其在生物体系中的进一步应用。
本发明的微米级的pH荧光探针还能缓解现有的小分子探针体系荧光不强并且对光不稳定,易淬灭;与细胞内其他的分子发生螯合,使得荧光光谱偏移的问题。
在一种优选的实施方式中,所述载体包括但不限于聚氨酯、环氧树脂、聚苯乙烯和聚酰胺中的至少一种,优选为聚氨酯;
可以理解的是,本发明对于载体的具体类型没有特殊限制,可以采用本领域常用的不溶于水的油性的高分子材料;优选采用的是聚氨酯,但并不限于此,实际应用中,可以根据需要替换成其他载体如环氧树脂、聚苯乙烯等。
需要说明的是,本发明对于载体聚氨酯、环氧树脂、聚苯乙烯和聚酰胺等的来源没有特殊的限制,采用本领域技术人员所熟知的各原料即可;如可以采用其市售商品的商品化微球,也可以采用本领域技术人员熟知的制备方法自行制备。
优选地,所述的载体为微球型;所述载体为微米级的载体;
优选地,所述pH荧光染料包裹于聚氨酯微球中;
优选地,所述微米级的pH荧光探针的粒径为1~500μm,优选为20~200μm;
优选地,所述载体的粒径为1~500μm,优选为20~200μm。
本发明的pH荧光探针为微球型pH荧光探针,粒径优选在20~200μm。
优选地,所述载体和所述pH荧光染料的质量比为500:1~100:1,优选为200:1~100:1。在适宜的载体和pH荧光染料的比例下,能够使得荧光染料分布的更均匀,得到的产品的稳定性好,进而有助于获得更好的比率计量效果。
采用聚氨酯微球为载体,同时接上了对探针pH敏感的荧光蛋白和对pH不敏感的尼罗红,能够做到比较好的比率计量效果。该微球型探针能够实现对pH值做出实时、快速、准确的分析。将其作为pH探针与细胞共培养可以较长时间内存在荧光,实时检测细胞的微环境,有效反应体内微环境的变化。
在微米级的聚氨酯微球中包裹了大量的小分子荧光探针使荧光增强,并且由于外层聚氨酯的保护荧光物质不易被分解,较为稳定地存在,对光稳定,不易淬灭。
第五方面,在至少一个实施例中提供一种前述的pH荧光探针的制备方法,将载体溶液与pH荧光染料混合均匀,得到混合溶液;
将所述混合溶液滴加到含有表面活性剂的水中,混合均匀,得到所述pH荧光探针。
优选地,所述载体溶液的浓度为0.08~0.2g/mL;和/或,所述载体溶液与所述pH荧光染料的体积比为1:8~15;
优选地,将浓度为0.08~0.2g/mL的载体溶液与所述pH荧光染料按照体积比为1:8~15的比例混合均匀,得到混合溶液;
将所述混合溶液滴加到含有表面活性剂的水中,搅拌,洗涤,得到所述pH荧光探针。
优选地,所述表面活性剂包括吐温20和/或吐温80,优选为吐温20;
优选地,将载体溶于甲苯中,得到浓度为0.08~0.2g/mL的溶液;所述溶液与所述pH荧光染料按照体积比为1:8~15的比例混合均匀,得到混合溶液;将所述混合溶液滴加到含有1%~2%的吐温20的水中,搅拌,洗涤,即可。
典型但非限制的,该载体溶液的浓度例如可以为0.08g/mL、0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL或0.2g/mL,体积比例如可以为1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15。
本发明先通过蛋白变性的方法制备出一种荧光染料,然后将其与尼罗红染料均匀混合获得混合荧光染料。再将混合荧光染料负载到聚氨酯微球上,即以聚氨酯微球为载体,即同时接上了对探针pH敏感的荧光蛋白和对pH不敏感的尼罗红,分布均匀,能够做到比较好的比率计量效果,该探针在pH6~9的范围呈现较宽的pH响应。
用此微球型pH探针可以检测不同pH值的缓冲液。
该微球型探针能够实现对pH值做出实时、快速、准确的分析,并且在检测过程中不受探针浓度的影响和受周围环境影响很小等。将其作为pH探针与细胞共培养可以实时检测细胞的微环境,有效反应体内微环境的变化,因而该蛋白-尼罗红微球型pH探针能够广泛的应用在体内微环境的检测中。
优选地,搅拌的转速为300~800rpm,时间为2~4h;典型但非限制的,搅拌的转速例如可为300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm或800rpm,时间例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h或4h。
作为一种优选的实施方式,负载荧光染料的聚氨酯微球的制备方式包括:
取一定质量的聚氨酯颗粒溶于甲苯溶液使浓度为0.1~0.2g/mL(m/v),溶解均匀后按体积比1:8~12的比例加入荧光染料,用涡旋仪混匀;取1mL上述聚氨酯溶液滴加到30mL含1%的吐温20的双蒸水中,在300~500rpm下搅拌2~4h,用去离子水洗涤3次,避光保存。
本发明制备出了蛋白-尼罗红微球型pH探针。通过将变性好的荧光染料负载到聚氨酯微球上,从而实现快速检测出体内微环境的pH值,并且可以有效防止荧光染料进入细胞,可在较长内观察到荧光。
本发明对于聚氨酯微球等载体的制备方法没有特殊限制,可以采用本领域中常用的制备方法进行制备。
优选地,载体的制备方法包括但不限于自乳化-固化法、静电喷雾法、微流控法和离子凝聚法中的任意一种,优选为自乳化-固化法;
优选地,载体为聚氨酯微球,采用自乳化-固化法制备聚氨酯微球包括:将聚氨酯溶液作为油相滴加到水相中,搅拌,在搅拌过程中甲苯溶剂挥发,使聚氨酯自固化成球,其中,聚氨酯溶液的浓度优选为5%~10%,搅拌的速度优选为200~800rpm。可通过调节聚氨酯浓度、转速等实验条件获得合适尺寸的聚氨酯微球。此荧光探针由于外层有聚氨酯的保护,荧光物质不易被分解,能较为稳定地存在,对光稳定,不易淬灭。
第六方面,在至少一个实施例中提供一种所述的pH荧光染料和所述的pH荧光探针在生物成像检测、pH值检测或细胞微环境检测中的应用。将本发明的pH荧光探针应用在细胞内的pH值的检测等领域,可以准确掌握细胞内pH的变化,进而为相关的生理和病理过程研究提供重要的信息,具有非常重要的意义。
下面结合具体实施例、对比例和附图,对本发明作进一步说明。
实施例1
一种pH荧光探针,包括聚氨酯载体和包裹于聚氨酯载体内的pH荧光染料,所述pH荧光染料包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的尼罗红溶液。
该pH荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)pH敏感性蛋白溶液的制备:称取蛋白质(BSA)500mg置于15mL离心管中,并溶于10mL双蒸水中,上下倒置使其充分溶解;静置,除去气泡;吸取配好的BSA溶液8mL置于烧杯中,于室温下中速搅拌,往里面逐滴滴加16mL75%的乙醇;往上述溶液中滴加200μL8%的戊二醛(w:w%),避光,中速搅拌交联18h;将得到的BSA溶液在3500rpm离心15min,除去沉淀杂质,得到pH敏感性蛋白溶液;
(2)pH荧光染料制备:将尼罗红溶于丙酮中,配制成浓度为0.1mg/mL的溶液;取5mL上述pH敏感性蛋白溶液添加100uL尼罗红溶液(体积比50:1),保持转速适中,搅拌3h,得到pH荧光染料;
(3)负载荧光染料的聚氨酯微球的制备:取一定质量的聚氨酯颗粒溶于甲苯溶液使浓度为0.1g/mL(m/v),溶解均匀后按体积比1:10的比例加入上述pH荧光染料,用涡旋仪混匀;取1mL所得聚氨酯溶液滴加到30mL含1%的吐温20的ddH2O中,在600rpm下搅拌3h,用去离子水洗涤3次,避光保存,得到负载荧光染料的聚氨酯微球,即pH荧光探针。
图1显示了步骤(1)得到的变性蛋白的荧光光谱图,蛋白被成功变性,使之出现荧光;图2显示了步骤(2)得到的pH荧光染料的荧光光谱图;图3显示了步骤(3)得到的负载荧光染料的聚氨酯微球的形貌图。
应用实施例,上述pH荧光探针对不同pH环境的响应:
分别取1mL去离子水置于24孔板的4个孔中,用1%的盐酸和0.1M的氢氧化钠溶液调节去离子水的pH值,用pH计测试,分别使之呈pH6、7、8、9。分别往孔里加入10μL上述pH荧光探针,静置10分钟后拍摄荧光图片,得出比率荧光图如图4所示。
实施例2
一种pH荧光探针,包括聚氨酯载体和包裹于聚氨酯载体内的pH荧光染料,所述荧光染料包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的尼罗红溶液。
该pH荧光探针的制备方法,与实施例1的区别在于步骤(1)pH敏感性蛋白溶液的制备。
本实施例中,(1)pH敏感性蛋白溶液的制备:称取蛋白质(BSA)500mg置于15mL离心管中,并溶于10mL双蒸水中,上下倒置使其充分溶解;静置,除去气泡;吸取配好的BSA溶液8mL置于烧杯中,于室温下中速搅拌,往里面逐滴滴加16mL丙酮;往上述溶液中滴加200μL8%的戊二醛(w:w%),避光,中速搅拌交联18h;将得到的BSA溶液在3500rpm离心15min,除去沉淀杂质,得到pH敏感性蛋白溶液;
步骤(2)和(3)与实施例1相同。
图5显示了本实施例步骤(1)得到的变性蛋白的荧光光谱图,说明丙酮亦可使蛋白成功变性,使之出现荧光。
实施例3
一种pH荧光探针,包括聚氨酯载体和包裹于聚氨酯载体内的pH荧光染料,所述pH荧光染料包括pH敏感性蛋白溶液和对pH不敏感的荧光素溶液,其中的荧光素为罗丹明B。
该pH荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)pH敏感性蛋白溶液的制备:称取蛋白质(BSA)400mg置于15mL离心管中,并溶于12mL双蒸水中,上下倒置使其充分溶解;静置,除去气泡;吸取配好的BSA溶液8mL置于烧杯中,于室温下中速搅拌,往里面逐滴滴加20mL75%的乙醇;往上述溶液中滴加240μL8%的戊二醛(w:w%),避光,中速搅拌交联20h;将得到的BSA溶液在4000rpm离心10min,除去沉淀杂质,得到pH敏感性蛋白溶液;
(2)pH荧光染料制备:将罗丹明B溶于去离子水中,配制成浓度为0.1mg/mL的溶液;取5mL上述pH敏感性蛋白溶液添加100uL罗丹明B溶液(体积比50:1),保持转速适中,搅拌3h,得到pH荧光染料;
(3)负载荧光染料的聚氨酯微球的制备:取一定质量的聚氨酯颗粒溶于甲苯溶液使浓度为0.15g/mL(m/v),溶解均匀后按体积比1:12的比例加入上述荧光染料,用涡旋仪混匀;取1mL所得聚氨酯溶液滴加到30mL含1%的吐温20的ddH2O中,在500rpm下搅拌4h,用去离子水洗涤3次,避光保存,得到负载荧光染料的聚氨酯微球,即pH荧光探针。
图6显示了本实施例步骤(2)得到的pH荧光染料的荧光光谱图。
实施例4
一种pH荧光探针,包括聚氨酯载体和包裹于聚氨酯载体内的pH荧光染料,所述pH荧光染料包括对pH敏感的蛋白溶液和对pH不敏感的尼罗红溶液。
该pH荧光探针的制备方法,与实施例1的区别主要在于步骤(3)负载荧光染料的聚氨酯微球的制备方法不同,本实施例采用静电喷雾法;
(1)pH敏感性蛋白溶液的制备:称取蛋白质(BSA)600mg置于15mL离心管中,并溶于10mL双蒸水中,上下倒置使其充分溶解;静置,除去气泡;吸取配好的BSA溶液10mL置于烧杯中,于室温下中速搅拌,往里面逐滴滴加20mL75%的乙醇;往上述溶液中滴加300μL8%的戊二醛(w:w%),避光,中速搅拌交联20h;将得到的BSA溶液在3000rpm离心25min,除去沉淀杂质,得到pH敏感性蛋白溶液;
(2)pH荧光染料制备:将尼罗红溶于丙酮中,配制成浓度为0.15mg/mL的溶液;取5mL上述pH敏感性蛋白溶液添加100uL尼罗红溶液(体积比50:1),保持转速适中,搅拌3.5h,得到pH荧光染料;
(3)负载荧光染料的聚氨酯微球的制备:取一定质量的聚氨酯颗粒溶于甲苯溶液使浓度为0.1g/mL(m/v),溶解均匀后按体积比1:10的比例加入上述荧光染料,用涡旋仪混匀。采用静电喷雾技术制备PU微球,具体条件为:保持电压为14KV,推进速度为0.5mL/h,接收距离为5cm,接收液为ddH2O;静置30min,然后离心,用蒸馏水洗涤数次,(至于光学显微镜下观察,拍照)然后避光保存,得到负载荧光染料的聚氨酯微球,即pH荧光探针。
图7显示了本实施例步骤(3)得到的负载荧光染料的聚氨酯微球的形貌图。
实施例5
一种pH荧光探针,包括聚氨酯载体和包裹于聚氨酯载体内的pH荧光染料,所述pH荧光染料包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的尼罗红溶液。
该pH荧光探针的制备方法,与实施例1的区别主要在于步骤(3)中搅拌速度的改变;
本实施例中,(3)负载荧光染料的聚氨酯微球的制备:取一定质量的聚氨酯颗粒溶于甲苯溶液使浓度为0.1g/mL(m/v),溶解均匀后按体积比1:10的比例加入上述荧光染料,用涡旋仪混匀;取1mL所得聚氨酯溶液滴加到30mL含1%的吐温20的ddH2O中,在200rpm下搅拌3h,用去离子水洗涤3次,避光保存,得到负载荧光染料的聚氨酯微球,即pH荧光探针;
步骤(1)和(2)与实施例1相同。
图8显示了本实施例步骤(3)得到的负载荧光染料的聚氨酯微球的形貌图,从图8和图3的对比可以看出,改变搅拌速度可得到不同粒径的微球,搅拌速度越大,粒径越小。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种pH荧光染料,其特征在于,包括pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液;
所述pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液的体积比为40~60:1;
所述pH敏感性蛋白包括牛血清蛋白、人血清蛋白、酪蛋白和乳球蛋白中的至少一种;
采用低碳醇变性、丙酮变性、加热变性、加入重金属盐变性、加入SDS变性或加入尿素变性的方式对蛋白质进行变性,得到pH敏感性蛋白;
所述低碳醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和乙二醇中的至少一种;
所述参比pH敏感的荧光染料包括尼罗红、荧光素、菁染料和苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物中的至少一种。
2.权利要求1所述的pH荧光染料的制备方法,其特征在于,将pH敏感性蛋白溶液和参比pH敏感的荧光染料溶液混合均匀,得到所述pH荧光染料。
3.根据权利要求2所述的pH荧光染料的制备方法,其特征在于,采用乙醇变性的方式对蛋白质进行变性,包括:
将蛋白质溶于水中,除去气泡;然后在搅拌下向其中逐滴加入质量分数为70~80%的乙醇,得到溶液A;
向溶液A中滴加质量分数为6~10%的交联剂,避光,搅拌交联15~20h;然后离心,分离,得到蛋白溶液;
每400~600mg蛋白质溶于8~12mL水中,乙醇的加入量为12~30mL,交联剂的加入量为150~300μL;
所述交联剂包括戊二醛、乙二醛和乙醇醛中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的pH荧光染料的制备方法,其特征在于,
所述荧光素包括异硫氰酸荧光素、羧基荧光素及其衍生物中的一种或多种;和/或,所述菁染料包括菁染料Cy3、菁染料Cy5和菁染料Cy7中的一种或多种;和/或,所述苯并氧杂蔥类化合物及其衍生物包括1,2-二氨基蒽醌、硝基苯并氧杂恶二唑和二苯基蒽系列中的一种或多种;
所述参比pH敏感的荧光染料的浓度为0.05~0.2mg/mL。
5.权利要求1所述的pH荧光染料在荧光探针中的应用;
所述荧光探针为pH荧光探针。
6.一种pH荧光探针,其特征在于,包括载体以及包裹于所述载体中的权利要求1所述的pH荧光染料;所述pH荧光探针为微米级的pH荧光探针。
7.根据权利要求6所述的pH荧光探针,其特征在于,所述载体包括聚氨酯、环氧树脂、聚苯乙烯和聚酰胺中的至少一种;
所述微米级的pH荧光探针的粒径为1~500μm;
所述载体的粒径为1~500μm;
所述载体和所述pH荧光染料的质量比为500:1~100:1。
8.权利要求6或7所述的pH荧光探针的制备方法,其特征在于,将载体溶液与pH荧光染料混合均匀,得到混合溶液;
将所述混合溶液滴加到含有表面活性剂的水中,混合均匀,得到所述pH荧光探针;
所述载体溶液的浓度为0.08~0.2g/mL;和/或,所述载体溶液与所述pH荧光染料的体积比为1:8~15;
载体的制备方法包括自乳化-固化法、静电喷雾法、微流控法和离子凝聚法中的任意一种;
载体为聚氨酯微球,采用自乳化-固化法制备聚氨酯微球包括:将聚氨酯溶液作为油相滴加到水相中,混合,溶剂挥发使得聚氨酯自固化成球,其中,聚氨酯溶液的浓度为5%~10%,搅拌的速度优选为200~800rpm;
所述表面活性剂包括吐温20和/或吐温80。
9.权利要求1所述的pH荧光染料和权利要求6或7所述的pH荧光探针在生物成像检测、pH值检测或细胞微环境检测中的应用。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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