CN108888628A - 一种人参皂苷GRh2在制备抗弓形虫复方制剂中的应用及其药物 - Google Patents
一种人参皂苷GRh2在制备抗弓形虫复方制剂中的应用及其药物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物领域,本发明提供了人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病药物中的应用,GRh2单独作为有效成分即可有效抑制弓形虫增殖,改善感染小鼠的临床表现。GRh2通过TLR4信号通路抑制小胶质细胞的激活,抑制炎症因子的过度表达,对宿主具有一定的保护作用。体外药效试验表明,GRh2的细胞毒性小,在安全剂量下对弓形虫增殖抑制作用与磺胺嘧啶无显著差异;能够显著延长弓形虫感染宿主的存活率,并且与磺胺嘧啶相比保护作用有显著提高;能够减少弓形虫数量,感染细胞的生长状态几乎接近正常细胞,能够有效地保护弓形虫宿主细胞形态的完整性。本发明还提供了人参皂苷GRh2在制备弓形虫疫苗中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域,具体涉及一种人参皂苷GRh2在制备抗弓形虫复方制剂中的应用,以及包含人参皂苷GRh2的抗弓形虫复方制剂。
背景技术
弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性的细胞内寄生原虫,可感染包括人类在内的几乎所有温血动物,引起人畜共患病弓形虫病。弓形虫病呈世界性分布且感染较为严重,据调查统计,全球感染弓形虫病人口数高达1/3(Louis MW,JitenderPD.Toxoplasmosis:ahistory ofclinical observations[J].Int JParasitol.2009,39(8):895-901.;SandraKH,Louis MW.TOXOPLASMOSIS[J].HandbClinNeurol.2013,114:125-145.)。
根据第二次全国人体重要寄生虫病现状调查分析,我国人体感染弓形虫病的血清阳性率达到7.88%,较二十世纪九十年代上升了45.2%(许隆祺,陈颖丹,孙凤华,等.全国人体重要寄生虫病现状调查报告[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2005,23(5):332-339.),家禽及兽类感染弓形虫情况更为严重,广东的鸡弓形虫感染率最高的达到20.3%(刘容珍,陈志清,张创峰,等.广东部分地区鸡弓形虫感染的血清学调查[J].养禽与禽病防治.2013,3:7-9.),我国东北部分地区散养鸡弓形虫感染率在61.04%以上,虎的血清阳性率为25.26%(朱积宝.东北部分地区鸡和动物园内虎弓形虫感染的血清学调查[D].吉林:吉林大学,2008.)。吉林省猪弓形虫PCR检测阳性率为30.0%,牛阳性率为12.8%(Ge W,SunH,Wang Z,et al.Prevalence and genotype ofToxoplasma gondii infection incattle from Jilin Province,northeastern China[J].VectorBorne ZoonoticDis.2014,14(6):399-402.;郑斌,李金娜.国内猪、牛和鸡弓形虫感染情况及危险因素研究进展[J].中国动物检疫.2016,33(3):67-70.),重庆市猪弓形虫感染阳性率有的高达71.9%(徐斌,张夏兰,曾政,等.重庆地区猪弓形虫病的血清学调查与分析[J].中国兽医科学.2013,43(1):98-102.),新疆牛弓形虫血清阳性率最高的达到46.4%(王为升,张金生,陈伟,等.石河子地区人畜弓形虫感染的血清学调查[J].动物医学进展.2011,32(2):120-122.)。杭州市HIV/AIDS、恶性肿瘤患者和孕妇血清抗弓形虫抗体阳性率分别为31%、30%和21%,均显著高于健康对照者的5%(许汝槿,夏建萍,黄建锋,等.杭州市高危人群弓形虫感染血清流行病学调查[J].中国血吸虫病防治杂志.2017,29(6):756-760.)。
其中,孕妇感染弓形虫后通过胎盘可垂直传播给胎儿产生新生儿先天性弓形虫病,造成胎儿致畸甚至死亡,严重影响人口质量,威胁人类健康发展(Bollani L,StrocchioL,Stronati M.Congenital toxoplasmosis[J].Early Human Development.2013,89(8):70-72.)。同时,弓形虫感染与恶性肿瘤、器官移植、免疫功能低下及长期应用免疫抑制剂者有关(沈继龙,王林.弓形虫的基因型及其主要效应分子的致病机制[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2015,33(6):429-435.)。当机体免疫功能低下时,如艾滋病患者、长期接受免疫抑制治疗以及器官移植患者等,潜伏在体内的包囊破裂,虫体释放并快速增殖,引起急性弓形虫病。弓形虫脑炎是艾滋病患者死亡的重要并发感染因素之一。因此,对弓形虫病的防治日益被世界各地广泛关注。
目前,国际公认的治疗弓形虫病的首选药物为磺胺嘧啶、乙胺嘧啶及其联合用药,但其具有包括强烈的肝肾毒性、消化机能紊乱、免疫器官的出血及萎缩、多发性肠炎、泌尿系统的损伤等诸多毒副作用,具有不良反应多且停药易复发等明显缺点(曾艳波,朱顺海,韩红玉,等.抗急性弓形虫病药物疗效的研究[J].中国人兽共患病学报.2011,27(4):316-319.;郝增坤.磺胺氯吡嗪钠-二甲氧苄啶溶液在鸡的残留消除研究[D].扬州大学,2012.),因此,找寻高效、低毒的治疗弓形虫病的药物是十分必要的。
五加科植物人参是我国传统的名贵中草药,《神农本草经》将人参列为上品,素有“百草药王”的美誉。人参作为药食同源之物,传统中医学认为其具有大补元气、补脾益肺、生津、安神益智之功效。人参皂苷是人参中提取的主要有效活性成分,约占4%,按化学性质可分为:人参皂苷二醇型(A型),人参皂苷三醇型(B型),齐墩果酸型(C型)。人参中二醇型皂苷较三醇型皂苷含量高,而人参皂苷GRh2属于人参皂苷二醇型,且为红参中特有成分,其化学包括20(S)-原人参二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、20(R)-原人参二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,主要区别在于C-20构型存在S型、R型两种差向异构(徐光,阮征,白景,等.人参皂苷Rh2的C-20构型确证[J].中国现代医生.2013,51(14):50-52+55.)。现代药理研究表明,人参皂苷具有双相免疫调节作用,能改善实验动物的非特异性免疫和特异性免疫功能,用于治疗免疫系统紊乱疾病,如抗肿瘤、增强免疫、抗过敏、抗炎、耐缺氧和抑制肥胖等作用(徐文,曾辉,杨远荣.人参皂苷Rh2的药理活性研究进展[J].中国医药导报.2017,14(28):42-45.;程汝滨,葛宇清,黄真.人参皂苷Rh2抗肿瘤转移的功能研究进展[J].中南药学.2017,14(28):211-213.;Cao M,Zhang J,Zhao Y,et al.Advances in Ginsenoside Rh2and ItsDerivatives[J].World Science and Technology.2012,14(6):2205-2211.;魏东升.人参皂苷Rh2抗心肌缺血作用及其机制[D].内蒙古民族大学,2015.)。
发明内容
本发明为了解决现有技术中弓形虫病防治药物效率低、毒性高的问题,提供了一种人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病尤其是抗弓形虫脑炎的药物中的应用,人参皂苷GRh2具有较好的弓形虫抑制作用,对于弓形虫感染宿主具有保护作用,并且在有效剂量下基本无毒副作用。
为了解决上述问题,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病的药物中的应用。
优选的,所述弓形虫病为弓形虫脑炎。
优选的,所述防治弓形虫病的药物为抑制弓形虫增殖的药物。
优选的,所述防治弓形虫病的药物为保护弓形虫感染宿主的药物。
本发明还提供了一种人参皂苷GRh2在制备弓形虫免疫疫苗的应用,所述人参皂苷GRh2在疫苗中为免疫佐剂。
优选的,所述人参皂苷GRh2包括20(S)-GRh2和20(R)-GRh2中的一种或两种。
本发明提供了一种抗弓形虫复方制剂,包括人参皂苷GRh2和药用辅料。
优选的,所述抗弓形虫复方制剂中,人参皂苷GRh2作为抗弓形虫药物的有效成分时,其对小鼠的用量范围为10mg/kg/d~150mg/kg/d,更优选为50mg/kg/d~100mg/kg/d;其对人的用量范围为1mg/kg/d~15mg/kg/d,更优选为5mg/kg/d~10mg/kg/d。
优选的,所述药用辅料包括药用载体、稀释剂、佐剂和赋形剂中的一种或多种。
优选的,所述抗弓形虫复方制剂的剂型选自颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、口服液、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、搽剂、膏剂、乳剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、栓剂、丸剂、微球制剂或酊剂。
本发明提供了一种弓形虫免疫疫苗,包括弓形虫的免疫疫苗和人参皂苷GRh2。
与现有技术相比,本发明提供的技术方案具有以下优点:
本发明提供了人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病的药物中的应用,人参皂苷GRh2单独作为有效成分即可有效抑制弓形虫增殖,延长弓形虫感染的宿主生存时间,对宿主具有一定的保护作用。
体外药效试验表明,人参皂苷GRh2的细胞毒性小,在安全剂量下对弓形虫增殖抑制作用与磺胺嘧啶无显著差异;能够显著延长弓形虫感染宿主的存活率,并且与磺胺嘧啶相比保护作用有显著提高;能够减少弓形虫数量,感染细胞的生长状态几乎接近正常细胞,能够有效地保护弓形虫宿主细胞形态的完整性;GRh2能够有效抑制弓形虫感染引起小胶质细胞特异性标记物Iba-1及TLR4的高表达。体内药效试验表明,人参皂苷GRh2能够减少弓形虫感染小鼠腹腔及脑中弓形虫数量,抑制弓形虫感染引起Iba-1及TLR4的高表达,抑制炎症因子的产生,能够有效地保护弓形虫感染的宿主。
本发明还提供了人参皂苷GRh2在制备弓形虫免疫疫苗的应用,所述人参皂苷GRh2在疫苗中为佐剂。本发明研究表明人参皂苷GRh2具有显著的弓形虫宿主保护作用,还具有提高宿主免疫力的作用,可以作为弓形虫免疫疫苗的佐剂使用,用于增强弓形虫免疫疫苗的免疫效果。
附图说明
图1为光学显微镜下观察不同处理对细胞形态的影响;
图2为不同处理对弓形虫特异性蛋白T.gondii及特异性基因SAG1mRNA表达水平的影响;
图3为不同处理对BV2细胞中Iba-1及TLR4蛋白表达水平的影响;
图4为不同处理对BV2细胞中iNOS、IFN-γ及TNF-α蛋白表达水平的影响;
图5为不同处理对脑组织中弓形虫数量的影响;
图6为不同处理对脑组织Iba-1及TLR4蛋白表达水平的影响;
图7为不同处理对脑组织中iNOS、IFN-γ及TNF-α蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病的药物中的应用。本发明优选的,所述弓形虫病为弓形虫脑炎。
在本发明中,所述人参皂苷GRh2可以单独作为有效物质,也可以与其他具有防治弓形虫病的药物联用。
在本发明中,所述人参皂苷GRh2优选的制备为抑制弓形虫增殖的药物。体外药效试验表明,人参皂苷GRh2单独使用时,在安全剂量下的抗弓形虫作用与常规药物磺胺嘧啶无显著差异。试验表明,人参皂苷GRh2对弓形虫特异性蛋白T.gondii以及特异性基因SAG1的表达有显著抑制作用。体内药效试验表明,与感染组相比施用了人参皂苷GRh2进行治疗的宿主腹腔及脑中弓形虫数量显著降低,表明人参皂苷GRh2具有较好的抗弓形虫作用。
在本发明中,所述人参皂苷GRh2优选的制备为保护弓形虫宿主的药物。药效试验表明,人参皂苷GRh2单独使用时,在安全剂量下能够显著延长感染弓形虫宿主细胞的存活率,比磺胺嘧啶的保护作用更优,能够有效地防止宿主细胞形态发生变化。试验表明,人参皂苷GRh2能够减少宿主中毒性分子NO(一氧化氮)含量,还能够有效抑制炎症因子iNOS(一氧化氮合酶)、INF-γ(干扰素-γ)以及TNF-α(肿瘤坏死因子-α)蛋白表达水平,能够抑制Iba-1(小胶质细胞特异性标记物)的激活,下调TLR4(Toll-样受体4)的表达,对宿主具有显著的保护作用。
本发明研究表明,人参皂苷GRh2能够有效地抑制细胞内弓形虫增殖;抑制脑内弓形虫数,干预TLR4信号通路激活,抑制小胶质细胞激活减少炎症因子的大量产生,从而对脑神经细胞具有保护作用,有望成为抗弓形虫尤其是抗弓形虫脑炎的候补药。
本发明还提供了一种人参皂苷GRh2在制备弓形虫免疫疫苗中的应用;所述一种人参皂苷GRh2作为佐剂。佐剂是指能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。本发明所述的人参皂苷GRh2能够有效地保护宿主细胞,增强宿主细胞免疫功能,能够提高弓形虫免疫疫苗的免疫效果。
本发明对所述弓形虫免疫疫苗本身无特殊限定,将人参皂苷GRh2与本领域已知的弓形虫免疫疫苗结合即可,人参皂苷GRh2在疫苗中起到增强免疫作用。
在本发明中,前述技术方案以及上述技术方案所述应用中涉及的人参皂苷GRh2优选的包括20(S)-GRh2和20(R)-GRh2中的一种或两种,结构式如下:
在本发明中,采用20(S)-GRh2和20(R)-GRh2任一结构或者二者任意比例组合均可产生有效的弓形虫病防治作用或免疫疫苗中的增强剂作用。
在本发明中,所述人参皂苷GRh2的物质纯度在98%以上。本发明对于所述人参皂苷GRh2的来源无特殊限定,采用满足上述纯度的原料即可。
本发明提供了一种抗弓形虫复方制剂,包括人参皂苷GRh2和药用辅料。本发明所述抗弓形虫复方制剂中,以人参皂苷GRh2作为有效活性成分;更优选的,可以以人参皂苷GRh2作为唯一有效活性成分。
本发明优选的,所述抗弓形虫复方制剂中人参皂苷GRh2作为抗弓形虫药物的有效成分时,其对小鼠的用量范围为10mg/kg/d~150mg/kg/d,更优选为50mg/kg/d~100mg/kg/d;其对人的用量范围为1mg/kg/d~15mg/kg/d,更优选为5mg/kg/d~10mg/kg/d。
在本发明中,所述药用辅料包括但不限于药用载体、稀释剂、佐剂和赋形剂中的一种或多种。
在本发明中,所述药用载体包括但不限于脂质体、醇质体、聚合物胶束、纳米结构脂质载体、固体脂质纳米载体和介孔二氧化硅纳米粒等。
在本发明中,所述稀释剂、佐剂和赋形剂等药物辅料具体的可以包括药用防腐剂、抗氧化剂、填料、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂、等渗和吸收延缓剂中的一种或多种。
本发明优选的,所述崩解剂包括但不限于干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、泡腾崩解剂和交联羧甲基纤维素钠中的一种或多种。
本发明优选的,所述填充剂包括但不限于微晶纤维素、预胶化淀粉、羟丙纤维素和聚乙二醇中的一种或多种。
本发明优选的,所述稀释剂包括但不限于乳糖、淀粉、糊精、无机盐类稀释剂以及甘露醇中的一种或多种。
本发明优选的,所述粘合剂包括但不限于乙醇、糖浆、淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素衍生物、胶浆以及糊精中的一种或多种。
在本发明中,所述抗弓形虫复方制剂的剂型包括但不限于颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、口服液、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、搽剂、膏剂、乳剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、栓剂、丸剂、微球制剂、酊剂、缓释制剂、控释制剂或靶向制剂。
本发明根据抗弓形虫复方制剂的剂型不同具体确定选用的药用辅料及其用量、制备方法,对此无特殊限定。
本发明还提供了一种弓形虫免疫疫苗,包括人参皂苷GRh2和弓形虫的免疫疫苗。所述人参皂苷GRh2在免疫疫苗中作为佐剂使用,用于增强免疫效果,提高宿主免疫能力,获得的所述弓形虫免疫疫苗免疫作用更好,预防弓形虫感染的效果更佳。
在本发明中,所述弓形虫免疫疫苗还可以包括疫苗中可接受的药用辅料,本发明对此无特殊限定。
在本发明中,当本发明所述人参皂苷GRh2作为弓形虫免疫疫苗的佐剂使用时,其在弓形虫免疫疫苗中的浓度优选为10mg/kg/d~150mg/kg/d,更优选为20mg/kg/d~50mg/kg/d。
为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1GRh2抗弓形虫感染及对宿主的保护作用
1实验材料
1.1实验药物
(S型)人参皂苷GRh2(上海源叶生物科技有限公司,批号:HA0408XB14,HPLC≥98%);(R型)人参皂苷GRh2(上海源叶生物科技有限公司,批号:Z14S63238,HPLC≥98%);阳性对照药:磺胺嘧啶(SD)(SIGMA-ALORICH,CAS:68-35-9,35033-100mg)、磺胺嘧啶钠(SD-Na)(Aladdin Industrial Corporation,CAS:68-35-9,35033-100mg)。
1.2实验材料
弓形虫:国际标准强毒株刚地弓形虫RH株(ATCC);SPF级Balb/c雌性小鼠50只,体重(20±2)g(辽宁长生生物技术有限公司);BV2细胞(ATCC);
DMEM培养基(Gibco),胎牛血清FBS(Gibco);二甲基亚砜DMSO(Sigma);MTT(Sigma);RIPA高效裂解液(Solarbio);PMSF(碧云天),BCA蛋白定量试剂盒(BestBio);Anti-Toxoplasma gondii(CST);Toll-Like Respector4(TLR4)(CST);TNF-α(CST);β-actin(CST);Iba-1(Abcam);iNOS(Abcam);IFN-γ(Abcam);Alexa 488goat anti-tabbit IgG(H+L)(Invitrogen);ECL发光液(Millipore); Super总RNA提取试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司);Transcription frist strand cDNA synthesis kit(Roche生物科技公司);SAG1引物合成(Invitrogen);GAPDH引物合成(Invitrogen)。
1.3实验仪器
Multiskan GO全波长酶标仪(Thermo fisher);VORTEX-5漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器厂);光学显微镜(上海蔡康光学仪器与限公司);冷冻高速离心机(Thermofisher);跑胶转印系统(BIO-RAD);WD-9405B水平摇床(北京市六一仪器厂);LifeECO基因扩增仪(杭州博日科技有限公司);凝胶成像分析系统(UVTIEC)。
2实验方法
2.1体外药物毒性实验
小鼠小胶质细胞(BV2)细胞培养后收集,分为等量的六组,待细胞贴壁生长后给予不同浓度(S)GRh2、(R)GRh2(5、10、20、40及80μM)及阳性对照药物磺胺嘧啶SD(100μg/mL),剩余不加任何药物作为空白对照组,每组设置5个重复。
培养24h后倒置显微镜观察细胞生长情况。加入MTT工作液,终止反应后于酶标仪测定其OD值(λ=570nm),计算不同浓度的药物细胞的存活率。
2.2 GRh2体外抗弓形虫活性
BV2细胞培养后收集;收集感染了弓形虫的小鼠腹水,以血细胞计数器计算虫数。调整小鼠腹水的虫数浓度与细胞浓度比例为细胞:弓形虫RH=1:5,分为等量的3组,每组3个重复。设置不添加弓形虫RH的BV2细胞作为正常组。
其中,除正常组外的其余组感染弓形虫速殖子后以下列组别加药:
阴性对照即正常组(DMSO)、感染未治疗组组(DMSO)、感染加治疗组((S)GRh2,20μM)、((R)GRh2,80μM)、阳性对照组(磺胺嘧啶SD,100μg/mL),后续未注明S或R构型的GRh2均为(S)GRh2。
将各组置于37℃,5%CO2环境下培养36h后收集细胞上清液,以经典方法Griess法检测NO(一氧化氮)的含量,收集细胞以台盼蓝染色,显微镜观察弓形虫着色率及细胞的形态变化情况。
2.3 WesternBlot及RT-PCR方法检测GRh2抗弓形虫活性
BV2细胞培养后收集,感染与给药方式同2.2节。给予2.1节确定的安全剂量最大值浓度的GRh2对感染弓形虫的BV2细胞进行治疗。
治疗36小时后收集细胞沉淀,以蛋白免疫印迹方法检测弓形虫特异性蛋白(T.gondii)的表达;提取RNA,检测弓形虫特异性基因SAG1的mRNA表达。
2.4 Western Blot方法检测GRh2对炎症因子(iNOS、IFN-γ及TNF-α)小胶质细胞标记蛋白(Iba-1)及Toll样受体4(TLR4)蛋白表达的影响
BV2细胞培养后收集,感染与给药方式同前,治疗36小时后收集细胞沉淀,以蛋白免疫印迹方法检测iNOS、IFN-γ、TNF-α、Iba-1及TLR4的表达。
2.5 GRh2体内抗弓形虫活性
选用50只18-22g健康Balb/c雌性小鼠每组10只随机分组,除正常组外每只小鼠腹腔注射感染弓形虫速殖子1×104个/0.2mL,4小时充分感染后以下列组别灌胃给药:
感染组未治疗组(水)、感染加治疗组((S)GRh2,100mg/kg),((R)GRh2,100mg/kg)、阳性对照组(磺胺嘧啶钠SD-Na,100mg/kg)连续口服灌胃给药4天,每天观察记录小鼠临床表现并打分,第4天处死小鼠,收集血液检测血清中NO的含量,收集腹水并记录腹水中的弓形虫数,取小鼠脑组织以QC-PCR方法检测小鼠脑中弓形虫数,以蛋白免疫印迹方法检测iNOS、IFN-γ、TNF-α、Iba-1及TLR4的表达。
2.6统计学分析
采用统计学分析软件SPSS17.0进行实验结果统计分析,计量数据以均数±标准偏差()表示,使用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Turkey’s多因素t检验进行各组间比较,P<0.05表明组间差异具有统计学意义。
3实验结果
3.1 GRh2的细胞毒性
如表1所示,GRh2对BV2细胞的生长抑制与给药浓度呈剂量依赖性。(S)GRh2浓度在5~20μM范围内对细胞活性无明显影响(P均>0.05),而当(S)GRh2浓度达到40μM时与正常组相比BV2细胞开始产生明显抑制作用,细胞存活率为82.04%,(R)GRh2浓度在10~80μM范围内对细胞活性无明显影响(P均>0.05),阳性对照药磺胺嘧啶SD于100μg/mL浓度时对细胞生长无影响。
表1 GRh2对BV2细胞的细胞毒性(n=9;)
注:与正常组相比,###P<0.001。
3.2 GRh2对弓形虫增殖率的影响
如表2所示,感染未治疗组(感染组)、(S)GRh2组及(R)GRh2组的弓形虫增殖率分别为98.04%、33.04%及36.48%,给药组与感染组相比弓形虫增殖率明显降低,差异显著,具有统计学意义(P<0.001)。结果表明,GRh2能够抑制体外弓形虫速殖子的增殖,有较好的抗弓形虫作用。
表2 GRh2对弓形虫速殖子增殖率的影响(n=9;)
注:与感染组相比,***P<0.001。
3.3 GRh2对弓形虫感染的BV2细胞存活率的影响
如表3所示,与正常组相比感染组细胞存活率仅为61.59%,给予(S)GRh2、(R)GRh2及阳性对照药磺胺嘧啶(SD)治疗后,细胞存活率分别达到88.15%、84.72%及69.65%,明显升高,差异显著,具有统计学意义(P<0.05;P<0.001)。结果表明,GRh2对弓形虫感染的细胞具有较好的保护作用,且效果优于SD。
表3 GRh2对弓形虫感染的BV2细胞存活率的影响(n=9;)
注:与正常组相比,###P<0.001;与感染组相比,*P<0.05,***P<0.001。
3.4 GRh2对细胞形态的影响
因(S)GRh2与(R)GRh2对弓形虫增殖率及宿主细胞存活率影响均无显著性差异(P>0.05),故选取(S)GRh2构型为例继续后续体外实验,且未注明S或R构型的GRh2均为(S)GRh2,简写为GRh2。
如图1所示,(a)为正常组,未感染弓形虫;(b)为感染组,感染了弓形虫的BV2细胞;(c)为GRh2组,采用GRh2对感染弓形虫的细胞进行治疗;(d)为SD组,即磺胺嘧啶对感染弓形虫的细胞进行治疗。
可以看出,感染组细胞形态明显改变,细胞呈现皱缩甚至破碎崩解,且细胞内外可见大量游动状态的月牙形弓形虫体。细胞经GRh2或SD治疗后,虫体数量明显减少,特别是GRh2组中细胞生长状态与正常组几乎无异。证明GRh2具有较好的抗弓形虫作用,且能保护宿主细胞形态的完整性。
3.5 GRh2对弓形虫特异性蛋白T.gondii及特异性基因SAG1表达的影响
如图2所示,为不同处理对弓形虫特异性蛋白T.gondii及特异性基因SAG1mRNA表达水平的影响;与正常组相比,感染组弓形虫特异性蛋白(T.gondii)及弓形虫特异性基因SAG1mRNA表达水平明显升高,具有统计学差异(P<0.001)。
给予GRh2及SD治疗后能有效抑制弓形虫感染的BV2细胞中弓形虫特异性蛋白T.gondii及弓形虫特异性基因SAG1mRNA的表达,具有统计学意义(P<0.001),证明GRh2具有较好的抗弓形虫作用。
3.6 GRh2对细胞上清中NO含量产生的影响
如表4所示,经弓形虫感染后细胞上清液中的NO含量为3.16μM,与正常组相比明显升高,具有统计学意义(P<0.01),给予GRh2及SD治疗后细胞上清液清中的NO的含量分别降至2.21μM及1.77μM,与感染组相比具有统计学差异(P<0.001),证明GRh2能够减少弓形虫感染细胞中毒性分子NO含量的产生。
表4 GRh2对弓形虫感染细胞上清中NO含量产生的影响(n=9;)
注:与正常组相比,##P<0.01;与感染组相比,***P<0.001。
3.7 GRh2对BV2细胞中Iba-1及TLR4蛋白表达水平的影响
如图3所示,GRh2对BV2细胞中Iba-1(a)及TLR4(b)蛋白表达水平的影响;与正常组相比,感染组Iba-1及TLR4的蛋白表达水平明显升高,差异显著,具有统计学意义(P<0.001),给予GRh2治疗后能有效抑制细胞中Iba-1及TLR4蛋白的表达,具有统计学意义(P<0.01;P<0.001),证明GRh2能够下调弓形虫感染BV2细胞中特异性小胶质细胞标记物Iba-1以及TLR4蛋白表达。
3.8 GRh2对BV2细胞中一氧化氮合酶(iNOS)、干扰素-γ(IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达水平的影响
如图4所示,为GRh2对BV2细胞中iNOS、IFN-γ及TNF-α蛋白表达水平的影响;与正常组相比,感染组炎症因子iNOS、IFN-γ及TNF-α的蛋白表达水平明显升高,差异显著,具有统计意义(P<0.001),给予GRh2治疗后能有效抑制细胞中iNOS、IFN-γ及TNF-α蛋白的表达,具有统计学意义(P<0.001),证明GRh2能够下调弓形虫感染细胞炎症因子iNOS、IFN-γ及TNF-α蛋白含量。
3.9 GRh2对小鼠临床表现打分的影响
作为急性弓形虫感染的指标,对出汗、耸毛,腹泻和小鼠活动状态等临床体征和症状进行评分(表5)。如表6所示,感染弓形虫第1~3天,感染组与各给药组均为0分,即小鼠无临床体征与症状变化,于第四天起,感染组小鼠临床评分为4.83分,经(S)GRh2、(R)GRh2及SD-Na治疗后,小鼠临床评分分别为3.16分、3.17分及0.50分,显著低于感染组,具有统计学意义(P<0.05;P<0.001)。结果表明,(S)GRh2、(R)GRh2治疗后能够显著降低弓形虫感染引起的小鼠临床体征恶化,对弓形虫感染小鼠具有保护作用。
表5弓形虫感染小鼠临床体征评分标准表
表6 GRh2对弓形虫感染小鼠临床表现情况打分表(n=10;)
注:与感染组相比,*P<0.05,***P<0.001。
3.10小鼠腹腔中弓形虫速殖子增殖率情况
因(S)GRh2与(R)GRh2对弓形虫感染小鼠临床体征及打分情况均无显著性差异(P>0.05),故选取(S)GRh2构型为例继续后续体内实验,且未注明S或R构型的GRh2均为(S)GRh2,简写为GRh2。
如表7所示,于第四天解剖后GRh2及SD-Na组小鼠腹腔中弓形虫速殖子明显减少,其增殖率分别为38.72%及4.66%,显著低于感染组,且有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。结果表明,GRh2能够抑制弓形虫感染小鼠腹腔中弓形虫的增殖。
表7 GRh2对小鼠腹腔中弓形虫速殖子增殖率的影响(n=10;)
注:与感染组相比,*P<0.05,**P<0.01。
3.11 GRh2对脑组织中弓形虫特异性基因SAG1表达的影响
如图5及表8所示,经弓形虫感染后小鼠脑中弓形虫为34.75个/μg gDNA,给予GRh2及SD-Na治疗后小鼠脑中弓形虫数为16.76个/μg gDNA及5.60个/μg gDNA,与感染组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.01;P<0.001),证明GRh2能够抑制弓形虫感染小鼠脑中弓形虫数。
表8 GRh2对脑组织中弓形虫特异性SAG1基因表达的影响(n=10;)
注:与感染组相比,**P<0.01,***P<0.001。
3.12 GRh2对血清中NO含量产生的影响
如表9所示,经弓形虫感染后小鼠血清中的NO含量为9.80μM,与正常组相比明显升高,具有统计学意义(P<0.01),给予GRh2及SD-Na治疗后小鼠血清中的NO的含量分别降至8.82μM及7.31μM,与感染组相比具有统计学差异(P<0.01),证明GRh2能够减少弓形虫感染小鼠血清中毒性分子NO含量的产生。
表9 GRh2对弓形虫感染小鼠血清中NO含量产生的影响(n=10;)
注:与正常组相比,##P<0.01;与感染组相比,**P<0.01。
3.13 GRh2对弓形虫感染小鼠脑中Iba-1及TLR4蛋白表达水平的影响
如图6所示,与正常组相比,感染组Iba-1及TLR4的蛋白表达水平明显升高,具有统计学差异(P<0.001),给予GRh2及SD-Na治疗后能有效抑制Iba-1及TLR4蛋白的表达,具有统计学意义(P<0.01;P<0.001),证明GRh2能够下调弓形虫感染小鼠脑中特异性小胶质细胞标记物Iba-1以及TLR4蛋白表达。
3.14 GRh2对脑组织中iNOS、IFN-γ及TNF-α蛋白表达水平的影响
如图7所示,与正常组相比,脑中感染组炎症因子iNOS、IFN-γ及TNF-α的蛋白表达水平明显升高,具有统计学差异(P<0.001),给予GRh2及SD-Na治疗后能有效抑制细胞中iNOS、IFN-γ及TNF-α蛋白的表达,具有统计学意义(P<0.05;P<0.01;P<0.001),证明GRh2能够下调弓形虫感染小鼠脑中炎症因子iNOS、IFN-γ及TNF-α蛋白含量。
综上所述,可得出以下结论:
1.本发明通过对人参皂苷GRh2进行体内体外实验,证明具有抑制体内外弓形虫速殖子增殖的作用。
2.本发明通过体外实验表明,人参皂苷GRh2具有提高弓形虫感染细胞的存活率,改善弓形虫感染细胞的形态维持细胞完整性的作用;体内实验中通过延长急性弓形虫感染小鼠存活时间,证明人参皂苷GRh2对弓形虫感染的细胞/宿主具有较好的保护作用。
3.本发明通过试验表明,人参皂苷GRh2通过减少弓形虫感染引起的神经毒性分子NO的释放及iNOS(诱导NO合成的关键酶)的表达,抑制TNF-α、IFN-γ的产生,降低Iba-1及TLR4蛋白的表达,证明GRh2是通过抑制小胶质细胞激活,干预弓形虫感染介导的TLR4信号通路抑制炎症反应达到对宿主的保护作用。
该结果提示本发明中的GRh2单体既可作为防治弓形虫病单方用药,也可作为组方药物中的一种进行联合干预用药提高抗弓形虫病的疗效,同时也可作为疫苗的佐剂增强弓形虫免疫预防疫苗,更大程度发挥抗弓形虫疗效及免疫效果。
实施例2 GRh2片剂的制备
原料及其用量:GRh25g、甘露醇30g、羧甲基纤维素钠2g和硬脂酸镁1g。
制备工艺:将各原料成分烘干、粉碎过筛100目筛预处理,将GRh2主药与甘露醇、羧甲基纤维素钠辅料混合,加入适量70%的乙醇制成软材,过14目筛制成颗粒,55℃鼓风干燥2小时,用16目和100目筛整粒,加入硬脂酸镁混匀,将混合物压成适当的尺寸和重量片剂,即得GRh2口服片剂。
实施例3 GRh2注射剂的制备
原料及其用量:GRh210g、PEG-4002.5L以及注射用生理盐水加至10L。
制备工艺:将处方量的PEG-400,加入GRh2,搅拌溶解,加注射用生理盐水使终体积为10L搅匀。取样测定pH值及含量,合格后0.22μm微孔滤膜过滤。无菌灌封即得GRh2注射剂。
实施例4 T.gondii HSP70蛋白-GRh2疫苗制备
取T.gondii HSP70蛋白0.1g、GRh21g、PEG-400适量以及注射用生理盐水加至1L。
制备工艺:将处方量的PEG-400,加入GRh2,搅拌溶解,再加入T.gondii HSP70蛋白充分混合均匀,加注射用生理盐水使终体积为1L搅匀。取样测定pH值及含量,合格后0.22μm微孔滤膜过滤。无菌灌封即得T.gondii HSP70蛋白-GRh2疫苗制剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病的药物中的应用,其特征在于,所述弓形虫病为弓形虫脑炎。
3.根据权利要求1所述人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病的药物中的应用,其特征在于,所述防治弓形虫病的药物为抑制弓形虫增殖的药物。
4.根据权利要求1所述人参皂苷GRh2在制备防治弓形虫病的药物中的应用,其特征在于,所述防治弓形虫病的药物为保护弓形虫感染宿主的药物。
5.人参皂苷GRh2在制备弓形虫免疫疫苗的应用,其特征在于,所述人参皂苷GRh2在疫苗中为免疫佐剂。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的应用,其特征在于,所述人参皂苷GRh2包括20(S)-GRh2和20(R)-GRh2中的一种或两种。
7.一种抗弓形虫复方制剂,其特征在于,包括人参皂苷GRh2和药用辅料。
8.根据权利要求6或7所述抗弓形虫复方制剂,其特征在于,所述药用辅料包括药用载体、稀释剂、佐剂和赋形剂中的一种或多种。
9.根据权利要求6或7所述抗弓形虫复方制剂,其特征在于,所述抗弓形虫复方制剂的剂型选自颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、口服液、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、搽剂、膏剂、乳剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、栓剂、丸剂、微球制剂或酊剂。
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