CN108883119A - 分离和检测氧化固醇的方法 - Google Patents

Abstract

提供用于测定固醇样品的纯度的分析方法。这些方法包括提供HPLC洗脱剂，其包括固醇、与所述固醇相关的其它化合物和移动挥发相；从所述HPLC洗脱剂中产生液滴的气溶胶；干燥所述液滴以获得所述固醇的残余颗粒；使所述固醇的残余颗粒与离子流接触，所述离子流将尺寸依赖性电荷施加到所述残余颗粒的每一个以产生电信号，并且测量所述电信号以测定所述样品中所述固醇的纯度。所述固醇可以是OXY133或OXY133单水合物。

Description

分离和检测氧化固醇的方法

背景技术

通常采用不同的生物物质来促进医学应用中的骨骼生长，包括骨折愈合和骨骼疾病(包括脊柱疾病)的手术管理。脊柱融合通常由类似于整形外科医生和神经外科医生的外科医生进行，以解决退行性椎间盘疾病和影响腰椎和颈椎的关节炎。历史上，通常从患者的髂嵴取出的自体骨骼移植已被用于增强椎骨层之间的融合。

一种成骨性并且通常用于促进脊柱融合的蛋白质是重组人类骨形态生成蛋白-2(rhBMP-2)。美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration)(FDA)已经批准其用于单层前路腰椎椎体间融合。从那时起，rhBMP-2的使用已显著增加，并且其使用的适应症已经扩展到包括后路腰椎脊柱融合以及颈椎融合。

氧化固醇形成存在于循环中以及人类和动物组织中的一大类胆固醇氧化衍生物。已发现氧化固醇存在于动脉粥样硬化病变中，并且在各种生理过程，例如细胞分化、炎症、细胞凋亡和类固醇产生中起作用。一些天然存在的氧化固醇具有稳定的成骨特性并且可以用于生长骨骼。天然存在的最有效的成骨性氧化固醇，即20(S)-羟基胆固醇当应用于能够分化成为成骨细胞和脂肪细胞的多能间充质细胞中时，具有成骨性和抗脂肪生成性。

一种这类氧化固醇是Oxy133或(3S,5S,6S,8R,9S,10R,13S,14S,17S)17-((S)-2-羟基辛-2-基)-10,13-二甲基十六氢-lH-环戊并[a]菲-3,6-二酚，其呈现以下结构：

Oxy133是一种合成的小分子，其促进哺乳动物的骨骼生长。目前，使用气相色谱(GC)和衍生化分析氧化固醇类化合物。这是一个漫长的过程，需要加热样品，并不是监管机构的首选。与高效液相色谱(HPLC)配对的目前可用的工业检测技术不稳定，或在相关杂质和降解的存在下不够敏感以检测Oxy133。

Oxy133分子缺乏发色团，使色谱不足。另外，与母体化合物密切相关的已知杂质难以通过如蒸发光散射(ELS)、折射率(RI)和质谱(MS)的技术检测。

需要评估纯度以确保OXY133的安全性和功效，并且通常通过应用HPLC/UV方法来实现。与HPLC配对的标准工业检测技术不稳定，或在相关杂质和降解的存在下不够敏感以检测OXY133。

当OXY133呈单水合物形式时，由于存在需要分离、定量和鉴定的相关杂质，例如非对映异构体，通常难以分析Oxy133单水合物。已知杂质与母体化合物密切相关，并且难以通过蒸发光散射(ELS)、折射率(RI)和质谱(MS)等技术检测。

因此，需要克服这些检测技术的缺点并且在需要验证ICH质量控制准则的分析方法发展(AMD)阶段期间提供用于测定含有作为关键路径活性的一部分的OXY133产物的样品的含量和纯度的可靠分析方法。测定OXY133样品的纯度的方法会是有益的，所述样品不依赖于样品中发色团的存在。可以检测非挥发性分析物或残余物的方法也是有益的。

发明内容

在一些实施例中，提供用于测定OXY133样品的纯度的测定方法，所述方法包含提供包括OXY133、OXY133杂质和移动挥发相的HPLC洗脱剂；从HPLC洗脱剂中产生液滴的气溶胶；干燥液滴，得到OXY133的残余颗粒；使OXY133残余颗粒与离子流接触，所述离子流对每个残余颗粒施加尺寸依赖性电荷，以产生电信号，所述电信号的水平与OXY133的带电残余颗粒的量成比例；并且测量电信号以测定样品中的OXY133的纯度。在若干实施例中，OXY133包含OXY133单水合物。

在各个方面，本发明的测定方法可用于分离OXY133单水合物与非对映异构体D1、非对映异构体D2或其它OXY133单水合物杂质(例如C₂₇H₄₆O₂二醇，其用于合成OXY133单水合物)。在各种实施例中，按组合物的总重量计，本公开的测定方法可检测约0.03％到约0.05％w/w或w/v的OXY133单水合物杂质。使用本公开的测定方法可以实现的OXY133峰和D1非对映异构体的分辨率可≥0.8。在许多实施例中，OXY133单水合物的检测极限为约0.01％或1ng。此外，通过使用本公开的测定方法可以实现的OXY133单水合物的纯度为至少96.9％。

在各种其它实施例中，提供分离OXY133单水合物与样品的方法，所述方法包含提供OXY133单水合物参考标准物；提供浓度相当于OXY133单水合物参考标准物的样品；通过HPLC-CAD测定参考标准物中OXY133单水合物的量；通过HPLC-CAD测定样品中OXY133单水合物的量；并且将样品中OXY133单水合物的量与参考标准物中OXY133单水合物的量进行比较。在一些实施例中，在本公开的方法中，参考标准物浓度以至少500μg/mL的量存在。在其它方面，样品在体积比为1:1的乙腈:四氢呋喃的溶液中制备。在再其它方面，样品包含来自HPLC-CAD的移动相，其为100％水或100％甲醇。

在一些实施例中，提供用于测定固醇样品的纯度的方法，所述方法包含：通过使有机金属化合物与孕烯醇酮或孕烯醇酮乙酸酯反应以形成固醇来制备固醇，所述固醇具有下式：

或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中R₁包含具有至少一个碳原子的脂肪族或环状取代基；使固醇经历HPLC以获得包含固醇、固醇杂质和挥发性移动相的洗脱剂；将HPLC洗脱剂装入CAD检测器中以测定固醇的纯度。在各种实施例中，固醇是OXY133，并且在其它实施例中，固醇是OXY133单水合物。

在一些实施例中，提供用于测定氧化固醇样品中纯度的方法，所述方法包含：通过使具有下式的二醇：

与硼烷和过氧化氢反应以形成具有下式的氧化固醇或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物来制备固醇：

其中R₁包含具有至少一个碳原子的脂肪族或环状取代基，并且

其中R₂包含具有至少一个碳原子的脂肪族或环状取代基；使氧化固醇经历HPLC，得到包含氧化固醇、氧化固醇杂质和挥发性移动相的洗脱剂；将HPLC洗脱剂装入CAD检测器中以测定氧化固醇的纯度。在各种实施例中，氧化固醇是OXY133单水合物。

在一些实施例中，提供用于测定氧化固醇样品的纯度的方法，所述方法包含通过使具有下式的二醇：

与硼烷化合物反应以形成具有下式的氧化固醇或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物来制备氧化固醇：

其中R₁包含具有至少一个碳原子的脂肪族或环状取代基，并且R₂包含具有至少一个碳原子的脂肪族或环状取代基；使氧化固醇经历HPLC，得到包含氧化固醇、氧化固醇杂质和挥发性移动相的洗脱剂；将HPLC洗脱剂装入CAD检测器中以测定氧化固醇的纯度。在各种实施例中，氧化固醇是OXY133单水合物。

在一些实施例中，提供用于测定氧化固醇样品的纯度的方法，所述方法包含使具有下式的二醇：

与硼烷、过氧化氢和四氢呋喃反应以形成具有下式的氧化固醇或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：

其中R₁包含具有至少一个碳原子的脂肪族或环状取代基，并且R₂包含具有至少一个碳原子的脂肪族或环状取代基；使氧化固醇经历HPLC，得到包含氧化固醇、氧化固醇杂质和挥发性移动相的洗脱剂；将HPLC洗脱剂装入CAD检测器中以测定氧化固醇的纯度。在各种实施例中，氧化固醇是OXY133单水合物。

以下说明将阐述各种实施例的额外特征和优点，并且这些特征和优点的一部分将在说明中显而易见，或者可以通过实践各种实施例习得。各种实施例的目的和其它优点将借助于具体地在说明和所附权利要求书中所指出的要素和组合来实现和获得。

附图说明

根据以下描述、所附权利要求书和附图，实施例的其它方面、特征、益处和优点将部分地显而易见，在附图中：

图1说明用于合成OXY133的逐步反应，其中起始反应物包含孕烯醇酮乙酸酯，如本公开的一个实施例中所示。使孕烯醇酮与有机金属化合物反应，以产生具有两个羟基的固醇或二醇。然后使固醇或二醇与硼烷和过氧化氢反应并且纯化以产生Oxy133；

图2是从分离和纯化的Oxy133获得的¹H NMR数据的图解说明；

图3是从Oxy133获得的¹³C NMR数据的图解说明；

图4是从Oxy133获得的红外线光谱数据的图解说明；

图5是从Oxy133获得的质谱数据的图解说明；

图6是从合成Oxy133的中间物固醇或二醇获得的¹H NMR数据的图解说明；

图7是从合成Oxy133的中间物固醇或二醇获得的¹³C NMR数据的图解说明。

图8是说明带电气溶胶检测器(CAD)如何工作的实施例的框图。

图9是线性光电二极管阵列检测器(PDA)迹线、195nm处的紫外线(UV)通道、质谱总离子色谱(MS TIC)和MS提取的质荷比(m/z)257.2264的图解说明。

图10是OXY133从0.50μg/mL到61μg/mL的线性度的图解说明。

图11是OXY133单水合物参考标准物在500μg/mL下的色谱图的图解说明。

图12是通过HPLC/CAD方法产生的OXY133的纯度曲线。

应理解，附图未按比例绘制。此外，图中对象之间的关系可以不按比例，并且实际上可能与尺寸具有相反的关系。附图旨在帮助理解和明晰所示每个对象的结构，并且因此，为了说明结构的具体特征，可夸大一些特征。

具体实施方式

出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另外指示，否则在本说明书和权利要求书中使用的表达成分的量、材料的百分比或比例、反应条件和其它数值的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非相反地指示，否则以下说明书和所附权利要求书中所阐述的数字参数是可能视试图通过本申请获得的所需特性而变化的近似值。最低限度地，并且不试图限制等效物原则应用于权利要求书的范围，至少应根据所报告的有效数字的数目并且通过应用一般四舍五入技术来解释每个数值参数。

尽管阐述本申请的广泛范围的数字范围和参数是近似值，但具体实例中所阐述的数值是尽可能精确地报告的。但是，任何数值固有地含有某些由其对应测试测量值中所发现的标准差必然造成的误差。此外，本文中所公开的所有范围都应理解为涵盖其中所包含的任何和所有子范围。举例来说，“1到10”的范围包括在最小值1与最大值10之间(并且包括端值)的任何和所有子范围，即，具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值的任何和所有子范围，例如，5.5到10。

定义

应注意，除非明确地且不含糊地限于一个指示物，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，例如，提及“烷醇胺”包括一种、两种、三种或更多种烷醇胺。

如本文所用的术语“生物活性剂”通常是指改变患者生理技能的任何物质。术语“生物活性剂”在本文中可与术语“治疗剂”、“治疗有效量”和“活性药物成分”、“API”或“药物”互换使用。应理解，除非另外指定，否则"药物"配制物可以包括多于一种治疗剂，其中示例性治疗剂的组合包括两种或更多种药物的组合。术语“药物”还意图指代“API”，无论其是呈粗混合物形式还是经纯化或经分离的。

术语“可生物降解”包括通过酶作用、通过水解作用和/或通过人体内的其它类似机制而随时间降解的化合物或组分。在各种实施例中，“可生物降解”包括随着细胞(例如骨细胞)渗入组分可在体内分解或降解成无毒组分并且使缺损得以修复的组分。“生物可侵蚀”意指化合物或组分将至少部分地由于接触周围组织中所见的物质、流体或通过细胞作用而随时间侵蚀或降解。“生物可吸收”意指化合物或组分将在人体内被例如细胞或组织分解和吸收。“生物相容性”意指化合物或组分不会在靶组织部位引起实质性组织刺激或坏死和/或不会致癌。

如本文所使用，术语“烷基”是指通过从母体烷烃、烯烃或炔烃的单个碳原子去除一个氢原子衍生的饱和或不饱和、支链、直链或环状单价烃基。典型烷基包括但不限于，甲基；乙基，如乙烷基、乙烯基、乙炔基；丙基，如丙-1-基、丙-2-基、环丙-1-基、丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、环丙-1-烯-1-基；环丙-2-烯-1-基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁基，如丁-1-基、丁-2-基、2-甲基-丙-1-基、2-甲基-丙-2-基、环丁-1-基、丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1,3-二烯-1-基、丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；以及其类似基团。在预期具体饱和水平的情况下，使用命名法“烯基”和/或“炔基”，如下所定义。在一些实施例中，烷基是(C1-C40)烷基。在一些实施例中，烷基是(C1-C6)烷基。

如本文所使用，术语“烷基”是指通过从母体烷烃的单个碳原子去除一个氢原子衍生的饱和支链、直链或环状烷基。典型烷基包括但不限于，甲烷基；乙烯基；丙烷基，如丙-1-基、丙-2-基(异丙基)、环丙-1-基等；丁烷基，如丁-1-基、丁-2-基(仲丁基)、2-甲基-丙-1-基(异丁基)、2-甲基-丙-2-基(叔丁基)、环丁-1-基等；以及其类似基团。在一些实施例中，烷基是(C1-C40)烷基。在一些实施例中，烷基是(C1-C6)烷基。

如本文所使用，术语“烯基”是指通过从母体烯烃的单个碳原子去除一个氢原子衍生的具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链、直链或环状烷基。所述基团可以关于一个或多个双键呈顺式构象或反式构象。典型烯基包括但不限于乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、丙-2-烯-2-基、环丙-1-烯-1-基；环丙-2-烯-1-基；丁烯基，如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1,3-二烯-1-基等；以及其类似基团。在一些实施例中，烯基是(C2-C40)烯基。在一些实施例中，烯基是(C2-C6)烯基。

如本文所使用，术语“炔基”是指通过从母体炔烃的单个碳原子去除一个氢原子衍生的具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链、直链或环状烷基。典型炔基包括但不限于，乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁炔基，如丁-1-炔-1-基、丁-3-炔-1-基等；以及其类似基团。在一些实施例中，炔基是(C2-C40)炔基。在一些实施例中，炔基是(C2-C6)炔基。

如本文所使用，术语“烷二基”是指通过从母体烷烃、烯烃或炔烃的两个不同碳原子中的每一个去除一个氢原子，或通过从母体烷烃、烯烃或炔烃的单个碳原子去除两个氢原子衍生的饱和或不饱和、支链、直链或环状二价烃基。所述两个单价基团中心或所述二价基团中心各自的价态可以与相同或不同原子形成键。典型烷二基包括但不限于甲烷二基；乙基二基，如乙烷-1,1-二基、乙烷-1,2-二基、乙烯-1,1-二基、乙烯-1,2-二基；丙基二基，如丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-2,2-二基、丙烷-1,3-二基、环丙烷-1,1-二基、环丙烷-1,2-二基、丙-1-烯-1,1-二基、丙-1-烯-1,2-二基、丙-2-烯-1,2-二基、丙-1-烯-1,3-二基环丙-1-烯-1,2-二基、环丙-2-烯-1,2-二基、环丙-2-烯-1,1-二基、丙-1-炔-1,3-二基等；丁基二基，如丁烷-1,1-二基、丁烷-1,2-二基、丁烷-1,3-二基、丁烷-1,4-二基、丁烷-2,2-二基、2-甲基-丙烷-1,1-二基、2-甲基-丙烷-1,2-二基、环丁烷-1,1-二基；环丁烷-1,2-二基、环丁烷-1,3-二基、丁-1-烯-1,1-二基、丁-1-烯-1,2-二基、丁-1-烯-1,3-二基、丁-1-烯-1,4-二基、2-甲基-丙-1-烯-1,1-二基、2-亚甲基-丙烷-1,1-二基、丁-1,3-二烯-1,1-二基、丁-1,3-二烯-1,3-二基、环丁-1-烯-1,2-二基、环丁-1-烯-1,3-二基、环丁-2-烯-1,2-二基、环丁-1,3-二烯-1,2-二基、环丁-1,3-二烯-1,3-二基、丁-1-炔-1,3-二基、丁-1-炔-1,4-二基、丁-1,3-二炔-1,4-二基等；以及其类似基团。在预期具体饱和水平的情况下，使用命名法烷二基、烯二基和/或炔二基。在一些实施例中，烷二基是(C1-C40)烷二基。在一些实施例中，烷二基是(C1-C6)烷二基。还涵盖基团中心在末端碳处的饱和非环状烷二基，例如甲烷二基(亚甲基)；乙烷-1,2-二基(亚乙基)；丙烷-1,3-二基(亚丙基)；丁烷-1,4-二基(亚丁基)；以及其类似基团(又称亚烷基(alkyleno)，定义如下)。

如本文所用，术语“亚烷基”是指通过从直链母体烷烃、烯烃或炔烃的两个末端碳原子中的每一个去除一个氢原子衍生的具有两个末端单价基团中心的直链烷二基。典型亚烷基包括但不限于亚甲基；亚乙基，如亚乙基、亚乙烯基(etheno)、亚乙炔基(ethyno)；亚丙基，如亚丙基、亚丙[1]烯基、亚丙[1,2]二烯基、亚丙[1]炔基等；亚丁基，如亚丁基、亚丁[1]烯基、亚丁[2]烯基、亚丁[1,3]二烯基、亚丁[1]炔基、亚丁[2]炔基、亚丁[1,3]二炔基等；以及其类似基团。在预期具体饱和水平的情况下，使用命名法亚烷基、亚烯基和/或亚炔基。在一些实施例中，亚烷基是(C1-C40)烷基。在一些实施例中，亚烷基是(C1-C6)烷基。

如本文所使用，术语“杂烷基(heteroalkyl)”、“杂烷基(heteroalkanyl)”、“杂烯基”、“杂烷基(heteroalkanyl)”、“杂烷二基”以及“亚杂烷基”分别是指一个或多个碳原子各自独立地被相同或不同杂原子基团置换的烷基(alkyl)、烷基(alkanyl)、烯基、炔基、烷二基以及亚烷基。可包括于这些基团中的典型杂原子基团包括但不限于-O-、-S-、-O-O-、-S-S-、-O-S-、-NR′、═N-N═、-N═N-、-N(O)N-、-N═N-NR′-、-PH-、-P(O)2-、-O-P(O)2-、-SH2-、-S(O)2-或其类似基团，其中如本文所定义，每个R′独立地为氢、烷基(alkyl)、烷基(alkanyl)、烯基、炔基、芳基、芳基芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基-杂芳基。

如本文所使用，术语“芳基”是指通过从母体芳香族环系统的单个碳原子去除一个氢原子衍生的单价芳香族烃基。典型芳基包括但不限于衍生自以下的基团：乙烯合蒽、乙烯合萘、乙烯合菲、蒽、薁、苯、屈、晕苯、丙二烯合茀、芴、稠六苯、己芬、亚己基、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、并八苯、辛芬、辛搭烯、卵苯、戊-2,4-二烯、并五苯、并环戊二烯、戊芬、苝、丙烯合萘、菲、苉、七曜烯、芘、皮蒽、茹、苯并菲、三萘以及其类似物。在一些实施例中，芳基是(C5-C14)芳基或(C5-C10)芳基。一些优选的芳基是苯基和萘基。

如本文所使用，术语“芳二基”是指通过从母体芳香族环系统的两个不同碳原子中的每一个去除一个氢原子或通过从母体芳香族环系统的单个碳原子去除两个氢原子衍生的二价芳香族烃基。两个单价基团中心或二价中心的每个价态可与一个或多个相同或不同原子形成键。典型芳二基包括但不限于衍生自以下的二价基团：乙烯合蒽、乙烯合萘、乙烯合菲、蒽、薁、苯、屈、晕苯、丙二烯合茀、氟、稠六苯、己芬、亚己基、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、并八苯、辛芬、辛搭烯、卵苯、戊-2,4-二烯、并五苯、并环戊二烯、戊芬、苝、丙烯合萘、菲、苉、七曜烯、芘、皮蒽、茹、苯并菲、三萘以及其类似物。在一些实施例中，芳二基是(C5-C14)芳二基或(C5-C10)芳二基。举例来说，一些优选的芳二基是衍生自苯和萘的二价基团，尤其是苯-1,4-二基、萘-2,6-二基和萘-2,7-二基。

如本文所使用，术语“亚芳基(arydeno)”是指通过从母体芳香族环系统的两个相邻碳原子中的每一个去除一个氢原子衍生的具有两个相邻单价基团中心的二价桥基。将亚芳基桥基(例如亚苯基)附接到母体芳香族环系统(例如苯)得到稠合芳香族环系统，例如萘。假定桥具有与其附接到所得稠合环系统一致的最大数量的非累积双键。为避免碳原子的两次计数，当通过将包括替代取代基的结构上的两个相邻取代基连在一起形成亚芳基取代基时，亚芳基桥的碳原子置换所述结构的桥接碳原子。作为一实例，考虑以下结构：

其中R¹当单独存在时是氢，或当与R²连在一起时是(C5-C14)亚芳基；并且R²当单独存在时是氢，或当与R¹连在一起时是(C5-C14)亚芳基。

当R¹和R²各自为氢时，所得化合物为苯。当R¹与R²连在一起是C6亚芳基(亚苯基)时，所得化合物是萘。当R¹与R²连在一起为C10亚芳基(亚萘基)时，所得化合物为蒽或菲。典型亚芳基包括但不限于醋蒽烯并、苊烯并、醋菲烯并、蒽并、甘菊环并、亚苯基(苯并)、屈并、六苯并苯并、荧蒽并、芴并、并六苯并、己芬并基、亚己基、不对称苯并二茚并、对称苯并二茚并、茚并、萘(萘并)、并八苯并、辛芬并、辛搭烯并、卵苯并、亚戊-2,4-二烯基、并五苯并、并环戊二烯并、戊芬并、苝并、丙烯合萘并、菲并、苉并、七曜烯并、芘并、皮蒽并、玉红省并、联伸三苯并、联三萘并以及其类似基团。在预期具体连接的情况下，所涉及的(亚芳基桥的)桥接碳原子用括号表示，例如[1,2]亚苯基([1,2]苯并)、[1,2]亚萘基、[2,3]亚萘基等。因此，在以上实例中，当R¹与R²连在一起为[2,3]亚萘基时，所得化合物为蒽。当R¹与R²连在一起为[1,2]亚萘基时，所得化合物是菲。在一优选实施例中，亚芳基是(C5-C14)，甚至更优选是(C5-C10)。

如本文所使用，术语“芳基芳基”是指通过从环系统的单个碳原子去除一个氢原子衍生的单价烃基，在所述环系统中，两个或更多个相同或不相同的母体芳香族环系统通过单键直接接合在一起，其中这类直接环接合点的数量小于所涉及的母体芳香族环系统的数量。典型芳基芳基包括但不限于联苯、联三苯、苯基-萘基、联萘、联苯-萘基以及其类似基团。当指定包含芳基芳基的碳原子的数量时，所述数量是指包含每个母体芳香族环的碳原子。举例来说，(C1-C14)芳基芳基是其中每个芳香族环包含5到14个碳的芳基芳基，例如，联苯、联三苯、联萘、苯基萘基等。在一些情况下，芳基芳基的每个母体芳香族环系统独立地是(C5-C14)芳香族基或(C1-C10)芳香族基。一些优选的是芳基芳基，其中所有母体芳香族环系统是相同的，例如联苯、联三苯、联萘、联三萘等。

如本文所使用，术语“联芳基”是指具有通过单键直接接合在一起的两个相同母体芳香族系统的芳基芳基。典型联芳基包括但不限于联苯、联萘、联蒽以及其类似基团。在一些情况下，芳香族环系统是(C5-C14)芳香族环或(C5-C10)芳香族环。一种优选的联芳基是联苯。

如本文所使用的术语“芳基烷基”是指键结到碳原子，通常末端或spa碳原子的氢原子中的一个被芳基置换的非环状烷基。典型芳基烷基包括但不限于苄基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基以及其类似基团。在预期具体烷基部分的情况下，使用命名法芳基烷基、芳基烯基和/或芳基炔基。在一些实施例中，芳基烷基是(C6-C40)芳基烷基，例如芳基烷基的烷基、烯基或炔基部分是(C1-C26)并且芳基部分是(C5-C14)。在一些优选实施例中，芳基烷基为(C6-C13)，例如芳基烷基的烷基、烯基或炔基部分为(C1-C3)，并且芳基部分为(C5-C10)。

如本文所使用，术语“杂芳基”是指通过从母体杂芳香族环系统的单个原子去除一个氢原子衍生的单价杂芳香族基团。典型杂芳基包括但不限于衍生自以下的基团：吖啶、砷哚、咔唑、β-咔啉、色原烷、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、吲哚啉、吲哚嗪、异苯并呋喃、异色烯、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、异噻唑、异噁唑、萘啶、噁二唑、噁唑、萘嵌间二氮杂苯、菲啶、菲咯啉、吩嗪、酞嗪、喋啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯嗪、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喏啉、四唑、噻二唑、噻唑、噻吩、三唑、呫吨以及其类似物。在一些实施例中，杂芳基是5-14元杂芳基，其中5-10元杂芳基尤其优选。一些优选的杂芳基是衍生自任何环杂原子是氮的母体杂芳香族环系统，如咪唑、吲哚、吲唑、异吲哚、萘啶、蝶啶、异喹啉、酞嗪、嘌呤、吡唑、吡嗪、哒嗪、吡啶、吡咯、喹唑啉、喹啉等的基团。

如本文所使用，术语“杂芳二基”是指通过从母体杂芳香族环系统的两个不同原子中的每个去除一个氢原子或通过从母体杂芳香族环系统的单个原子去除两个氢原子衍生的二价杂芳香族基团。所述两个单价基团中心或单个二价中心各自的价态可以与相同或不同原子形成键。典型杂芳二基包括但不限于衍生自以下的二价基团：吖啶、砷哚、咔唑、β-咔啉、色原烷、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、吲哚啉、吲哚嗪、异苯并呋喃、异色烯、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、异噻唑、异噁唑、萘啶、噁二唑、噁唑、萘嵌间二氮杂苯、菲啶、菲咯啉、吩嗪、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯嗪、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喏啉、四唑、噻二唑、噻唑、噻吩、三唑、呫吨以及其类似物。在一些实施例中，杂芳二基为5-14元杂芳二基或5-10元杂芳二基。一些优选的杂芳二基为衍生自任何环杂原子是氮的母体杂芳香族环系统，如咪唑、吲哚、吲唑、异吲哚、萘啶、蝶啶、异喹啉、酞嗪、嘌呤、吡唑、吡嗪、哒嗪、吡啶、吡咯、喹唑啉、喹啉等的二价基团。

如本文所使用，术语“亚杂芳基”是指通过从母体杂芳香族环系统的两个相邻原子中的每一个去除一个氢原子衍生的具有两个相邻单价基团中心的二价桥接基团。将亚杂芳基桥接基团，例如吡啶并附接到母体芳香族环系统，例如苯，产生稠合杂芳香族环系统，例如喹啉。假定桥具有与其附接到所得稠合环系统一致的最大数量的非累积双键。为了避免重复计数环原子，当通过将包括替代取代基的结构上的两个相邻取代基连在一起形成亚杂芳基取代基时，亚杂芳基桥的环原子置换所述结构的桥接环原子。作为一实例，考虑以下结构：

其中R¹单独存在时是氢，或与R²连在一起时是5-14元亚杂芳基；并且R²单独存在时是氢，或与R¹连在一起时是5-14元亚杂芳基；

当R¹和R²各自为氢时，所得化合物为苯。当R1与R²连在一起是6元亚杂芳基吡啶并)时，所得化合物是异喹啉、喹啉或喹嗪。当R¹与R²连在一起是10元亚杂芳基(例如异喹啉)时，所得化合物是例如吖啶或菲啶。典型亚杂芳基包括但不限于吖啶并、咔唑并、β-咔啉并、色烯并、噌啉并、呋喃、咪唑并、亚吲唑基、亚吲哚基、吲哚嗪并、异苯并呋喃并、异色烯并、亚异吲哚基、异喹啉并、亚异噻唑基、亚异噁唑基、萘啶并、亚噁二唑基、亚噁唑基、萘嵌间二氮杂苯并、菲啶并、菲咯啉并、吩嗪并、酞嗪并、蝶啶并、嘌呤并、吡喃并、吡嗪并、亚吡唑基、哒嗪并、吡啶并、嘧啶并、亚吡咯基、吡咯嗪并、喹唑啉并、喹啉并、喹嗪并、喹喏啉并、亚四唑基、亚噻二唑基、亚噻唑基、噻吩并、亚三唑基、呫吨并或其类似物。在预期具体连接的情况下，所涉及的(亚杂芳基桥的)桥接原子用括号表示，例如[1,2]吡啶并、[2,3]吡啶并、[3,4]吡啶并等。因此，在以上实例中，当R¹与R²一起是[1,2]吡啶并时，所得化合物是喹嗪。当R¹与R²连在一起是[2,3]吡啶并时，所得化合物是喹啉。当R¹与R²连在一起是[3,4]吡啶并时，所得化合物是异喹啉。在优选实施例中，亚杂芳基为5-14元亚杂芳基，或5-10元亚杂芳基。一些优选的亚杂芳基为衍生自任何环杂原子是氮的母体杂芳香族环系统，如咪唑并、吲哚并、吲唑并、异吲哚并、萘啶并、蝶啶并、异喹啉并、酞嗪并、嘌呤并、吡唑并、吡嗪并、哒嗪并、pyndmo、吡咯并、喹唑啉并、喹啉并等的基团。

如本文所使用，术语“杂芳基-杂芳基”是指通过从环系统的单个原子去除一个氢原子衍生的单价杂芳香族基团，在所述环系统中，两个或更多个相同或不相同的母体杂芳香族环系统是通过单键直接接合在一起，其中这类直接环接合点的数量小于所涉及的母体杂芳香族环系统的数量。典型的杂芳基-杂芳基包括但不限于联吡啶基、三吡啶基、吡啶基嘌呤基、联嘌呤基等。当指定环原子的数量时，所述数量是指包含每个母体杂芳香族环系统的原子的数量。举例来说，5-14元杂芳基-杂芳基是每个母体杂芳香族环系统包含5到14个原子的杂芳基-杂芳基，例如联吡啶基、联三吡啶基等。在一些实施例中，每个母体杂芳香族环系统独立地是5-14元杂芳香族的，更优选是5-10元杂芳香族的。另外优选的是所有母体杂芳香族环系统都相同的杂芳基-杂芳基。一些优选的杂芳基-杂芳基是每个杂芳基衍生自任何环杂原子是氮的母体杂芳香族环系统，如咪唑、吲哚、吲唑、异吲哚、萘啶、蝶啶、异喹啉、酞嗪、嘌呤、吡唑、吡嗪、哒嗪、吡啶、吡咯、喹唑啉、喹啉等的基团。

如本文所使用，术语“联杂芳基”是指具有两个相同母体杂芳香族环系统通过单键直接接合在一起的杂芳基-杂芳基。典型联杂芳基包括但不限于联吡啶基、联嘌呤基、联喹啉基以及其类似基团。在一些实施例中，杂芳香族环系统为5-14元杂芳香族环或5-10元杂芳香族环。一些优选的联杂芳基为杂芳基衍生自任何环杂原子是氮的母体杂芳香族环系统的联杂芳基，如联咪唑基、联吲哚基、联吲唑基、联异吲哚基、联萘啶基、联蝶啶基、联异喹啉基、联酞嗪基、联嘌呤基、联吡唑基、联吡嗪基、联哒嗪基、联吡啶基、联吡咯基、联喹唑啉基、联喹啉基等。

如本文所使用，术语“杂芳基烷基”是指键结到碳原子，典型地末端或sp2碳原子的氢原子中的一个被杂芳基置换的非环状烷基。在预期具体烷基部分的情况下，使用命名法杂芳基烷基、杂芳基烯基和/或杂芳基炔基。在一些实施例中，杂芳基烷基为6-20元杂芳基烷基，例如所述杂芳基烷基的烷基、烯基或炔基部分为1-6元的并且杂芳基部分为5-14元杂芳基。在一些优选实施例中，杂芳基烷基是6-13元杂芳基烷基，例如，烷基、烯基或炔基部分是1-3元的，并且杂芳基部分是5-10元杂芳基。

如本文所使用，术语“被取代的”是指其中一个或多个氢原子各自独立地被相同或不同取代基置换的基团。典型取代基包括但不限于-X、-R、-O-、═O、-OR、-O-OR、-SR、-S-、═S、-NRR、═NR、全卤(C1-C6)烷基、-CX3、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、-NCS、-NO、-NO2、═N2、-N3、-S(O)2O-、-S(O)2OH、-S(O)2R、-C(O)R、-C(O)X、-C(S)R、-C(S)X、-C(O)OR、-C(O)O-、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)SR、-C(O)NRR、-C(S)NRR和-C(NR)NRR，其中如本文所定义，每个X独立地为卤素(例如，-F或-Cl)，并且每个R独立地为氢、烷基(alkyl)、烷基(alkanyl)、烯基、烷基(alkanyl)、芳基、芳基烷基、芳基芳基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基-杂芳基。取代任何特定基团的实际取代基将取决于经取代的基团的身份。

如本文所用，术语“溶剂化物”是指包含一个或多个本公开的化合物分子与一个或多个溶剂分子的聚集物。形成溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。术语“水合物”是指其中溶剂分子是水的聚集物或复合物。溶剂可以是无机溶剂，例如水，在此情况下，溶剂化物可以是水合物。或者，溶剂可以是有机溶剂，如乙醇。因此，本发明的化合物可以水合物以及相应的溶剂化形式存在，所述水合物包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物或其类似物。本公开的化合物可以是真溶剂化物，而在其它情况下，本公开的化合物可以仅保留外来水或是水加一些外来溶剂的混合物。

如本文所使用，术语“氧化固醇”意图涵盖氧化胆固醇的一种或多种形式。本文所描述的氧化固醇独立地或共同地对患者骨骼生长具有活性，如以全文引用的方式并入本文中的WO 2013169399 A1中所描述。

氧化固醇、固醇或二醇可呈药学上可接受的盐的形式。潜在地药学上可接受的盐的一些实例包括实质上不增加化合物的毒性的那些成盐酸和碱，如碱金属(如镁、钾)和铵的盐、无机酸(如盐酸、氢碘酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸)的盐，以及有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、苯甲酸、甘醇酸、葡萄糖酸、古洛糖酸、琥珀酸、芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的盐或其类似物。

氧化固醇、固醇或二醇的药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无毒碱或酸(包括无机碱或有机碱、无机酸或有机酸和脂肪酸)制备的盐。衍生自无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰盐、亚锰、钾、钠、锌盐以及其类似物。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺、经取代的胺(包括天然存在的经取代的胺)、环状胺和碱性离子交换树脂，如精氨酸、甜菜碱、咖啡碱、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-吗啉、N-乙基哌啶、还原葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可豆碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血酸胺以及其类似物。当本申请的化合物呈碱性时，盐可以由药学上可接受的无毒酸，包括无机酸和有机酸制备。这类酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙基磺酸、乳酸、顺丁烯二酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、丙二酸、粘液酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸以及其类似酸。也可以使用脂肪酸盐，例如具有超过2个碳、超过8个碳或超过16个碳的脂肪酸盐，如丁酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、二十烷酸盐或其类似物。

在一些实施例中，为了降低氧化固醇、固醇或二醇的溶解度以帮助获得受控释放贮库效应，将氧化固醇、固醇或二醇以游离碱或以具有相对较低溶解度的盐的形式进行利用。举例来说，本申请可利用不溶盐，如脂肪酸盐。代表性脂肪酸盐包括油酸盐、亚油酸盐，或具有8到20个之间的碳溶解度的脂肪酸盐，如棕榈酸盐或硬脂酸盐。

术语“溶剂化物”是由一个或多个溶质分子，例如化合物或其药学上可接受的盐，和一个或多个溶剂分子形成的复合物或聚集物。这类溶剂化物可为具有实质上固定的溶质与溶剂的摩尔比的结晶固体。合适溶剂包括例如水、乙醇等。

如本文所使用，术语“生物活性”组合物或“药物”组合物可互换使用。两个术语均指可向个体施用的组合物。生物活性或药物组合物在本文中有时被称为本发明的“药物组合物”或“生物活性组合物”。有时，短语“Oxy133的施用”在本文中用于向个体施用这种化合物(例如，使个体与化合物接触、注射化合物、以药物贮库(depot)的形式施用化合物等)的上下文中。应理解，这样使用的化合物通常可呈包含Oxy133的药物组合物或生物活性组合物的形式。

术语“OXY133产物”包括OXY133、OXY133单水合物以及其非对映异构体D1和D2。

术语“杂质”在本文中用以指OXY133或OXY133单水合物的杂质，包括非对映异构体D1、非对映异构体D2，或其它OXY133单水合物杂质(例如用于合成OXY133单水合物的C₂₇H₄₆O₂二醇)，或其任何组合。

“治疗有效量”或“有效量”使得当施用时，氧化固醇(例如Oxy133)、固醇、二醇引起生物活性的改变，如增强骨骼生长等。取决于多种因素，包括药物的施用的药物动力学特性、施用途径、患者的状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、体格等)和症状的程度、同时进行的治疗、治疗的频率以及所期望的效果，向患者施用的剂量可呈单次剂量或多次剂量形式。在一些实施例中，配制物被设计用于立即释放。在其它实施例中，配制物被设计用于持续释放。在其它实施例中，调配物包含一个或多个立即释放表面和一个或多个持续释放表面。

“贮库”包括但不限于胶囊、微米球、微米颗粒、微胶囊、微纤维颗粒、纳米球、纳米颗粒、涂层、基质、粉片、丸剂、团粒、乳液、脂质体、胶束、凝胶或其它药物递送组合物，或其组合。适合用于贮库的材料理想地是药学上可接受的可生物降解和/或任何生物可吸收材料，其优选为FDA批准或GRAS材料。这些材料可为聚合材料或非聚合材料，以及合成材料或天然存在的材料，或其组合。

如本文所使用，术语“可植入”是指保留成功安置于哺乳动物内的潜力的生物相容性装置(例如药物贮库)。如本文所用，表述“可植入装置”和类似意义的表述是指能通过手术、注射或其它合适手段植入的物体，所述物体通过其物理存在或机械特性实现主要功能。

“局部”递送包括这样一种递送，其中将一种或多种药物沉积于组织，例如骨腔内，或与所述组织极为接近(例如，在约0.1cm范围内，或优选在约10cm范围内)。举例来说，从药物贮库局部递送的药物剂量可以比口服剂量或可注射剂量低例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或99.999％。

术语“哺乳动物”是指来自分类系统“哺乳动物”纲的生物，包括但不限于人类、其它灵长类动物(如黑猩猩、猿、猩猩和猴)、大鼠、小鼠、猫、狗、牛、马等。

氧化固醇可为“成骨性的”，其中氧化固醇可通过如骨生成、骨传导和/或骨诱导的一种或多种机制增强或加速新骨组织的向内生长。

提供新的组合物和方法以有效并且安全地制备包括Oxy133的氧化固醇。还提供了可以有效并且安全地产生Oxy133的方法和组合物。

下面的章节标题不应受到限制，并且可以与其它章节标题互换。

氧化固醇

本发明包括成骨性氧化固醇(例如，Oxy133)、固醇或二醇，以及其促进体外成骨分化的能力。Oxy133为尤其有效的成骨剂。在各种应用中，Oxy133适用于治疗将受益于骨骼形成的局部刺激的病况，例如脊柱融合、骨折修复、骨骼再生/组织应用、为种植牙增加颌部的骨密度、骨质疏松或其类似病况。Oxy133的一个特定优点是，当与其它成骨性氧化固醇相比较时，它提供更易于合成并且改善融合时间。Oxyl33是可充当用于骨骼生长的合成代谢治疗剂以及用于治疗各种其它病况的有用试剂的小分子。

本申请公开的一个方面是名为Oxyl33的化合物，其具有下式：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。Oxy133可以包含Oxy133或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物和药学上可接受的载剂的生物活性或药物组合物的形式使用。

本公开另一方面是用于诱导(刺激、增强)细胞或组织中刺猬(hedgehog，Hh)路径介导的响应的方法，所述方法包含使细胞或组织与治疗有效量的Oxy133接触。细胞或组织可在体外或在个体，如哺乳动物内。刺猬(Hh)路径介导的响应涉及刺激成骨细胞分化、骨形态发生和/或骨质增殖；刺激毛发生长和/或软骨形成；刺激新血管生成，例如血管生成，从而增加缺血组织的血液供应；或抑制脂肪细胞分化、脂肪细胞形态发生和/或脂肪细胞增殖；或刺激祖细胞经历神经形成。Hh介导的响应可包含多种类型的组织中的任一种的再生，用于再生医学。本公开的另一方面为一种用于治疗患有骨病症、骨质减少、骨质疏松或骨折的个体的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的包含Oxy133的生物活性组合物或药物组合物。可按选定的时间间隔向个体施用治疗有效剂量的呈有效剂型的生物活性组合物或药物组合物，例如以增加骨质量，缓解骨质疏松症状，减少、消除、预防或治疗动脉粥样硬化病变或其类似物。可按选定的时间间隔向个体施用治疗有效剂量的呈有效剂型的生物活性组合物或药物组合物以缓解骨质疏松症状。在一些实施例中，包含Oxy133的组合物可以包括间充质干细胞以在目标手术区域诱导细胞的成骨细胞分化。

在各种方面中，可通过局部施用将Oxy133施用到细胞、组织或器官。举例来说，Oxy133可用乳膏或其类似物局部施用，或其可注射或以其它方式直接引入细胞、组织或器官中，或其可用合适的医疗装置，如如本文所论述的药物贮库引入。

在一些实施例中，Oxy133、固醇或二醇的剂量是大约10pg/天到大约80mg/天。Oxy133、固醇或二醇的额外剂量包括大约2.4ng/天到大约50mg/天；大约50ng/天到大约2.5mg/天；大约250ng/天到大约250mcg/天；大约250ng/天到大约50mcg/天；大约250ng/天到大约25mcg/天；大约250ng/天到大约1mcg/天；大约300ng/天到大约750ng/天或大约0.50mcg/天到500ng/天。在各种实施例中，剂量可以是约0.01到大约10mcg/天，或大约1ng/天到约120mcg/天。

除化合物Oxy133、固醇或二醇外，本公开的其它实施例还涵盖Oxy133中存在的立体中心中的任一个处的任何和所有个别立体异构体，包括所述化合物的非对映异构体、外消旋体、对映异构体和其它异构体。在本公开的实施例中，Oxy133、固醇、氧化固醇、二醇可以包括化合物的所有多晶型物、溶剂化物或水合物，如水合物和与有机溶剂形成的那些。

制备盐的能力取决于化合物的酸性或碱性。化合物的合适的盐包括但不限于酸加成盐，如用盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、碳酸肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和2-乙酰氧基苯甲酸制成的盐；用糖精制成的盐；碱金属盐，如钠盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；以及用有机配体或无机配体形成的盐，如季铵盐。额外合适的盐包括但不限于所述化合物的乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、棒酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙内酰胺苯胂酸盐、己基间苯二酚酸盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、杏仁酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、半乳糖二酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙碘化物以及戊酸盐。

在各种实施例中，Oxy133、固醇或二醇包括一种或多种生物功能。也就是说，当与间充质干细胞或骨髓基质细胞接触时，Oxy133、固醇或二醇可诱导生物响应。举例来说，Oxy133、固醇或二醇可以刺激成骨细胞分化。在一些实施例中，当施用到哺乳动物细胞，例如体外细胞或人类或动物体内的细胞时，生物活性组合物(包括Oxy133固醇或二醇)可以包括一种或多种生物功能。举例来说，这类生物活性组合物可刺激成骨细胞分化。在一些实施例中，这类生物功能可源自刺猬路径的刺激。

制备中间物二醇的方法

在一些实施例中，本公开提供用于制备用于产生Oxy133的中间物二醇的方法，如下文所示。二醇还可以用于促进骨生长。用于Oxy133产生的先前合成方法是低效的，并且不适合于按比例放大制造。Oxy133的一些立体异构体的最佳表现差于其它立体异构体。所公开的方法是立体选择性的，并且产生高产率的具体异构形式的二醇(以下示出)，所述具体异构形式的二醇经表明产生Oxy133的最佳有效的异构形式。

所公开的是用于合成中间物二醇的反应的多个实施例。所合成的二醇的IUPAC名称为(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3-醇。一般来说，合成二醇的方法包括使孕烯醇酮、孕烯醇酮乙酸酯或孕烯醇酮衍生物与有机金属试剂反应，以促进C17位置的烷基化作用，如下文所示：

流程1

在一个实施例中，如以上流程1所示，可以通过有机金属试剂使孕烯醇酮乙酸酯(式1)烷基化以合成中间物二醇(以上示出为式2)。在一些实施例中，孕烯醇酮乙酸酯与格林纳试剂反应以促进孕烯醇酮乙酸酯分子上C17位置的烷基化作用。在一些实施例中，将正己基氯化镁用作有机金属试剂。

流程2

在一些实施例中，如以上流程2所示，孕烯醇酮与格林纳试剂(如正己基氯化镁)反应，以促进孕烯醇酮分子的C17位置的烷基化作用，以形成中间物二醇(示出为式2)。

合成中间物二醇(式2)或(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3-醇的方法是立体选择性的，并且产生高产率的二醇。举例来说，在一些实施例中，二醇的期望立体异构体的产率在约60％与约70％之间。在一些实施例中，二醇的期望立体异构体的产率在约50％与约60％之间。然而，预期产率％可高于或低于这些量。举例来说，如上所示的式2的产率％可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，产率％可高于95％。

在各种实施例中，在如四氢呋喃的极性有机溶剂中进行烷基化反应。然而，反应可以在各种极性有机溶剂中进行。举例来说，反应可以在二乙醚、乙醚、二甲醚等中进行。

在一些实施例中，孕烯醇酮或孕烯醇酮乙酸酯用作起始反应物。然而，在其它实施例中，可以使用孕烯醇酮乙酸酯的衍生物。举例来说，可用于本发明的化合物的其它具体实例包括：孕烯醇酮硫酸酯、孕烯醇酮磷酸酯、孕烯醇酮甲酸酯、孕烯醇酮半草酸酯、孕烯醇酮半丙二酸酯、孕烯醇酮半戊二酸酯、20-氧代孕甾-5-烯-3β-基羧基甲基醚、3β-羟基孕甾-5-烯-20-酮硫酸酯、3-羟基-19-去甲孕甾-1,3,5(10)-三烯-20-酮、3-羟基-19-去甲孕甾-1,3,5(10),6,8-五烯-20-酮、17α-异孕烯醇酮硫酸酯、17-乙酰氧基孕烯醇酮硫酸酯、21-羟基孕烯醇酮硫酸酯、20β-乙酰氧基-3β-羟基孕甾-5-烯-硫酸酯、孕烯醇酮硫酸酯20-亚乙基缩酮、孕烯醇酮硫酸酯20-羧甲基肟、20-脱氧孕烯醇酮硫酸酯、21-乙酰氧基-17-羟基孕烯醇酮硫酸酯、17-丙氧基孕烯醇酮硫酸酯、17-丁氧基孕烯醇酮硫酸酯、孕烯醇酮硫酸酯的21-硫羟酸酯、吡啶、咪唑、6-甲基孕烯醇酮硫酸酯、6,16α-二甲基孕烯醇酮硫酸酯、3β-羟基-6-甲基孕甾-5,16-二烯-20-酮硫酸酯、3β-羟基-6,16-二甲基孕甾-5,16-二烯-20-酮硫酸酯、3jβ-羟基孕甾-5,16-二烯-20-酮硫酸酯、薯蓣皂苷配基硫酸酯、3β-羟基雄甾-5-烯-17β-羧酸甲酯硫酸酯、3α羟基-5β-孕烷-20-酮甲酸酯、3α-羟基-5β-孕烷-20-酮半草酸酯、3α-羟基-5β-孕烷-20-酮半丙二酸酯、3α-羟基-5β-孕烷-20-酮半丁二酸酯、3α-羟基-5β-孕烷-20-酮半戊二酸酯、雌二醇-3-甲酸酯、雌二醇-3-半草酸酯、雌二醇-3-半丙二酸酯、雌二醇-3-半丁二酸酯、雌二醇-3-半戊二酸酯、雌二醇-17-甲基醚、雌二醇-17-甲酸酯、雌二醇-17-半草酸酯、雌二醇-17-半丙二酸酯、雌二醇-17-半丁二酸酯、雌二醇-17-半戊二酸酯、雌二醇-3-甲基醚、17-脱氧雌酚酮，和17β-羟基雌-1,3,5(10)-三烯-3-基羧基甲基醚。

在一些实施例中，有机金属包含正己基氯化镁。然而，在一些实施例中，可以通过使用烷基锂(例如正己基锂)实行烷基化反应。在各种实施例中，有机金属包括烷基卤化物。举例来说，有机金属试剂可具有下式：

R-Mg-X，

其中Mg包含镁，X包含氯、溴、氟、碘或砹，并且R包含烷基(alkyl)、杂烷基(heteroalkyl)、烷基(alkanyl)、杂烷基(heteroalkanyl)、烯基、杂烯基、炔基、杂烷基、烷二基、杂烷二基、亚烷基、杂亚烷基、芳基、芳二基、亚芳基、芳基芳基、联芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳二基、亚杂芳基、杂芳基-杂芳基、联杂芳基、杂芳基烷基或其组合。在一些实施例中，R取代基包含(C1-C20)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基以及(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷二基或杂烷二基，或(C₄-C₁₀)亚烷基或亚杂烷基。R取代基可以是环状或非环状、支链或非支链、经取代或未经取代的芳香族饱和或不饱和链，或其组合。在一些实施例中，R取代基是脂肪族基团。在一些实施例中，R取代基是环状基团。在一些实施例中，R取代基是己基。

或者，有机金属可包含下式：

R-Li，

其中Li包含锂，并且R包含烷基(alkyl)、杂烷基(heteroalkyl)、烷基(alkanyl)、杂烷基(heteroalkanyl)、烯基、杂烯基、炔基、杂烷基、烷二基、杂烷二基、亚烷基、杂亚烷基、芳基、芳二基、亚芳基、芳基芳基、联芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳二基、亚杂芳基、杂芳基-杂芳基、联杂芳基、杂芳基烷基，或其组合。在一些实施例中，R取代基包含(C₁-C₂₀)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳基烷基或杂烷基以及(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷二基或杂烷二基，或(C₄-C₁₀)亚烷基或亚杂烷基。R取代基可以是环状或非环状、支链或非支链、经取代或未经取代的芳香族饱和或不饱和链，或其组合。在一些实施例中，R取代基是脂肪族基团。在一些实施例中，R取代基是环状基团。在一些实施例中，R取代基是己基。

在一些实施例中，烷基化反应是放热的，并且可以控制反应容器的温度以保持最佳反应动力。在一些实施例中，放热反应每磅溶液释放约1000BTU。由于反应的强放热性质，因此可缓慢添加格林纳试剂以使得挥发性组分(例如醚)不会由于反应热量而气化。在一些实施例中，反应容器可以通过内部冷却盘管冷却。可以通过外部气体/液体制冷单元向冷却盘管供应冷却剂。在一些实施例中，反应容器的内部温度保持在低于15℃、10℃、5℃或1℃。在一些实施例中，在烷基化反应期间将反应容器保持在约0℃以形成式2的中间物二醇。

在各种实施例中，式2的二醇与副产物一起合成并且可以纯化。例如，所得式2的二醇可以是非对映异构体混合物的副产物。在各种实施例中，可以分离和纯化式2的二醇。也就是说，可通过过滤、离心、基于其相对挥发性以分离挥发性液体的蒸馏、结晶、再结晶、从非挥发性溶质中去除挥发性液体的蒸发、去除杂质的溶剂萃取、将组合物溶解于其中其它组分可溶的溶剂中、或其它纯化方法将式2的二醇分离和纯化到期望的纯度，例如约95％到约99.9％。可以通过使二醇与有机和/或无机溶剂接触来纯化所述二醇，所述有机和/或无机溶剂例如THF、水、二乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、氨、叔丁醇、正丙醇、乙醇、甲醇、乙酸或其组合。

在各种实施例中，烷基化步骤和纯化步骤在相同的反应容器中进行。

在一些实施例中，用氯化铵水溶液或乙酸淬灭二醇以减少存在的阴离子的量并且中和反应，并且与所得有机层分离。蒸发回收分离的残余物，并且通过硅胶管柱色谱纯化。

二醇可以是无水的或呈单水合物形式。然而，在其它实施例中，纯化的二醇可以其它含水形式结晶，例如二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物，四水合物等，以及相应的溶剂化形式。在其它实施例中，纯化的二醇以共晶体或药学上可接受的盐结晶。

制备Oxy133的方法

在一些实施例中，本发明提供制备Oxy133的方法，如下所示。先前的Oxy133合成方法产生Oxy133中间物的非对映异构体混合物，其需要纯化方法来分离。如上所述，为了形成中间物二醇，所公开的方法是立体选择性的并且产生高产率的Oxy133的具体异构形式。下文示出Oxy133的式。

所公开的是用于合成Oxy133的反应的多个实施例。Oxy133的IUPAC名称为(3S,5S,6S,8R,9S,10R,13S,14S,17S)-17-((S)-2-羟基辛-2-基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊并[a]菲-3,6-二醇。先前通过不适合于按比例放大的复杂工艺合成Oxy133，如下文所示：

流程3

然而，反应难以在单个容器中进行。上文所示的反应涉及更多的试剂以进行对环境有不利影响的反应步骤(例如，封闭和脱保护基团和步骤)。另外，已知方法涉及昂贵并且通常难以获得的试剂。此外，流程3中所示的方法产生相对低的产率、具有更多的降解产物、杂质并且产生许多有毒副产物。

一般来说，合成如本文所公开的Oxy133的方法包括使如本文中所述合成的二醇在以下示出的反应中与硼烷反应：

流程4

二醇

在一些实施例中，通过在反应流程4中具有式2的中间物二醇的硼氢化和氧化反应产生未纯化的粗Oxy133。可用于反应中的硼烷化合物包括BH₃；B₂H₆；BH₃S(CH₃)₂(BMS)；具有膦和胺的硼烷加合物，例如硼烷三乙胺；RBH₂形式的经单取代的硼烷，其中R＝烷基和卤化物；单烷基硼烷(例如单异松蒎基硼烷(IpcBH2))；单溴硼烷和单氯硼烷；单氯硼烷和1,4-二噁烷的复合物；包括大型硼烷的二取代硼烷，例如二烷基硼烷化合物，如二乙基硼烷；双-3-甲基-2-丁基硼烷(二异戊基硼烷)；9-硼二环[3,3,1]壬烷(9-BBN)；二异戊基硼烷(Sia₂BH)；二环己基硼烷(Chx2BH)；三烷基硼烷；二烷基卤代硼烷；二-2,4,6-三甲苯基硼烷(dimesitylborane；(C₆H₂Me₃)₂BH)；烯基硼烷；频哪醇硼烷或儿茶酚硼烷，或其组合。

简单来说，硼氢化反应和氧化反应是两步反应。硼和氢跨烯烃的双键加成，以与烯烃形成复合物。因此，反应的硼化阶段是立体选择性的和区域选择性的。反应的氧化阶段涉及碱性过氧化氢水溶液，以供给羟基取代基代替硼。参见Vollhart,KP,Schore,NE,2007,《有机化学：结构和功能(Organic Chemistry:Structure and Function)》,第五版.纽约州纽约,特制出版物公司(Custom Publishing Company)。因此，具有式2的中间物二醇与硼烷和过氧化氢反应，形成粗Oxy133。在一些实施例中，形成粗Oxy133的步骤在与烷基化反应相同的反应容器中进行。在其它实施例中，形成粗Oxy133的步骤在与烷基化反应不同的反应容器中进行。

与形成中间物二醇的步骤一样，合成Oxy133的硼氢化-氧化步骤是立体选择性的，并且产生高产率。举例来说，在一些实施例中，粗Oxy133的产率％可高于或低于这些量。举例来说，如上所示的式2的产率％可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，产率％可高于95％。

在各种实施例中，在如四氢呋喃的极性有机溶剂中进行硼氢化-氧化反应。然而，反应可以在各种极性有机溶剂中进行。举例来说，反应可以在二乙醚、乙醚、二甲醚等中进行。

在一些实施例中，硼氢化-氧化反应是放热的，并且可以控制反应容器的温度以保持最佳反应动力。具体来说，氧化阶段是极其放热的。由于反应的强放热性质，因此可缓慢添加过氧化氢使得挥发性组分(例如醚)不由于反应热量而气化。在一些实施例中，反应容器可以通过内部冷却盘管冷却。可以通过外部气体/液体制冷单元向冷却盘管供应冷却剂。在一些实施例中，反应容器的内部温度保持在低于10℃、5℃、1℃或0℃。在一些实施例中，在硼氢化-氧化反应期间将反应容器保持在约-5℃。

在某些实施例中，二醇的二醇的盐、水合物、溶剂化物或结晶形式的结晶度％可为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施例中，结晶度％可大体上是100％，其中如最佳可以使用本领域中已知的方法测定，大体上100％指示全部量的二醇看来都是结晶。因此，二醇的治疗有效量可包括结晶度不同的量。这些包括一定量呈固体形式的结晶二醇随后溶解、部分溶解或悬浮或分散于液体中的情况。

Oxy133的纯化

在一些实施例中，可在纯化之前将粗Oxy133与反应混合物分离。在一些实施例中，将如二氯甲烷的有机溶剂添加到粗Oxy133反应混合物，并且使所得有机层分离。一旦分离，粗Oxy133以半固体粘稠块团存在。粗Oxy133可以通过任何合适的手段(例如二氯甲烷等)溶解并且置于具有有机溶剂(如甲醇-乙酸乙酯)的硅胶管柱中，以使粗OXY133溶剂化。在一些实施例中，粗Oxy133可以结晶或再结晶。在一些实施例中，纯化的Oxy133通过在3:1的丙酮/水混合物中再结晶粗Oxy133而形成，如下文所示：

流程5

如上所示，在结晶时，纯化的Oxy133形成水合物。但是，它可以呈无水形式。在一些实施例中，本文所述的Oxy133的任一种结晶形式的结晶度百分比会随Oxy133的总量而变化。

在某些实施例中，OXY133的Oxy133的盐、水合物、溶剂化物或结晶形式的结晶度％可为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施例中，结晶度％可实质上是100％，其中如最佳可使用本领域中已知的方法测定，实质上100％指示全部量的Oxy133似乎都是结晶。因此，Oxy133的治疗有效量可包括结晶度不同的量。这些包括一定量呈固体形式的结晶Oxy133随后溶解、部分溶解或悬浮或分散于液体中的情况。

在一个实施例中，纯化的Oxy133以单水合物结晶。然而，在其它实施例中，纯化的Oxy133可以其它含水形式结晶，例如二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化形式。在其它实施例中，纯化的Oxy133以共晶体或药学上可接受的盐结晶。

在一些实施例中，含有粗Oxy133的反应混合物可通过与庚烷混合而固化。随后将产物过滤并且悬浮在二氯甲烷中。在一些实施例中，可以从悬浮液过滤出粗Oxy133并且使用丙酮和水或其它有机或无机溶剂(例如，二乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、氨、叔丁醇、正丙醇、乙醇、甲醇、乙酸或其组合)使其结晶。

在各种实施例中，可以通过任何其它传统方法分离和纯化粗Oxy133。也就是说，可通过过滤、离心、基于其相对挥发性以分离挥发性液体的蒸馏、结晶、再结晶、从非挥发性溶质中去除挥发性液体的蒸发、去除杂质的溶剂萃取、将组合物溶解于其中其它组分可溶的溶剂中、或其它纯化方法，将粗Oxy133分离和纯化到期望的纯度，例如约95％到约99.9％。在各种实施例中，硼氢化-氧化步骤和纯化步骤在相同的反应容器中进行。在各种实施例中，烷基化步骤、硼氢化-氧化步骤和纯化步骤在相同的反应容器中进行。

合成中间物二醇(式2)的方法是立体选择性的并且产生高产率的Oxy133。举例来说，在一些实施例中，纯化的Oxy133的产率在约20％与约99％之间。在一些实施例中，纯化的Oxy133的产率在约20％与约80％之间。在一些实施例中，纯化的Oxy133的产率在约25％与约70％或约28％之间。然而，预期产率％可高于或低于这些量。

在一些实施例中，通过结晶使纯化的Oxy133形成晶体形式，所述结晶通过冷却液体进料流或添加降低反应混合物中副产物和未使用的反应物的溶解度的沉淀剂来分离Oxy133与液体进料流，使得Oxy133形成晶体。在一些实施例中，然后通过过滤或离心将固体晶体与残余的液体分离。可以将晶体再溶解于溶剂中，并且然后再结晶，并且然后通过过滤或离心将晶体与残余的液体分离，获得高纯度的Oxy133样品。在一些实施例中，然后可将晶体粒化到所期望的粒度。

在一些实施例中，通过核磁共振或质谱验证所获得的Oxy133的纯度。如图2-5中所示，1H NMR、13C NMR、红外线光谱分析和质谱分析指示Oxy133产物具有高纯度(例如纯度为98重量％到约99.99重量％)。

在一些实施例中，可对粗Oxy133进行纯化，其中纯化的Oxy133以结晶形式形成于溶剂中并且随后从溶剂中去除以形成纯度为约98％到约99.99％的高纯度Oxy133。在一些实施例中，可在纯化之前或之后通过过滤或真空过滤回收Oxy133。

分析方法在氧化固醇分离和检测中的使用

OXY133和其相关杂质是非挥发性化合物，其缺乏发色团，使得色谱不足以测定包含OXY133的样品的纯度。OXY133的可重复化学合成和用于表征OXY133产物的已建立的分析方法可以是发展过程中的重要活性。

已经意外地发现用于测定OXY133的纯度的方法，其包括用带电的气溶胶检测器(CAD)使包含OXY133和OXY133杂质的HPLC洗脱剂经历进一步分析。按组合物总重量计，这种方法可以在已知杂质存在下将OXY133分离并且定量到至少96.9％w/w或w/v的纯度。CAD具有高度敏感性，并且提供独立于化学结构的响应。

图8中说明CAD检测器的流程图和处理步骤。有几个CAD制造商，包括例如ThermoScientific^TMDionex^TMCorona^TMCAD检测器。适用于液相色谱应用的CAD检测器描述于美国专利第6,568,245号中，所述专利如同完整阐述一样以引用的方式并入本文中。

一般来说，CAD检测器包括电晕放电源，其被控制以选择性地对气溶胶的非挥发性残余颗粒进行充电。气溶胶最初由液体样品(例如，含有OXY133)的液滴构成，其中非挥发性残余颗粒由液滴蒸发产生。在导电过滤器处收集选择性带电的残余颗粒，每个颗粒带有与其尺寸成比例的电荷。沿着耦合到过滤器的导体的电流被重复或连续地测量，以提供非挥发性材料的浓度的指示。优选地，气动喷雾器用于产生气溶胶。当在液相色谱系统中使用时，检测器可以产生几个相对高电流的分离区域，对应于液体样品中几种不同分析物的浓度。

在一些实施例中，可以在首先使含有OXY133的样品经历HPLC后使用CAD检测器。在图8中，将包含OXY133化合物和挥发性移动相的HPLC洗脱剂用喷雾器10喷雾以形成液滴的气溶胶。喷雾器10设置成接收包含非挥发性材料的液体，并且适于喷雾至少一部分液体以产生由悬浮在载气中的液滴构成的气溶胶流，液滴倾向于蒸发，由此在喷雾器下游的选定位置处的气溶胶流由悬浮在载气中的非挥发性材料的残余颗粒构成。

有用的喷雾器包括气动、静电、热喷雾、超声喷雾器和混合装置，例如电辅助气动喷雾器。一般来说，首先用氮气或空气载气喷雾进入的HPLC洗脱剂以形成液滴，然后使液滴通过干燥器20，其去除挥发性移动相并且产生OXY133残余物或分析物颗粒。随着液滴沿干燥器20前进，它们蒸发，直到气溶胶而不是由液滴构成的点由先前溶解在溶液中的非挥发性材料的残余颗粒构成。然后将残余颗粒流运载到电荷转移室30，在那里通过由高压铂电晕线32带正电的二次气流满足。转移到残余颗粒流中的电荷量与粒度有关。带正电的残余颗粒流进一步转移到收集器40，在那里可以用静电计50测量施加到残余颗粒的总电荷，静电计50产生与检测到的非挥发性残余物或分析物颗粒的量成正比的信号。然后这一信号由检测单元60处理并且存储以产生色谱图，所述色谱图描绘检测的分析物强度随色谱保留时间的变化。在一些实施例中，图8中所说明的CAD系统还包括位于电荷转移室之后的离子阱34，其用于去除带负电的高迁移率粒子。

喷雾在CAD过程中是重要的，因为在这一步骤中，挥发性移动相可用于将液滴运载到下一步骤。适用于本申请方法的挥发性移动相的实例包括但不限于水溶液/有机溶剂(水/甲醇/乙腈混合物)，其在一些实施例中包括挥发性缓冲添加剂，如甲酸、乙酸或三氟乙酸和乙酸铵，类似于质谱(MS)移动相要求。

在一些实施例中，OXY133和/或OXY133单水合物的纯度的测量可以通过使用连接到检测单元60并且可由合适的处理器(图8中未示出)执行的软件程序来实现。用于本公开中描述的方法的适用软件的实例是Empower 3软件。

国际监管机构国际人用药品注册技术要求协调会议(ICH)报告了新原料药的杂质的阈值。对于新原料药，按药物组合物的总重量计，报告阈值可以从约0.03％w/w或w/v变化，按药物组合物的总重量计，日剂量高于2g到约0.05％w/w或w/v，平均日剂量低于2g。因此，活性药物成分(API)的质量控制的主要目标是开发一种检测、控制和定量其杂质的方法。

在各种实施例中，在验证ICH质量控制准则所需的分析方法发展(AMD)阶段期间，含有OXY133和OXY133相关杂质和/或其它化合物的HPLC洗脱剂的CAD分析可用于在存在已知杂质的情况下分离和定量OXY133。研究用于确定AMD功效以测定OXY133纯度的的效能特征包括溶剂系统、分析物响应、定量下限(LOQ)和中间精确度，如下文更详细地讨论。在含有其的样品中测量OXY133或OXY133单水合物的纯度并且确定样品不含杂质或实质上不含杂质，包括或不限于约95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.9％w/w或w/v纯的或不含杂质。例如，记录测量结果并且将其传达给技术人员、客户和/或政府机构。在某些实施例中，计算机将用于将这类信息传递给感兴趣的各方，例如技术人员、客户和/或政府官员，包括但不限于FDA。

溶剂系统

高纯度溶剂用于降低噪音和基线偏移。由于CAD过程涉及喷雾以去除移动相，因此使用挥发性移动相。评估了含有和不含甲酸的水/甲醇/乙腈混合物。在两种不同溶剂中制备溶液的同时进行线性度和精确度。线性度和精确度运算的比较如下表1中所示。

表1.线性度和精确度运算的比较

分析物响应

为了确定AMD期间的分析物响应和溶剂效应，通过在移动相中注入OXY133而不将管柱排成一行来进行流动注射分析(FIA)实验。AMD系统包括多个串联配置的检测器。用所提出的分析管柱进行的HPLC/DAD/MS扫描检测到不同的Oxy133检测谱，如PDA迹线所说明，接着是195nm下的UV通道，然后是MS TIC，接着是提取的m/z 257.2264，如图9中所说明。

定量下限

为了确定Oxy133的最低检测限(灵敏度)，确定可以在Oxy133的CAD系统检测上获得的0.50/mL到61ug/mL的最低定量水平(QL)浓度的较低线性度曲线，如图10中所描绘。

中间精确度

在两个HPLC-CAD系统上进行CAD分析比较，其中优化的水/甲醇移动相系统具有相同类型的管柱(XBridge Phenyl，4.6×150mm，3.5μ粒度)，但管柱不同。每个系统独立地产生可接受的系统适用性结果，其满足分辨率(Rs)>1.2并且RSD<2％。

用于HPLC/CAD的AMD效能参数

在AMD期间，研究了由于移动相组成引起的CAD响应的变化。由移动相组成引起的响应变化显示无干扰，并且低水平线性度在可接受的范围内。OXY133的精确度、LOQ和系统适用性目标根据ICH验证准则进行评估，并且发现其满足要求。

在已知杂质存在下分离和定量OXY133的方法在配置有C18管柱的HPLC仪器上进行，所述管柱具有4.6×150mm的维度、3.5微米的粒度、40℃的管柱温度并且以1.0ml/min的梯度流速持续27分钟。设定CAD条件使得氮气流为1.53ml/min，气体压力为35psi，范围设定为200pA，喷雾器温度关闭或为35℃。适用于本申请方法的HPLC-CAD系统的参数总结在下表2和表3中：

表2.HPLC参数

表3.CAD设定

氮气流	1.53mL/min
		气压	35psi
过滤器	没有
		范围	100pA
偏移	0
		喷雾器温度	关闭或35℃

在一些实施例中，本发明提供用于测定OXY133样品的纯度的测定方法，所述方法包含提供包括OXY133、OXY133杂质和移动挥发相的HPLC洗脱剂；从HPLC洗脱剂中产生液滴气溶胶；干燥液滴，获得OXY133的残余颗粒；使OXY133残余颗粒与离子流接触，所述离子流对每个残余颗粒施加尺寸依赖性电荷，以产生电荷信号，所述电信号的水平与OXY133的带电残余颗粒的量成比例；并且测量电信号以测定样品中OXY133的纯度。在其它实施例中，OXY133包含OXY133单水合物。

在再其它实施例中，本发明的方法还包含将OXY133的带电残余颗粒转移到收集器中并且用静电计测量电信号。在其它方面，使用喷雾器从HPLC洗脱剂中产生液滴的气溶胶。

在各个方面，本发明的测定方法可用于分离OXY133单水合物与非对映异构体D1、非对映异构体D2或其它OXY133单水合物杂质，例如用于合成OXY133单水合物的C₂₇H₄₆O₂二醇。在各种实施例中，本发明的测定方法可检测约0.03％到约0.05％w/w或w/v的OXY133单水合物杂质。使用本公开的测定方法可以实现的OXY133峰和D1非对映异构体的分辨率可≥0.8。在许多实施例中，OXY133单水合物的检测极限为约0.01％或1ng。此外，通过使用本公开的测定方法可以实现的OXY133单水合物的纯度为至少96.9％。

在其它方面，适用于本公开方法的CAD检测器的移动挥发相包含乙腈、乙腈和水的混合物、水和甲醇的混合物或水、甲醇和乙腈的混合物。在再其它方面，在用于测定OXY133样品的纯度的方法中，在回收OXY133后，将其置于药物配制物中，例如片剂、胶囊、注射剂、贮库等。

在各种其它实施例中，提供分离OXY133单水合物与药物样品的方法，所述方法包括提供OXY133单水合物参考标准物；提供浓度相当于OXY133单水合物参考标准物的药物样品；通过HPLC-CAD测定参考标准物中OXY133单水合物的量；通过HPLC-CAD测定药物样品中OXY133单水合物的量；并且比较药物样品中OXY133单水合物的量与参考标准物中OXY133单水合物的量。在一些实施例中，在本公开的方法中，参考标准物浓度以含有OXY133和/或OXY133单水合物的至少500μg/mL的量存在。在其它方面，药物样品在体积比为1:1的乙腈:四氢呋喃的溶液中制备。在再其它方面，药物样品包含来自HPLC-CAD的移动挥发相，其为100％水或100％甲醇。

在其它实施例中，通过HPLC-CAD经历分离的OXY133单水合物包含非对映异构体D1、非对映异构体D2、C₂₇H₄₆O₂二醇或OXY133单水合物杂质1。当通过本公开的方法检测时，这些与OXY133或OXY133单水合物相关的已知化合物呈现出如表4中所说明并且如图11所描绘的以下大致保留时间和相对保留时间：

表4.与OXY133有关的化合物

组分和相关化合物	大致保留时间(分钟)	大致相对保留时间(分钟)
			Oxy133(API)	14.0	1.00
杂质1	15.8	1.12
			二醇	20.2	1.42
Oxy133非对映异构体1(D1)	13.6	0.97
			Oxy133非对映异构体2(D2)	14.6	1.04

在各种其它实施例中，提供了用于测定OXY133单水合物样品的纯度的方法，所述方法包含：通过使具有下式的二醇：

与硼烷、过氧化氢和四氢呋喃反应以形成具有下式的氧化固醇或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物来提供氧化固醇：

其中R1和R2包含己基，并且二醇包括(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3-醇，并且水合物是OXY133单水合物；使单水合物经历HPLC以获得包含OXY133单水合物、OXY133单水合物杂质和挥发性移动相的洗脱剂；将HPLC洗脱剂装入CAD检测器中以测定OXY133单水合物的纯度。

在各种其它方面，提供用于测试HPLC-CAD系统的适用性以分析包含OXY133单水合物的药物样品的方法，所述方法包含：运行稀释剂空白注射以获得不受OXY133单水合物区域的干扰的基线；运行至少一个参考标准物溶液，以获得≤2.0％的相对标准偏差；运行至少一种溶液，所述溶液包含定量水平OXY133单水合物溶液、定量水平杂质1、定量水平C₂₇H₄₆O₂二醇溶液；运行第一包围参考标准物溶液；运行至少一种样品溶液；运行第二包围参考标准物溶液。在再其它方面，参考标准物中的OXY133单水合物和第一和第二包围参考标准物对于非对映异构体D1具有≥0.8的分辨率。

在各种实施例中，定量水平注射具有信噪比≥10的可见峰。在再其它实施例中，包围参考标准物的面积在用于测试HPLC-CAD系统对AMD的适用性的六种参考标准物溶液的平均值的±2％内。在若干实施例中，杂质1和C₂₇H₄₆O₂二醇的定量水平注射显示每种化合物在0.5μg/mL浓度下的可见峰不受分析物OXY133峰的区域的干扰。通过在至少每六次样品注射后注射参考标准物，可以在整个上述运行中证明系统精确度。这些标准被鉴定为包围参考标准物(BRS)。此外，每次运行都可以BRS注射结束。

在考量以下实例后，将进一步理解本申请的这些和其它方面，所述实例旨在说明本申请的某些特定实施例，但不打算限制由权利要求书所界定的本申请的范围。

实例

实例1

由醋酸孕烯醇酮制备

在剧烈电磁搅拌和冰浴冷却下，将于THF中的8.25mL正己基氯化镁(2M，16.5mmol)添加到孕烯醇酮乙酸酯于THF中的溶液中。孕烯醇酮乙酸酯溶液含有于4.5mL THF中的1.79g化合物1、孕烯醇酮乙酸酯(5mmol)。添加在2分钟内进行。在添加完成之后，混合物在室温下搅拌3.5小时，在此时混合物已变成凝胶。凝胶然后用饱和NH₄Cl水溶液和MTBE(甲基叔丁基醚)的混合物浸煮。分离有机层并且用水洗涤三次并且蒸发。通过硅胶管柱色谱使用EtOAc(乙酸乙酯)/石油醚混合物(比率70/30)分离残余物，得到化合物2，二醇，呈白色固体状。出于64％分离产率，提取1.29g(3.21mmol)的固体二醇。反应如下A所示：

在400MHz下CDCl₃中二醇的¹H NMR数据说明如下：在图6中δ：0.8-1.9(40H),1.98(m,1H),2.09(m,1H),2.23(m,1H),2.29(m,1H),3.52(m,1H),5.35(m,1H)。图7中100MHz下CDCl₃中二醇的¹³C NMR数据说明如下：d：13.6,14.1,19.4,20.9,22.4,22.6,23.8,24.2,26.4,30.0,31.3,31.6,31.8,31.9,36.5,37.3,40.1,42.3,42.6,44.0,50.1,56.9,57.6,71.7,75.2,121.6,140.8。

所形成的二醇的IUPAC名称为(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3-醇。

实例2

由孕烯醇酮制备

作为实例1的替代方案，可利用与用于将化合物1转化为化合物2相同程序，由下文反应流程B所示的孕烯醇酮制备上文反应流程A的化合物2。在这一程序中，10g的孕烯醇酮转化为7.05g化合物2，这计算为55％产率。

反应流程B

将2500mL的正己基氯化镁(2M，5mol)装入反应器并且使溶液冷却到-5℃。将孕烯醇酮乙酸酯在THF中的溶液以保持内部反应温度低于1℃的速率装入反应器中。孕烯醇酮溶液含有于8升THF中的500g孕烯醇酮(1.4mol)。在完成添加之后，将混合物保持在0℃持续1小时然后使升温到室温过夜。反应混合物变成固体凝胶状块团。另外添加2升THF，随后添加10ml冰乙酸。使反应混合物冷却到5℃并且通过添加350mL冰乙酸(这提供溶液)来淬灭。反应混合物在减压下浓缩成厚糖浆。将化合物溶解于二氯甲烷中、用水洗涤并且最后用饱和碳酸氢钠洗涤。有机层在减压下浓缩成琥珀色油。块团回收率为约800克。粗材料原样用于下一步骤。

所形成的二醇的IUPAC名称为(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3-醇。

实例3

将粗己基二醇产物(800克)溶解于8升THF中，装入反应器并且冷却到-5℃。将6300mL于THF中的硼烷-THF复合物(1M，6.3摩尔，4.5当量)以保持内部反应温度低于1℃的速率装入。在完成添加之后，反应混合物在0℃下搅拌1.5小时然后使升温到室温过夜。反应如下所示。

通过添加10％氢氧化钠(4750mL)和30％过氧化氢(1375mL)的混合物来淬灭反应混合物。淬灭是极其放热的并且需要几个小时完成。内部温度保持在10℃以下。在完成添加淬灭体积之后，将反应混合物保持低温持续1.5小时然后使升温到室温过夜。然后添加8升二氯甲烷。分离有机层并且用7升淡水洗涤，并且在减压下浓缩。产物经分离为在静止时固化的粘性、油性块团。

将产物溶解于4升二氯甲烷中并且置于二氯甲烷中制备的硅胶管柱上。管柱首先用25％乙酸乙酯洗脱以洗脱7-甲基-7-十三基醇副产物。随后，用10％甲醇-乙酸乙酯洗脱管柱以使Oxy133溶剂化。合并收集的馏分，并且在减压下浓缩成蜡状固体。将化合物溶解于丙酮-水混合物(3:1)中并且在减压下浓缩以去除残余的溶剂。所得粗Oxy133用于下一步骤。

替代地，从硼氢化/氧化回收的粘性产物可通过与庚烷一起搅拌来固化，并且通过过滤分离产物。将经分离的产物悬浮于二氯甲烷(7.3mL二氯甲烷/g固体)中。产物通过过滤分离，并且按原样用于下一步骤中。

实例4

通过在回流下将630克粗oxy133溶解到1500ml的3:1丙酮/水混合物中，然后冷却到室温来使Oxy133再结晶。通过真空过滤回收结晶固体并且干燥以得到336g，从化合物1的总产率为28％。所产生的Oxy133是一水合的，并且IUPAC名称为(3S,5S,6S,8R,9S,10R,13S,14S,17S)-17-((S)-2-羟基辛-2-基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊并[a]菲-3,6-二醇(单水合物)。

400MHz下CDCl₃中Oxy133的¹H NMR数据说明如下：δ：0.66(m,1H),0.85(m,10H),1.23(m,18H),1.47(m,9H),1.68(m,4H),1.81(m,1H),1.99(m,1H),2.06(m.1H),2.18(m,1H),3.42(m,1H),3.58(m,1H)。400MHz下CDCl ₃中Oxy133的¹³C NMR数据说明如下：d：13.7,14.0,14.3,21.2,22.5,22.8,23.9,24.4,26.6,30.1,31.1,32.1,32.5,33.9,36.5,37.5,40.4,41.7,43.1,44.3,51.9,53.9,56.5,57.9,69.6,71.3,75.4。Oxy133的红外线光谱数据在3342cm^-1、2929cm^-1、2872cm^-1、2849cm^-1处显示峰。Oxy133的涡轮喷雾质谱数据示出在438.4m/z[M+NH₄]+、420.4m/z(M-H₂O+NH₄]+、403.4m/z[M-H₂O+H]+、385.4m/z[M-2H₂O+H]+处的峰。Oxy133的¹H NMR、¹³C NMR、IR和MS数据分别在图2、3、4和5中示出。

实例5

由孕烯醇酮乙酸酯的替代一容器程序

将100mL正己基氯化镁(2M在THF中，200mmol)装入烧瓶并且冷却到-10℃。逐滴添加含有20g孕烯醇酮乙酸酯(56mmol)于200ml无水THF)中的溶液，同时保持内部反应温度低于-10℃。在完成添加之后，混合物搅拌30分钟然后使升温到室温过夜。在室温下4小时之后，混合物已变成胶状可搅拌块团。将混合物冷却到0℃并且逐滴添加200mL硼烷-THF复合物(1M在THF中，200mmol)，同时维持内部温度低于0℃。在添加完成后，使所得溶液升温到室温过夜。

使混合物冷却到0℃并且通过缓慢添加10％NaOH(190mL)和30％H₂O₂(55mL)的混合物来淬灭。在淬灭完成后，用MTBE(总计800mL)提取混合物，得到乳液。添加盐水并且分离各层。在减压下浓缩有机相成澄清、粘性油。利用先前描述的栓塞管柱进一步纯化油。

在以下实施例中，通过HPLC分析作为API的OXY133或OXY133单水合物在不同早阶段批次中的样品分析，然后在测定方法中用CAD测定OXY133和OXY133相关的杂质。

实例6-HPLC参数和CAD设定

具有适用于本公开方法的CAD检测器、自动取样器、管柱加热器和数据采集系统的合适的HPLC系统包括使用Empower 3软件进行分析的Agilent 1100HPLC与ESA电晕加上带电气溶胶检测器(CAD)。在一些实施例中，所用管柱是Waters XBridge Phenyl，4.6mm×150mm，3.5μm。如果满足系统适用性标准，则可以使用等效管柱。其它标准实验室设备包括能够称重0.01mg的分析天平、包括容量瓶和移液管的实验室A级玻璃器皿以及HPLC螺旋盖小瓶。

在一些方面，适用于本公开的测定方法的试剂和标准物包括已知纯度的Oxy133参考标准物；杂质1相关的化合物标准物；二醇相关的化合物标准物；乙腈(ACN)，HPLC级或等效的；四氢呋喃(THF)，HPLC级或等效的；甲醇(MeOH)，HPLC级或等效的；和水，高纯度，≥18兆欧，适合与HPLC一起使用，例如毫Q水。只要满足系统适用性要求，就可以使用等效材料。HPLC/CAD系统的设定和这些实施例中使用的梯度程序总结在上面的表2和表3中。

实例7-移动相和方法稀释剂的制备

在这一实施例中，制备了如本公开的测定方法所需的移动相A、移动相B和方法稀释剂的溶液。移动相A和移动相B的CAD分析不需要甲酸。但是，如果需要LC-MS进行鉴定或峰纯度分析，则应向每个移动相中添加1％甲酸(HPLC级或等效的)。

通过将100％毫Q水的玻璃储器填充到合适的体积以制备移动相A以覆盖整个分析。这种制剂适合在制备后在环境条件下存储长达一周时使用。移动相B在具有100％甲醇HPLC级或更高级别的玻璃储器中制备。这种溶液适合在环境条件下存储长达三个月。

通过在合适的玻璃容器中合并等体积的乙腈和四氢呋喃制备体积比为1:1的乙腈:四氢呋喃的方法稀释剂，以满足标准物和样品制剂的要求，并且充分混合。当在环境条件下存储时，这种溶液适合存储长达一个月。所有参考和样品溶液都在方法稀释剂中制备。

在以下实例中，制备了参考标准物溶液的标准物溶液、OXY133定量水平溶液、杂质1标准物溶液和二醇标准物溶液。

实例8-OXY133定量水平(QL)溶液的制备

首先通过称重25±0.5mg的Oxy133参考标准物制备Oxy133参考标准物溶液(500μg/mL)。将所得溶液转移到50mL的容量瓶中，在其中溶解，用上面制备的方法稀释剂稀释以定容并且短暂超声处理以完全溶解。Oxy133参考标准物的大致浓度为500μg/mL。(溶液ID：RS500)

为了制备Oxy133QL溶液(0.5μg/mL)，首先通过使用方法稀释剂稀释500μg/mL参考标准物来制备OXY133中间物QL溶液，以获得5μg/mL溶液。这是通过将1mL的Oxy133参考标准物溶液移液到100mL的容量瓶中来完成的，将其用方法稀释剂定容，并且混合以完全溶解。(溶液ID：QL5)使用Method稀释剂稀释5μg/mL的中间物QL(QL5)溶液，得到Oxy133的0.5μg/mL的溶液作为QL溶液。特别地，将1.0mL的Oxy133参考标准物溶液和9.0mL的方法稀释剂混合到具有PTFE衬里盖的玻璃培养管中，从而形成Oxy133QL溶液。(溶液ID：OQL0.5)

实例9-杂质1标准物溶液的制备

杂质1标准物溶液(0.5μg/mL)通过称重5±0.1mg杂质1参考标准物制备，将其称重到玻璃容器中并且将20.0mL的方法稀释剂移液到同一容器中；将所得混合物混合以完全溶解。杂质1储备标准物的大致浓度为250μg/mL。(溶液ID：Imp250)

使用方法稀释剂稀释250μg/mL杂质1储备标准物溶液，得到0.5μg/mL杂质1QL溶液。优选使用Hamilton注射器或正排量移液管将0.050mL的Imp250溶液递送到含有约10mL的方法稀释剂的25mL容量瓶中。用方法稀释剂将所得混合物定容并且混合。(溶液ID：IQL0.5).

实例10-二醇标准物溶液的制备

为了制备二醇标准物溶液(0.5μg/mL)，将5±0.1mg的二醇参考标准物称重到玻璃容器中，将20.0mL的方法稀释剂移液到同一容器中，并且然后将所得混合物混合以完全溶解。二醇储备标准物的大致浓度为250μg/mL。(溶液ID：二醇250)250μg/mL二醇储备标准物溶液使用方法稀释剂稀释，得到0.5μg/mL的二醇QL溶液。使用Hamilton注射器或正排量移液管将0.050mL的二醇250溶液递送到含有约10mL的方法稀释剂的25mL容量瓶中。用方法稀释剂将所得混合物定容并且混合。(容易ID：DQL0.5)

实例11-原料药配制物样品的制备

原料药配制物样品通过将适量的原料药精确称重到容量瓶中来制备，得到与Oxy133参考标准物浓度相当的浓度。然后将方法稀释剂添加到容量瓶的大约一半体积。使用简短的超声处理来溶解原料药，并且以足够的量添加方法稀释剂并且混合。将一部分溶液转移到HPLC小瓶中进行分析。这个样品中的API量可以按每体积的重量来描述。样品浓度计算如下：

这一计算仅可用于API的Oxy133。相关化合物可以每种样品注射中与Oxy133相比的面积百分比和/或mg/mL报告。

实例12-用于分析OXY133的HPLC/CAD系统的适用性

在根据下述方案分析OXY133样品之前成功进行了系统适用性测试。

进行至少两次稀释剂空白注射以确保稳定的基线，其中第二稀释剂空白不受Oxy133峰的区域的干扰。显著干扰定义为在Oxy133峰的保留时间下信噪比(s/n)≥10的任何峰。

随后进行六次参考标准物注射。参考标准物溶液的六次重复注射的峰面积的相对标准偏差或变化系数(％RSD或CV)≤2.0％。

此后，运行如在实例8-10中制备的OXY133 QL、杂质1QL和二醇QL的三个定量水平(QL)标准物溶液。这些之后是一个包围参考标准物、含有OXY133的原料药的六个样品溶液和最终包围参考标准物的运行。这些运行总结如下表5所示：

表5-注射顺序

对于D1非对映异构体，在参考和包围标准物中观察到的Oxy133的美国药典(USP)分辨率≥0.8。QL注射具有可见的峰，USP s/n值≥10。包围参考标准面积在运行开始时注射的六种参考标准物溶液的平均值的±2％范围内。对于杂质1和二醇的QL注射：每次注射显示每种化合物在0.5μg/mL浓度下的可见峰不受分析物OXY133峰区域的干扰。

通过在至少每六次样品注射后注射参考标准物，在整个这些运行中证明了HPLC/CAD系统的精确度。这些标准物被鉴定为包围参考标准物(BRS)。另外，每次运行都以BRS注射结束。

OXY133溶液的上述标准物、参考物和样品的浓度计算如下：

Oxy133标准物浓度计算(mg/mL)

其中：纯度＝Oxy133标准物的纯度

包围参考标准物计算

Oxy133样品浓度计算(μg/mL)

其中：

SA＝样品峰面积

ST＝六次参考标准物注射的平均峰面积

STC＝标准物浓度(μg/mL)

杂质的面积百分比计算(非杂质1或二醇)

其中：

杂质峰面积＝杂质峰的面积

总峰面积＝存在的所有峰的面积的总和

100＝转化为百分比。

本领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本文的教示的精神或范围的情况下，可对本文所述的各种实施例进行各种修改和改变。因此，预期各种实施例涵盖在本发明教示范围内的各种实施例的其它修改和改变。

Claims (20)

1.一种测定OXY133样品的纯度的方法，所述方法包含：

提供包含OXY133、OXY133杂质和移动挥发相的HPLC洗脱剂；

从所述HPLC洗脱剂中产生液滴的气溶胶；

干燥所述液滴，获得OXY133的残余颗粒；

使所述OXY133残余颗粒与离子流接触，所述离子流对所述残余颗粒的每一个施加尺寸依赖性电荷，以产生电信号，所述电信号的水平与OXY133的带电残余颗粒的量成比例；并且测量所述电信号以测定所述样品的OXY133的所述纯度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中OXY133包含OXY133单水合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其还包含将所述OXY133的带电残余颗粒转移到收集器中并且用静电计测量所述电信号。

4.根据权利要求2所述的方法，其中OXY133单水合物杂质包含OXY133杂质1、C₂₇H₄₆O₂二醇、OXY133单水合物的非对映异构体D1和非对映异构体D2。

5.根据权利要求3所述的方法，其中从所述HPLC洗脱剂中产生所述液滴的气溶胶通过喷雾器提供。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述移动挥发相包含乙腈、乙腈和水的混合物、水和甲醇的混合物或水、甲醇和乙腈的混合物。

7.根据权利要求4所述的方法，其中检测到约0.03％到约0.05％的OXY133单水合物杂质。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述OXY133峰和非对映异构体D1的分辨率≥0.8。

9.根据权利要求2所述的方法，其中检测到约0.01％或1ng量的所述OXY133单水合物。

10.根据权利要求2所述的方法，其中OXY133单水合物与非对映异构体D1、非对映异构体D2或其它OXY133单水合物杂质分离。

11.根据权利要求2所述的方法，其中所述OXY133单水合物的纯度为至少96.9％。

12.一种用于测定样品中OXY133单水合物的量的方法，所述方法包含：

提供具有已知量的OXY133单水合物的OXY133单水合物参考标准物，其可通过HPLC-CAD测量；

提供具有未知量的OXY133单水合物的所述样品；

通过HPLC-CAD分离所述样品中OXY133单水合物的量；以及

所述样品中OXY133的量。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述参照标准物包含至少500μg/mL的OXY133单水合物。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述样品在体积比为1:1的乙腈:四氢呋喃溶液中制备。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述样品包含来自所述HPLC-CAD的移动相，其包含水或甲醇。

16.根据权利要求12所述的方法，其中OXY133单水合物包含非对映异构体D1、非对映异构体D2、C₂₇H₄₆O₂二醇或OXY133单水合物杂质1。

17.根据权利要求16所述的方法，其中检测到OXY133单水合物的非对映异构体D1的分辨率≥0.8。

18.根据权利要求12所述的方法，其中OXY133单水合物的保留时间是14.04分钟，非对映异构体D1的保留时间是13.6分钟，并且非对映异构体D2的保留时间是14.6分钟。

19.一种用于测定OXY133单水合物的样品的纯度的方法，所述方法包含：

使具有下式的二醇：

与硼烷、过氧化氢和四氢呋喃反应以形成具有下式的氧化固醇或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：

其中R1和R2包含己基，并且所述二醇包含(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(S)-2-羟基辛-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3-醇(OXY133)，并且所述水合物为单水合物；

使所述单水合物经历HPLC以获得包含OXY133单水合物、OXY133单水合物杂质和挥发性移动相的洗脱剂；以及

将所述HPLC洗脱剂装入CAD检测器中以测定OXY133单水合物的所述纯度。

20.根据权利要求1所述的方法，其中OXY133被回收并且置于药物配制物中。