CN1088756C

CN1088756C - 微生物固定化担体的制备方法及应用

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Publication number: CN1088756C
Application number: CN98125133A
Authority: CN
Inventors: 袁又罡
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-11-26
Filing date: 1998-11-26
Publication date: 2002-08-07
Anticipated expiration: 2018-11-26
Also published as: CN1233659A

Abstract

本发明涉及一种微生物固定化担体的制备方法，以聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)、藻酸钙(ALG)为原料均匀混合后，于固定剂等。(CaCl₂)溶液中胶凝硬化形成球形担体，经摄氧率实验及机械强度测试结果证实，本发明制备的ALG--PEG--PEI多物质担体，除具有良好的耐水性及高孔隙率外，亦有很高的结构稳定性，故适用于废水处理程序中对有机氮与无机氮等的去除，同时亦可应用于生化产品的生产过程中。

Description

微生物固定化担体的制备方法及应用

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种微生物固定化担体的制备方法。

经研究证实，内包性固定化微生物于最小的单位体积内可获得最高的生物质量(Biomass)，而且其对外在环境冲击具有缓冲及保护的效果，故内包性微生物固定化技术应用于污水的生物处理研究和开发应用具有极乐观的前景。

固定化微生物系统应用于污水处理技术的研究，迄今已有十余年的历程，目前已有许多实际应用在工业生产中的成功案例，例如高果糖浆、6-APA、L-氨基酸等生化产品。通常可将微生物固定化技术区分成两大类：第一类为附着性微生物的自然固定化技术；第二类为内包性微生物的人工固定化技术，其中藻酸钙(Calcium alginate)为使用最普遍的担体材料之一，其它较常见的材料还有聚乙二醇(Ployethylene glycol，PEG)、聚乙烯醇(Plyvinylalcohol，PVA)、鹿角藻胶(K-Carrageenan)、琼脂(agar)、明胶(gelatin)等。

但以上材料在使用上仍存在缺点，如聚合物具有生物毒性、机械强度不佳、较难制成有利于一般连续操作式反应器的球形颗粒、以及价格偏高等，因此，若要将固定化技术有效应用于污水处理与生化商品的工业制程上，其成功与否的关键乃在于开发对微生物不具毒性、对酵素活性不会产生干扰，而且成本低廉及具有较高机械强度的担体材料。

聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)及藻酸钙(ALG)等原料对生物不具毒性，在充分混合后，制形容易、机械强度高，而且是低价量大的工业化原料，因此，非常适合作为固定化微生物担体的原料。

近年来，欧美文献及日本、台湾的专利公报已公布种种有关利用不同原料制作担体的技术。例如，将PVA溶液与微生物混合后施以冷冻真空干燥或以冷冻回温法进行胶凝固定(日本专利特开昭57-14129，特开昭61-139385)；施以紫外线照射，形成光交联(photocrosslinking)结构的凝胶方法(日本专利特开平1-454372)；另外，亦有将PVA在硼酸--磷酸盐中二阶段成胶的方法(台湾专利公告号199906)。上述方法虽然可以获得高强度的胶体以作为固定化微生物的担体，但却存在不少缺点有待改进，如在冷冻干燥法中，利用低温将材料脱水至一定的含水率，步骤复杂、费时甚久，而且耗费能源；光交联法则以制作薄膜为佳，事实上并不适合微生物固定化程序；而硼酸--磷酸盐二阶段凝胶硬化法虽然制法简单，而且对微生物的伤害也较小，但其内部结构紧密，容易影响物质传输效果，亦是其主要的缺点。

总而言之，上述既有技术的共同缺点有：1.担体制作费时，工业生产设备庞大，导致生产成本提高，生产能力降低；2.低温、真空及使用硼酸等，对微生物皆属不利；3.结构紧密，影响气体与物质的传输，不利于担体的长期使用。

本发明的目的在于提供一种制备微生物固定化担体的方法，该方法过程简单方便，成本低廉，生物毒性最少，在短时间内即可获得耐水性、机械强度俱高，且具有优异生化活性的微生物固定化担体，且该担体可广泛运用于污水处理领域和生化产业上。

本发明提供的制备微生物固定化担体的方法，包括分别取1～14份(重量份数)的聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)、藻酸钙(ALG)，其余为水补足至100份，制成混合溶液，每100毫升该混合溶液中加入3～10毫升的微生物或酵素浓缩液，并于浓度4～8％(w/v)的氯化钙(CaCl₂)溶液中进行胶凝化和硬化处理，产生一凝胶球体待停留约3～4小时后，以清水淋洗2～3分钟，再重新置入清水中搅拌约6～9小时，得最终所需担体。

本发明的原理与特征在于利用高分子材料(ALG、PEG)与带正电的高分子电解质的交联剂(PEI)形成网状结构，通过与钙离子的交换而达到强化结构的目的，使担体在耐水性与机械强度上都具有相当好的效果。而微生物或酵素则与在具两个以上官能基的网状结构中以架桥结合方式固定，在其结构与活性上几乎不受损害。

本发明得到的是多物质担体，所采用的原料及其适用比例为每100份(重量份数)的混合溶液中：藻酸钙(ALG)1～14份、聚乙二醇(PEG)1～14份、聚乙烯亚胺(PEI)1～14份，其余为水。其中，ALG为一天然多醣类化合物，正二价的盐类离子对溶液具有胶化作用，而PEI为带正电的高分子聚合物，其可与ALG产生电性相吸的特性，可增强担体的结构，至于PEG则具有良好的亲水性，在担体成型后，以水洗方式将其溶出，可以增加担体的通透效率。其中所用聚乙二醇(PEG)的平均分子量最好约1900～2000，聚乙烯亚胺(PEI)的平均分子量最好约70000。

本发明的特点在于首先采用多种原料来制成担体，并以最简单的氯化钙溶液作为固定液即可使之凝胶硬化，在接触时间不长、溶液毒性不高的情况下，微生物或酵素所受到的可能伤害将减少至最低。并且，在整个处理过程中，完全未使用任何对微生物或酵素有害的物质，对微生物的活化不会产生干扰。

本发明进行凝胶及硬化所用的该氯化钙溶液浓度最好是4％(w/v)，浸渍球体的时间约3～4小时，并且该凝胶化及硬化过程同时进行，所需时间为3～4小时，待清水淋洗及6～9小时的搅拌，溶出担体内的PEG，即可置入4℃的冷藏箱中保存备用。

本发明所用的微生物浓缩液是以液态培养基大量培养微生物后，以离心方法浓缩而得到；该微生物可以是细菌、菌类、藻类、原生动植物或它们的混合物；该微生物还可以是活性污泥微生物，而该活性污泥微生物可以取自农业或工业废水所驯化的活性污泥微生物。

本发明也可使用酵素浓缩液，其中该酵素可以为淀粉水解酵素、纤维素酵素、蛋白酵素或葡萄糖异构酵素。

依据本发明所制备的多物质担体除具有良好的耐水性及高孔隙率外，亦有很高的结构稳定性，故适用于废水处理程序中对有机氮与无机氮等的去除，同时亦可应用于生化产品的生产过程中。

本发明制备的担体适合用于废水生物处理的微生物菌群、酵素、微生物工业及动植物细胞等的包覆固定化技术。就微生物而言，硝化细胞、脱硝细胞、石油裂解菌、以及活性污泥、厌氧硝化污泥、甲烷化污泥等微生物菌群；就酵素而言，如淀粉水解酵素、纤维素酵素及蛋白酵素等，皆是本发明担体可行的应用对象。

附图所示为本发明方法的流程示意图。

以下通过实施例详细说明本发明的实施过程及应用中的有意效果和功效，但这些实施例并非用以限制本发明的实施范围，即依其所作的均等变化与修饰例皆应仍属本发明的范围。

实施例1

ALG 3份(重量份数，以下同)、PEG(平均分子量约1900)10份、PEI(平均分子量约70000)5份，其余用水补足到100份，取该混合溶液100毫升，加入3毫升高浓度菌液，充分搅拌均匀，以滴定器滴入4％(w/v)的氯化钙(CaCl₂)固定液中，配合缓慢的搅拌，使上述ALG--PEG--PEI混合液形成直径约3.3～3.6mm的球形颗粒(比重约1.01～1.05，机械强度41.4～48.8％)，于固定液中停留3～4小时后，以清水淋洗2～3分钟，再重新置入清水中以磁石搅拌6～9小时，制成担体135克，与生活污水500ml(总氮浓度为154mg/l，COD210mg/l)混合，置于1000ml烧杯中，在有氧条件下进行处理。七日后，担体粒径降为2.4～2.8mm，比重1.02～1.09，机械强度33.5～61.2，而总氮则降为0.2mg/l，COD降为7.8mg/l。

实施例2

ALG 6份(重量份数，以下同)、PEG 12份、PEI 4份，其余用水补足到100份，取该混合溶液100毫升，加入4毫升高浓度蛋白酵素液，充分搅拌均匀，以滴定器滴入5％(w/v)的氯化钙(CaCl₂)固定液中，配合缓慢的搅拌，使上述ALG--PEG--PEI混合液形成直径约3.3～3.6mm的球形颗粒(比重约1.01～1.05，机械强度41.4～48.8％)，于固定液中停留3～4小时后，以清水淋洗2～3分钟，再重新置入清水中以磁石搅拌6～9小时，制成担体128克。于0.2％(w/v)的人工营养液(Nutrient broth)中曝气活化5小时，之后称取12克担体，置入300ml的BOD瓶内(此时瓶内担体填充率为4％)，将已曝气达饱和的营养液填充满该BOD瓶。将已校正的容氧测定仪(SVNTEX D.0 meter，SD-70)探测棒插入BOD瓶内，以磁石搅拌器(Fargo MS-90)(调速至4)稳定搅拌，当容氧值稳定时开始记录。于第96小时时，担体的摄氧率仍有45.4～49.3mg/hr，显示担体的透氧率与活性极高。

实施例3

ALG 5份(重量份数，以下同)、PEG 8份、PEI 5份，其余用水补足到100份，取该混合溶液100毫升，加入6毫升高浓度活性污泥，充分搅拌均匀，以滴定器滴入8％(w/v)的氯化钙(CaCl₂)固定液中，配合缓慢的搅拌，使上述ALG--PEG--PEI混合液形成直径约3.3～3.6mm的球形颗粒(比重约1.01～1.05，机械强度41.4～48.8％)，于固定液中停留3～4小时后，以清水淋洗2～3分钟，再重新置入清水中以磁石搅拌6～9小时，制成担体130克。取100颗担体置于100ml的烧杯中共四组，分别加入80ml生活污水，并以磁石搅拌器稳定搅拌，每隔24小时更新各烧杯内的污水一次，同时记录上浮的颗粒数目，连测15日后，上浮颗粒数小于1％，显示担体的传质效果极佳。

实施例4

ALG 10份(重量份数，以下同)、PEG 5份、PEI 10份，其余用水补足到100份，取该混合溶液100毫升，加入5毫升高浓度蛋白酵素液，充分搅拌均匀，以滴定器滴入6％(w/v)的氯化钙(CaCl₂)固定液中，配合缓慢的搅拌，使上述ALG--PEG--PEI混合液形成直径约3.3～3.6mm的球形颗粒(比重约1.01～1.05，机械强度41.4～48.8％)，于固定液中停留3～4小时后，以清水淋洗2～3分钟，再重新置入清水中以磁石搅拌6～9小时，制成担体125克。各取4克担体共12组，分别置入(0.1％、0.5％、1.0％)MnSO₄·H₂O、(0.1％、0.5％、1.0％)CuSO₄·5H₂O、(0.1％、0.5％、1.0％)Al₂(SO₄)₃·14H₂O及(O.1％、0.5％、1.O％)FeCl₃·6H₂O溶液中，静置3日，结果显示，锰(Mn²⁺)、铝(Al³⁺)、铁(Fe³⁺)等离子对担体的机械强度，随各离子浓度的增加而增加，但铜(Cu²⁺)的影响则相反，即随着铜离子浓度的增加，担体的机械强度反而呈减弱的趋势。

实施例5

ALG 12份(重量份数，以下同)、PEG 10份、PEI 7份，其余用水补足到100份，取该混合溶液1000毫升，加入100毫升高浓度菌液，充分搅拌均匀，以滴定器滴入4％(w/v)的氯化钙(CaCl₂)固定液中，配合缓慢的搅拌，使上述ALG--PEG--PEI混合液形成直径约3.3～3.6mm的球形颗粒(比重约1.01～1.05，机械强度41.4～48.8％)，于固定液中停留3～4小时后，以清水淋洗2～3分钟，再重新置入清水中以磁石搅拌6～9小时，制成担体1270克。取1000ml烧杯7个，分别加入担体0、50、100、150、200、250、300克，再以新鲜的生活污水加入(各100ml)，使各烧杯的担体填充率分别为0、5％、10％、15％、20％、25％及30％。以磁石搅拌器及曝气机对各烧杯进行等速搅拌(100rpm)及等量曝气(498cm³Air/min)，3、6、9、12小时后，停止搅拌及曝气，测量COD、NH₃-N、NO₃-N的值，结果当水中停留时间为9小时时，10～30％的担体填充率的烧杯中担体COD去除率均接近80％，而以15％(81.6％去除率)与20％(去除率82.6％)最好；而NH₃-N的去除率，在填充率25％、停留时间12小时之时，达到95.5％为最佳；NO₃-N的最佳去除率为97.8％，条件为填充率15％、停留时间12小时。

实施例6

ALG 10份(重量份数，以下同)、PEG(平均分子量约2000)10份、PEI(平均分子量约70000)10份，其余用水补足到100份，取该混合溶液100毫升，加入8毫升高浓度菌液，充分搅拌均匀，以滴定器滴入4％(w/v)的氯化钙(CaCl₂)固定液中，配合缓慢的搅拌，使上述ALG--PEG--PEI混合液形成直径约3.3～3.6mm的球形颗粒(比重约1.01～1.05，机械强度41.4～48.8％)，于固定液中停留3～4小时后，以清水淋洗2～3分钟，再重新置入清水中以磁石搅拌6～9小时，制成担体128克。于上流式曝气流化床反应槽(Upflow Aeration FluidizedBed Reactor，UAFBR)中填充15％担体，水力停留时间9小时，与国立云林科技大学污水处理厂(采用延长式曝气活性污泥法，水力停留时间约22小时)进行同步比较，实验连续进行60天。结果，污水厂的COD平均去除率为90.3％，NH₃-N的平均去除率为96.1％，而NH₃-N则有累计现象；充填担体的UAFBR的COD平均去除率为81.4％，NH₃-N的平均去除率为91.4％，而NH₃-N则比污水厂减少50ml/L，显示固定化微生物担体在好氧条件下操作仍有脱氧能力，且于较短水力停留时间内即能获得对有机物的良好去除效率。在连续操作60天后，担体的外型依然完整，富于弹性，且不易碎裂。

Claims

1、一种微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：分别取1～14重量份的聚乙烯亚胺、聚乙二醇、藻酸钙，其余为水补足至100份，制成混合溶液，每100毫升该混合溶液中加入3～10毫升的微生物或酵素浓缩液，并于浓度4～8％w/v的氯化钙溶液中进行胶凝化和硬化处理，产生一凝胶球体，待停留约3～4小时后，以清水淋洗2～3分钟，再重新置入清水中搅拌约6～9小时，得最终所需担体。

2、根据权利要求1所述的微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：所用聚乙二醇的平均分子量约为1900～2000，聚乙烯亚胺的平均分子量约为70000。

3、根据权利要求1所述的微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：进行凝胶及硬化所用的该氯化钙溶液浓度最好是4％w/v，浸渍球体的时间约3～4小时。

4、根据权利要求1所述的微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：该凝胶化及硬化过程同时进行，所需时间为3～4小时。

5、根据权利要求1所述的微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：该微生物浓缩液是以液态培养基大量培养微生物后，以离心方法浓缩而得到。

6、根据权利要求1或5所述的微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：该微生物可以是细菌、菌类、藻类、原生动植物或它们的混合物。

7、根据权利要求1所述的微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：该微生物还可以是活性污泥微生物。

8、根据权利要求7所述的微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：该活性污泥微生物可以取自农业或工业废水所驯化的活性污泥微生物。

9、根据权利要求1所述的微生物固定化担体的制备方法，其特征在于：该酵素浓缩液可以为淀粉水解酵素、纤维素酵素、蛋白酵素或葡萄糖异构酵素浓缩液。