CN108863743A - 辅酶q10的提取纯化方法及由其制备的辅酶q10 - Google Patents

Abstract

本发明涉及辅酶Q10的提取纯化方法及由其制备的辅酶Q10。该方法从辅酶Q10菌体中提取纯化辅酶Q10，包括提取、沉淀、脱色和层析精制步骤，针对性地去除了细菌色素、非极性脂类、中性脂类、极性脂类以及醌类同系物等杂质，操作步骤简单、产品损失少，产品辅酶Q10的纯度可达到99.8％以上，总收率可达到98.5％以上。

Description

辅酶Q10的提取纯化方法及由其制备的辅酶Q10

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种辅酶Q10的高效提取纯化方法及由其制备的辅酶Q10。

背景技术

辅酶Q10作为抗氧化剂在人体内可去除自由基，具有抗衰老和提高心血管免疫力的保健作用，因此对其制备过程的研究具有较高的工业价值。

目前辅酶Q10产品通过发酵提取的方式获得，主要的生产商有厦门金达威、日本KANEKA公司、神州生物、丽珠集团、浙江医药和新和成等企业。辅酶Q10是脂溶性物质，水溶性差，所以目前的大部分提取工艺以非极性溶剂提取为主，例如石油醚，正己烷，当然为了提取完全，也可使用混合溶剂，例如专利文献1公开了正己烷和异丙醇的混合溶剂，专利文献2公开了丙酮和水的混合溶剂等；在提取出辅酶Q10的同时，其他脂溶性杂质也会一并提取出，包括细菌色素、非极性脂类、中性脂类、极性脂类以及醌类同系物；同时，随辅酶Q10一并提取出的这些脂溶性杂质的含量会随着提取溶剂极性的增大而增多，有时杂质的含量要远大于提取出的辅酶Q10的含量，这给分离纯化带来更大的挑战。

已报道的文献中较多的工艺采用提取后直接层析过柱进行纯化，例如专利文献3和4，这种做法几乎不可能实现工业化，原因在于大量杂质会不可逆吸附于硅胶上，造成层析硅胶的活性位点被占据，套用次数低而导致成本上升；另一种做法是提取后直接进行结晶纯化，该方法会导致结晶母液中杂质含量高且成分复杂，不利于母液中产品的回收；还有报道将提取后的辅酶Q10粗品采用碱水洗的工艺进行纯化，例如专利文献5，其缺点在于脂溶性杂质中含有大量可乳化杂质，在操作过程中会造成严重的乳化而带走产品，降低收率。

综上所述，目前已报道的纯化工艺存在以下问题：杂质分布不明确、硅胶层析前处理工艺效果差、工艺设计不当导致乳化现象、结晶母液复杂处理困难等。

现有技术文献：

专利文献1：US2016/0304915A1

专利文献2：US2007/0025976A1

专利文献3：US9315839B2

专利文献4：CN103819326A

专利文献5：CN102557912A

发明内容

发明要解决的问题

为解决以上技术问题，本发明提出了一种辅酶Q10的提取纯化方法，包括提取、沉淀、脱色和精制步骤。本发明通过对提取、沉淀、脱色以及精制步骤的工艺条件进行特殊限定，有效去除了辅酶Q10制备过程中存在的强极性杂质、极性脂类杂质、色素、中性和非极性脂类杂质，以及醌类同系物等杂质。

用于解决问题的方案：

一种辅酶Q10的提取纯化方法，具体的，包含如下步骤：

i)对辅酶Q10菌体进行提取，提取体系是非极性有机溶剂、极性有机溶剂和水的组合；

ii)将步骤i)得到的提取物与酮类溶剂混合以沉淀去除杂质；

iii)将步骤ii)得到的去除杂质后的处理物采用吸附剂吸附或结晶进行脱色；以及

iv)将步骤iii)得到的脱色物进行层析精制，得到提取纯化后的辅酶Q10。

本发明方法的步骤i)的提取体系中非极性有机溶剂、极性有机溶剂和水的体积比为6～10:2～6:1，优选为7～9:2～4:1。所述提取导致分层，将分离得到的油相脱除溶剂后，得到辅酶Q10提取物。

本发明方法的步骤i)的非极性有机溶剂为环己烷，乙醚，异丙醚，异辛烷，正己烷或石油醚中的至少一种，优选为环己烷、正己烷或石油醚，所述极性有机溶剂为丙酮，乙腈，乙酸乙酯，甲醇，乙醇或异丙醇中的至少一种，优选为丙酮、乙腈或乙酸乙酯，所述水为所述细菌中的水分或/和添加的水。

本发明步骤i)中提取体系与辅酶Q10菌体的体积质量比以mL/g表示为10～20:1，优选为10～18:1，更优选为10～15:1。

本发明方法的步骤ii)的酮类溶剂和所述步骤i)得到的辅酶Q10提取物的体积质量比以mL/g表示为1～30:1，优选为1～20:1，更优选为5～10:1，所述酮类溶剂为丙酮、丁酮、2-戊基酮或甲基异丁基酮中的至少一种，优选为丙酮或丁酮。

本发明方法的步骤iii)的吸附剂为活性白土、硅藻土或活性炭中的至少一种，优选活性白土；所述吸附剂用量为辅酶Q10质量的0.1～100倍，优选为0.1～40倍，更优选为0.3～5倍。

本发明方法的步骤iii)所述的结晶脱色采用醇类溶剂和酮类溶剂组成的混合体系，所述混合体系中的醇类溶剂与酮类溶剂的体积比为0.1～9:1，优选为0.5～7:1，更优选为2～6:1，所述醇类溶剂为甲醇，乙醇或异丙醇中的至少一种，优选为乙醇，所述酮类溶剂为丙酮、丁酮、2-戊基酮或甲基异丁基酮中的至少一种，优选为丙酮或丁酮。

本发明方法的步骤ii)中所述的去除杂质后的处理物可以为过滤步骤ii)中沉淀的杂质得到的含有辅酶Q10的滤液，或将过滤步骤ii)中沉淀的杂质得到的含有辅酶Q10的滤液脱除溶剂后，得到的滤液浓缩物。

本发明方法的步骤iii)中所述结晶使用的混合体系与辅酶Q10的体积质量比以mL/g表示为5～35:1，优选为10～30:1，更优选为15～22:1，所述结晶的温度为-10～25℃。

本发明方法的步骤iv)包括：将所述步骤iii)得到的脱色物(即，辅酶Q10粗品)溶解于非极性溶剂，上样，通过层析柱进行纯化，用非极性有机溶剂和极性有机溶剂组成混合溶剂作为洗脱剂，得到辅酶Q10。

本发明方法的步骤iv)中，所述非极性有机溶剂为石油醚，乙醚，正己烷或异辛烷中的至少一种，优选为石油醚或正己烷，所述极性有机溶剂为异丙醇，乙醇，1,4-二氧六环，乙酸乙酯或丙酮中的至少一种，优选为异丙醇或乙酸乙酯，所述层析柱中的固定相为硅胶，流动相为非极性有机溶剂和极性有机溶剂的混合溶剂。

根据本发明方法制备的辅酶Q10的收率可达到98.5％以上，纯度达到99.8％以上。

发明的效果

1)本发明的提取纯化方法可显著而有效地去除多种杂质，包括细菌色素、非极性脂类、中性脂类、极性脂类以及醌类同系物，目标产物辅酶Q10的损失小，总收率可保持在98.5％以上，纯度达到99.8％以上；

2)本发明的提取纯化方法还可解决现有技术中碱洗步骤出现的乳化问题，通过对提取、沉淀、脱色以及精制步骤的工艺条件进行特殊限定，有效去除上述杂质，将细菌中的辅酶Q10高效地提取纯化出来。本发明方法的步骤简单，成本低，具有竞争优势，适合于工业化生产。

附图说明

图1为使用本发明方法分离纯化后的辅酶Q10产物的液相色谱图，其中，辅酶Q10的色谱峰在大约9.8min处。

具体实施方式

本发明方法中的提取原料辅酶Q10可来自于任何发酵细菌，本领域常规使用的辅酶Q10发酵生产的细菌均可用于本发明。所述发酵细菌可选自红螺菌属(Rhodospirillum)，例如深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、需盐红海菌(Rhodothalassium salexigens)、盐场红螺菌(Rhodospirillum salinarum)等；红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，例如沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonas palustris)、嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonasacidophila)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)、血色红假单胞菌(Rhodopseudomonas rutila)、生芽红假单胞菌(Rhodopseudomonas blastica)等；红细菌属(Rhodobacter)，例如球形红细菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、维氏红细菌(Rhodobacter veldkampii)、嗜硫红细菌(Rhodobacter sulfidophila)、亚德里亚红细菌(Rhodobacter adriaticus)等；红球状菌属(Rhodopila)，例如球形红球形菌(Rhodopilaglobiformis)等；红微菌属(Rhodomicrobium)，例如万尼氏红微菌(Rhodomicrobiumvannielii)等，本发明所使用的发酵细菌不限于此。

本发明方法的步骤i)中所述的辅酶Q10菌体可以为湿菌体或者经过干燥的菌体；优选的，可以将所述菌体进行简单的破壁操作，例如研磨或碾磨。

本发明方法的步骤i)所使用的提取体系在不影响本发明效果的情况下不受限制，只要是非极性有机溶剂、有机溶剂与水形成的混合溶剂，且能够使提取液分层，例如形成油相与水相，而辅酶Q10溶解于油相即可。提取液分层后，上层为包含辅酶Q10的油相，下层为含有菌渣的水相。回收油相中的有机溶剂后，即可得到含辅酶Q10的提取物。优选地，非极性有机溶剂为环己烷，乙醚，异丙醚，异辛烷，正己烷或石油醚中的至少一种，极性有机溶剂为丙酮，乙腈，乙酸乙酯，甲醇，乙醇或异丙醇中的至少一种，水为发酵细菌中的水分或/和添加的水。所述细菌中的水分以细菌烘干前后的失重来计算(水量＝细菌烘前质量-细菌烘后质量)。

在上述步骤i)中，所述提取体系中非极性有机溶剂、极性有机溶剂和水的配比也不影响本发明效果的情况下不受限制，只要能使提取液分层，例如形成油相与水相，且使辅酶Q10溶解于油相即可。优选地，非极性有机溶剂、极性有机溶剂和水的体积比为6～10:2～6:1，更优选为7～9:2～4:1。本发明方法对所述提取体系与辅酶Q10菌体的使用比例也没有特别限制，优选混合溶剂与辅酶Q10菌体的体积质量比为10～20:1，更优选为10～18:1，最优选为10～15:1。

本发明方法的步骤ii)中所使用的酮类溶剂在不影响本发明效果的情况下不受限制，只要能溶解辅酶Q10，但不溶解或难溶解脂溶性极性脂类杂质，进而将辅酶Q10与该类杂质分离即可。脂溶性极性脂类杂质因不溶于酮类溶剂而沉淀，经过简单过滤后将其除去，从而进一步纯化辅酶Q10产物。所述酮类溶剂优选为丙酮、丁酮、2-戊基酮或甲基异丁基酮中的至少一种，所述酮类溶剂与步骤i)得到的提取物的质量配比也在不影响本发明效果的情况下不受限制，优选为1～30:1，更优选为1～20:1，最优选为5～10:1。

本发明方法的步骤iii)可为吸附剂脱色，所使用的吸附剂在不影响本发明效果的情况下不受限制，只要能对色素类杂质具有选择性吸附去除功能，从而能有效分离辅酶Q10和色素类杂质即可。所述吸附剂优选为活性白土、硅藻土或活性炭中的至少一种。进一步的，优选为活性白土。活性炭脱色的缺点在于，会造成产品不可逆吸附，从而导致收率损失，但是活性白土、硅藻土或其组合吸附则可以很好地解决该问题。步骤iii)可进一步去除随辅酶Q10一起提取出的色素类物质。所述吸附方法可以使用层析色谱脱色、混合后过滤脱色等方法。所述的吸附剂用量在不影响本发明效果的情况下不受限制，优选地，以过滤步骤ii)沉淀的杂质后得到的滤液中含有的辅酶Q10或浓缩步骤ii)的所述滤液后得到的辅酶Q10计，所述吸附剂用量为辅酶Q10质量的0.1～100倍，更优选为0.1～40倍，最优选为0.3～5倍。

本发明方法的步骤iii)还可以为结晶脱色，所使用的醇类溶剂和酮类溶剂组成的混合体系在不影响本发明效果的情况下不受限制，只要辅酶Q10可微溶于醇类溶剂，而色素易溶于酮类溶剂，进而有效分离辅酶Q10和色素即可。优选地，所述醇类溶剂为甲醇，乙醇或异丙醇，所述酮类溶剂为丙酮、丁酮、2-戊基酮或甲基异丁基酮。所述混合体系中醇类溶剂与酮类溶剂的体积比在不影响本发明效果的情况下不受限制，优选醇类溶剂：酮类溶剂的体积比为0.1～9:1，更优选为0.5～7:1，最优选为2～6:1。

所述的去除杂质后的处理物可以为过滤步骤ii)中沉淀的杂质得到的含有辅酶Q10的滤液，或将过滤步骤ii)中沉淀的杂质得到的含有辅酶Q10的滤液脱溶后，得到的滤液浓缩物。所述的结晶脱色使用的混合体系与辅酶Q10的体积质量比在不影响本发明效果的情况下不受限制，优选为5～35:1，更优选为10～30:1，最优选为15～22:1。

所述结晶温度在不影响本发明效果的情况下不受限制，优选-10～25℃，更优选为-8～15℃，最优选为-5～5℃。

本发明方法的步骤iv)是使用层析技术对中性和非极性脂类以及醌类同系物进行去除的过程，本领域常规的层析技术均可用于本发明，优选地，使用硅胶层析法。将步骤iii)脱色得到的辅酶Q10溶解于非极性溶剂，上样、加入硅胶填充的层析柱中，用非极性有机溶剂和极性溶剂组成混合溶剂为洗脱剂；回收层析得到的溶液，得到进一步纯化的辅酶Q10产品。

上述步骤iv)中所使用的非极性溶剂、非极性有机溶剂和极性有机溶剂在不影响本发明效果的情况下不受限制。用于溶解步骤iii)脱色得到的辅酶Q10的非极性溶剂只要能达到溶解辅酶Q10的目的即可，本领域常规的非极性溶剂均可使用，例如石油醚，乙醚，正己烷，异辛烷等。用于洗脱的非极性有机溶剂优选为石油醚，乙醚，正己烷或异辛烷中的至少一种，极性有机溶剂优选为异丙醇，乙醇，1,4-二氧六环，乙酸乙酯，丙酮中的至少一种。所述的非极性有机溶剂与极性有机溶剂的体积比在不影响本发明效果的情况下不受限制，优选体积比为10～100:1，更优选为20～80:1，最优选为30～70:1。

本发明方法的步骤iv)中使用硅胶层析柱，对于硅胶的规格没有限制，只要可实现本发明即可。优选地，硅胶规格为：比表面积为300～800m²/g，孔径为6～12nm。

上述本发明方法的各步骤中所涉及的辅酶Q10含量的检测可采用任何方法，优选地，使用高效液相色谱法(HPLC)检测，HPLC测试条件如下：

色谱柱为C18柱，150mm×4.6mm，流速1mL/min，检测波长275nm，流动相：乙腈/乙醇＝50/50(v/v)。

绘制标准曲线：取不同质量的辅酶Q10纯品于容量瓶中，乙醇溶解定容，用高效液相检测，绘制标准曲线。

辅酶Q10含量的检测：取定量待测物，乙醇溶解定容，用高效液相检测，计算待测物中辅酶Q10的外标含量。辅酶Q10的色谱峰在大约9.8min处。

以下结合实施例对本发明进行详细说明，本发明不限于这些实施例。

实施例1

i)提取

取辅酶Q10菌体780g(辅酶Q10含量为5.0％，水分含量为2.1％)，经简单研磨后，加入正己烷：甲醇：水的体积比为9:3:1(v/v/v)的混合溶剂8L。控温25℃，机械搅拌后静置分层，上层为含有产品的正己烷相，下层为含有菌渣的甲醇/水溶液。分离油水两相后，上层液在40℃下在旋转蒸发仪中蒸发溶剂得到辅酶Q10提取物100.14g，测得辅酶Q10含量为38.9％，收率为99.8％。下层含有菌渣的甲醇/水溶液经过沉降、过滤后进行固液分离，溶剂可回收再使用。ii)沉淀

将提取步骤中获得的辅酶Q10提取物在烧瓶中熔融，加入500mL的工业丁酮。室温下机械搅拌30min，抽滤，用丁酮洗涤3遍，洗涤液一并抽滤，滤液旋转蒸发脱除溶剂、称重，得去除杂质后的处理物55.83g，测得辅酶Q10含量为69.5％，收率为99.6％。

iii)结晶脱色

取沉淀步骤获得的去除杂质后的处理物，加入760mL的混和溶剂(V_丙酮：V_乙醇＝1：4)，于30℃冷阱中搅拌溶解，完全溶解后保温30min；以1℃/3min的速率降温，温度降为20℃，瓶底有大量晶体颗粒析出，保温30min；以1℃/3min的降温速率再次降温，降至-5℃，保温3h；抽滤，混合溶剂洗涤三次，烘干得脱色物46.90g，测得辅酶Q10的含量为82.7％，收率为99.9％。

iv)层析精制

将52.6g 200～300目的层析硅胶装入柱长为45cm、柱外径为5.5cm的玻璃层析柱。在结晶脱色步骤获得的脱色物中加入石油醚加热溶解完全，冷却至室温后上样。用含有1.5％乙酸乙酯的石油醚溶液作为洗脱剂进行洗脱，洗脱流速为7.2mL/min，分段接洗脱液，将主洗脱液合并，旋转蒸发脱除溶剂、称重，得辅酶Q10产品38.76g，测得辅酶Q10纯度为99.8％，收率为99.7％，总收率为99.2％。图1示出了HPLC检测的最终的辅酶Q10样品的谱图，其中，辅酶Q10的出峰位置在9.8min处。

实施例2

以与实施例1相同的方式进行辅酶Q10提取纯化的步骤i)和步骤ii)的操作，其中步骤i)提取后获得的辅酶Q10提取物为98.54g，辅酶Q10含量为39.5％，收率为99.8％，步骤ii)沉淀后获得的去除杂质后的处理物为56.48g，辅酶Q10含量为68.7％，收率为99.7％。将该去除杂质后的处理物进行如下步骤iii)的吸附脱色操作。

首先，将该56.48g去除杂质后的处理物溶于800mL正己烷，然后在φ7cm布氏漏斗底端铺2层滤纸，再取30.86g粉末型活性白土，加正己烷铺在滤纸上，最后在填料上铺1层滤纸。将溶于正己烷的辅酶Q10溶液用布氏漏斗抽滤，直到滴下的液体没有颜色时停止抽滤。将滤液旋转蒸发脱除溶剂、称重，得脱色物46.69g，测得辅酶Q10含量为82.6％，收率为99.4％。

以与实施例1的步骤iv)相同的方式，将所得脱色物进行层析精制，由此获得辅酶Q10产品38.53g，测得辅酶Q10纯度为99.8％，收率为99.7％，上述各步骤的总收率为98.6％。

实施例3

以与实施例1的步骤i)相同的方式提取辅酶Q10，除了使用环己烷：乙酸乙酯：水的体积比为8:5:1(v/v/v)的混合溶剂外。分离油水两相并旋转蒸发后得到的辅酶Q10提取物为100.01g，测得辅酶Q10含量为38.8％，收率为99.5％。

实施例4

以与实施例1的步骤i)相同的方式提取辅酶Q10，获得辅酶Q10提取物102.65g，测定辅酶Q10含量为37.8％，收率为99.5％。接下来以与实施例1的步骤ii)相同的方式进行沉淀操作，除了用2-戊基酮代替工业丁酮外。抽滤并旋转蒸发后得到去除杂质后的处理物54.74g，测得辅酶Q10含量为70.6％，收率为99.6％。

实施例5

以与实施例2的步骤i)和步骤ii)相同的方式进行提取和沉淀操作，获得去除杂质后的处理物56.11g，测得辅酶Q10含量为69.3％，收率为99.6％。对该去除杂质后的处理物进行实施例2的步骤iii)的吸附脱色操作，除了以硅藻土代替活性白土外。抽滤并旋转蒸发后得到脱色物47.08g，测得辅酶Q10含量为82.1％，收率为99.4％。

实施例6

以与实施例2的步骤i)和步骤ii)相同的方式进行提取和沉淀操作，获得去除杂质后的处理物55.87g，测得辅酶Q10含量为69.4％，收率为99.5％。对该去除杂质后的处理物进行实施例2的步骤iii)的吸附脱色操作，除了以活性炭代替活性白土外。抽滤并旋转蒸发后得到辅酶Q10粗品47.01g，测得辅酶Q10含量为81.8％，收率为99.2％。

实施例7

以与实施例1的步骤i)和步骤ii)相同的方式进行提取和沉淀操作，获得去除杂质后的处理物56.15g，测定辅酶Q10含量为69.2％，收率为99.7％。对该去除杂质后的处理物以与实施例1的步骤iii)相同的方式进行结晶脱色，除了加入780mL的混和溶剂(V_丁酮：V_乙醇＝1：1)外。结晶完毕，抽滤，混合溶剂洗涤三次，烘干得脱色物47.05g，测得辅酶Q10含量为82.0％，收率为99.3％。

实施例8

以与实施例1的步骤i)和步骤ii)相同的方式进行提取和沉淀操作，获得去除杂质后的处理物56.01g，测定辅酶Q10含量为69.3％，收率为99.6％。对该去除杂质后的处理物以与实施例1的步骤iii)相同的方式进行结晶脱色，除了加入850mL的混和溶剂(V_2-戊基酮：V_甲醇＝1：6)外。结晶完毕，抽滤，混合溶剂洗涤三次，烘干得脱色物46.48g，测得辅酶Q10含量为83.0％，收率为99.4％。

实施例9

以与实施例1的步骤i)至步骤iii)相同的方式进行提取、沉淀和结晶操作，获得脱色物46.80g，测定辅酶Q10含量为82.7％，收率为99.7％。以与实施例1的步骤iv)相同的方式进行层析精制，除了以正己烷代替石油醚，用3.0％异丙醇的正己烷溶液代替1.5％乙酸乙酯的石油醚溶液作为洗脱剂以外。将主洗脱液合并旋转蒸发脱除溶剂、称重，得到辅酶Q10产品38.51g，测得辅酶Q10纯度为99.8％，收率为99.3％，总收率为98.5％。

实施例10

以与实施例1的步骤i)相同的方式进行提取操作，获得辅酶Q10提取物98.59g，测定辅酶Q10含量为39.4％，收率为99.6％。将所得提取物以与实施例1的步骤ii)相同的方式进行沉淀，抽滤后得到含辅酶Q10的滤液490.6g，测得辅酶Q10含量为7.9％，收率99.8％。将所得滤液进行实施例1的步骤iii)的结晶脱色，获得脱色物46.51g，辅酶Q10的含量为83.0％，收率为99.6％。进一步地，对所得脱色物进行实施例1的步骤iv)的层析精制，获得辅酶Q10产品38.53g，辅酶Q10含量为99.8％，收率为99.6％，总收率为98.6％。

比较例1

以与实施例1的步骤i)相同的方式提取辅酶Q10，除了正己烷：甲醇：水的体积比为5:3:1(v/v/v)之外。分离油水两相并旋转蒸发后得到辅酶Q10提取物98.75g，测得辅酶Q10含量为32.0％，收率为81.0％。

比较例2

以与实施例1的步骤i)相同的方式提取辅酶Q10，除了环己烷：乙醇：水的体积比为7:1:1(v/v/v)之外。分离油水两相并旋转蒸发后得到辅酶Q10提取物99.17g，测得辅酶Q10含量为31.5％，收率为80.1％。

比较例3

以与实施例1的步骤i)相同的方式进行辅酶Q10的提取，得到101.02g辅酶Q10提取物，测得辅酶Q10含量为38.5％，收率为99.7％。在1000mL烧瓶中加入300ml正己烷溶解，加入300ml水，室温机械搅拌30min，静置1小时分层，可以观察到油层、乳化层和水层，分层后将油层旋转蒸发脱除溶剂、称重，得到辅酶Q10 65.05g，测得辅酶Q10含量为45.5％，收率为76.1％，总收率为75.9％。

比较例4

以与实施例1的步骤i)和步骤ii)相同的方式进行提取和沉淀操作，获得去除杂质后的处理物56.05g，测得辅酶Q10含量为69.3％，收率为99.7％。对该去除杂质后的处理物以与实施例1的步骤iii)相同的方式进行结晶脱色，除了以乙醇代替丙酮与乙醇的混合溶剂外。结晶完毕，抽滤，混合溶剂洗涤三次，烘干得辅酶Q10 48.90g，测得辅酶Q10含量为70.7％，收率为89.0％。

比较例5

以与实施例1的步骤i)和步骤ii)相同的方式进行提取和沉淀操作，获得去除杂质后的处理物57.11g，测定辅酶Q10含量为67.8％，收率为99.8％。对该去除杂质后的处理物以与实施例1的步骤iii)相同的方式进行结晶脱色，除了以异丙醇代替丙酮与乙醇的混合溶剂外。结晶完毕，抽滤，混合溶剂洗涤三次，烘干得辅酶Q10 47.18g，测得辅酶Q10含量为72.3％，收率为88.1％。

比较例6

以与实施例1的步骤i)和步骤ii)相同的方式进行提取和沉淀操作，获得去除杂质后的处理物56.07g，测定辅酶Q10含量为69.2％，收率为99.6％。对该去除杂质后的处理物以与实施例1的步骤iii)相同的方式进行结晶脱色，除了混和溶剂V_丁酮：V_乙醇的体积比为1:12外。结晶完毕抽滤，混合溶剂洗涤三次，烘干得辅酶Q10 46.51g，测得辅酶Q10含量为79.0％，收率为94.7％。

比较例7

取辅酶Q10菌体780g(辅酶Q10含量为5.0％，水分含量为2.1％)，以与实施例1相同的方式进行步骤i)的提取操作，获得100.11g辅酶Q10提取物，辅酶Q10含量为38.8％，收率为99.6％。向该提取物中加入500mL正己烷使其溶解，再加入500mL水，室温搅拌，往提取液中滴加100mLNaOH溶液(1.5mol/L)进行皂化，静置分层，分液漏斗分离油水两相后，有机1701072相再用120mL水，分三次进行洗涤，得到含辅酶Q10的有机相，40℃下在旋转蒸发仪中蒸发溶剂得到辅酶Q10 50.20g，测得辅酶Q10含量为68.8％，收率为88.9％，总收率为88.6％。

比较例8

取辅酶Q10菌体780g(辅酶Q10含量为5.5％，水分含量为3％)，以与实施例1相同的方式进行步骤i)的提取操作，获得103.31g辅酶Q10提取物，辅酶Q10含量为41.3％，收率为99.5％。直接进行步骤iii)的结晶操作。具体步骤为：将该提取物加入600mL的混和溶剂(V_丙酮：V_乙醇＝2：1)中，于30℃冷阱中搅拌溶解，完全溶解后保温30min；以1℃/3min的速率降温，温度降为20℃，瓶底有大量晶体颗粒析出，保温30min；以1℃/3min的降温速率再次降温，降至-5℃，保温3h；抽滤，混合溶剂洗涤三次，烘干得辅酶Q10 75.60g，测得辅酶Q10的含量为50.0％，收率为88.6％，总收率为88.1％。结晶母液中辅酶Q10的含量有6％，非常难处理。

比较例9

取辅酶Q10菌体780g(辅酶Q10含量为5.3％，水分含量为2.7％)，以与实施例1相同的方式进行步骤i)的提取操作，获得104.29g辅酶Q10提取物，辅酶Q10含量为39.4％，收率为99.4％。然后将该提取物直接进行步骤iv)的层析精制，具体步骤为：使用实施例1的玻璃层析柱，称取获得的辅酶Q10提取物，加入石油醚并加热溶解完全，冷却至室温后上样。用含有1.5％乙酸乙酯的石油醚溶液作为洗脱剂进行洗脱，洗脱流速为7.2mL/min，分段接洗脱液，将主洗脱液合并，旋转蒸发脱除溶剂、称重，得辅酶Q10产品45.24g，测得辅酶Q10含量为85.2％，收率为93.8％，总收率为93.2％，过柱过程非常缓慢，大量杂质吸附在柱子上，堵塞了填料。

由上述结果可以看出，实施例1和3与比较例1和2均使用了本发明的非极性有机溶剂、极性有机溶液和水的组合，但是，比较例1和2使用的溶剂配比不在本发明范围内，因此所产生的油相与水相分相不显著，辅酶Q10不能充分融入油相中，导致油相中的辅酶Q10的含量少，收率降低。相比之下，实施例1和3的混合溶剂各组分配比适当，油相与水相呈相明显，上层油相萃取出大量的辅酶Q10，将菌渣和部分极性杂质分离到下层水相，辅酶Q10的收率明显高于比较例1和2。

比较例3使用正己烷作为溶剂来溶解步骤i)得到的辅酶Q10提取物，可观察到油层、乳化层和水层三种分层，乳化层清晰且大量存在，辅酶Q10和部分杂质共存于油相和乳化层中，不能有效分离。与其相对，本申请实施例1使用丁酮作为溶剂，对步骤i)得到的辅酶Q10提取物进行沉淀去除强极性杂质，有效减少了乳化影响，油层与水层分界明显，乳化层很薄且不清晰，脂溶性极性杂质不溶于丁酮而沉淀。因此，现有技术中以正己烷等为溶剂进行纯化时，如果遇到水可明显看到乳化现象，最终得到的辅酶Q10纯度及收率较低，使用本发明的方法则可显著提高纯度及收率。

实施例2、5和6分别使用活性白土、硅藻土和活性炭作为吸附剂进行脱色，实验结果显示，活性白土的选择性吸附最好，脱色后的收率最高。相比之下，活性炭脱色后的辅酶Q10收率最低，可能是因为活性炭会造成产品不可逆吸附，从而导致收率损失。活性白土和硅藻土可以很好地解决这个问题，可以选择性地将步骤iii)中随辅酶Q10一起提取出的色素类物质通过吸附而去除。

实施例7～9与比较例4～6对结晶脱色进行了研究。实验结果显示，比较例4和5单独使用乙醇或异丙醇的脱色效果最差，结晶后收率也不理想。比较例6虽然也以丁酮和乙醇作为混合溶剂，但溶剂的配比不在本发明范围内，因此与实施例1相比结晶后的收率不高。

比较例7～9仅包含本发明方法的部分步骤，辅酶Q10的提取率或者纯度均不及本申请实施例1。比较例7采用碱水洗的工艺，导致脂溶性杂质中大量的可乳化杂质严重乳化，带走部分辅酶Q10，使收率降低。比较例8在提取后直接结晶纯化，未预先进行杂质的进一步处理，例如本发明的通过沉淀法去除不溶于酮类溶剂的脂溶性极性杂质的工序，因此结晶母液中杂质含量高且成分复杂，导致从母液中回收产品的收率很低。比较例9提取后直接层析过柱进行纯化，由于上样液中含有大量杂质，有些杂质会不可逆吸附于硅胶上，堵塞填料导致硅胶的套用次数低，辅酶Q10的收率和纯度也降低。

实施例1、2、9、10均按照本发明方法的步骤i)～iv)进行操作，且满足各步骤的条件，因此均获得了理想的分离纯化效果，辅酶Q10的纯度可达到99.8％以上，总收率可保持在98.5％以上。

产业上的可利用性

本发明的提取纯化方法可有效去除辅酶Q10制备过程中存在的强极性杂质、极性脂类杂质、色素、中性和非极性脂类杂质，以及醌类同系物等杂质，产物辅酶Q10的总收率可保持在98.5％以上，纯度达到99.8％以上。此外，本发明方法不存在现有技术中碱洗步骤出现的乳化问题，操作步骤少且简单，所用试剂和设备皆为常规，成本低且具有竞争优势，非常适合于工业化生产。

Claims (12)

1.一种辅酶Q10的提取纯化方法，其包括如下步骤：

i)对辅酶Q10菌体进行提取，提取体系是非极性有机溶剂、极性有机溶剂和水的组合；

ii)将步骤i)得到的提取物与酮类溶剂混合以沉淀去除杂质；

iii)将步骤ii)得到的去除杂质后的处理物采用吸附剂吸附或结晶进行脱色；以及

iv)将步骤iii)得到的脱色物进行层析精制，得到提取纯化后的辅酶Q10。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤i)的提取体系中非极性有机溶剂、极性有机溶剂和水的体积比为6～10:2～6:1，优选为7～9:2～4:1，所述提取导致分层，将分离得到的油相脱除溶剂后，得到辅酶Q10提取物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤i)中提取体系与辅酶Q10菌体的体积质量比以mL/g表示为10～20:1，优选为10～18:1，更优选为10～15:1。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非极性有机溶剂为环己烷、乙醚、异丙醚、异辛烷、正己烷或石油醚中的至少一种，优选为环己烷、正己烷或石油醚，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种，优选为丙酮、乙腈或乙酸乙酯，所述水为所述细菌中的水分或/和添加的水。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤ii)的酮类溶剂和所述步骤i)得到的提取物的体积质量比以mL/g表示为1～30:1，优选为1～20:1，更优选为5～10:1，所述酮类溶剂为丙酮、丁酮、2-戊基酮和甲基异丁基酮中的至少一种，优选为丙酮或丁酮。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤iii)的吸附剂为活性白土、硅藻土和活性炭中的至少一种，优选为活性白土；所述吸附剂用量为辅酶Q10质量的0.1～100倍，优选为0.1～40倍，更优选为0.3～5倍。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤iii)的结晶脱色采用醇类溶剂和酮类溶剂组成的混合体系，所述混合体系中的醇类溶剂与酮类溶剂的体积比为0.1～9:1，优选为0.5～7:1，更优选为2～6:1，所述醇类溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种，优选为乙醇，所述酮类溶剂为丙酮、丁酮、2-戊基酮和甲基异丁基酮中的至少一种，优选为丙酮或丁酮。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的去除杂质后的处理物为过滤步骤ii)中沉淀的杂质得到的含有辅酶Q10的滤液，或将过滤步骤ii)中沉淀的杂质得到的含有辅酶Q10的滤液脱除溶剂后，得到的滤液浓缩物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤iii)中所述结晶使用的混合体系与辅酶Q10的体积质量比以mL/g表示为5～35:1，优选为10～30:1，更优选为15～22:1，所述结晶的温度为-10～25℃。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤iv)包括：将所述步骤iii)得到的脱色物溶解于非极性溶剂，上样，通过层析柱进行纯化，用非极性有机溶剂和极性有机溶剂组成混合溶剂作为洗脱剂，得到辅酶Q10。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述非极性有机溶剂为石油醚、乙醚、正己烷或异辛烷中的至少一种，优选为石油醚或正己烷，所述极性有机溶剂为异丙醇、乙醇、1,4-二氧六环、乙酸乙酯和丙酮中的至少一种，优选为异丙醇或乙酸乙酯，所述层析柱中的固定相为硅胶，流动相为非极性有机溶剂和极性有机溶剂的混合溶剂。

12.根据权利要求1-11任一项所述的方法制备的辅酶Q10，所述辅酶Q10的纯度达到99.8％以上。