CN108840864B - 一种他克林-杂环轭联物的制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种他克林‑杂环轭联物、含他克林‑杂环轭联物的药用组合物和用途。所述的他克林‑杂环轭联物具有下述结构：

Description

一种他克林-杂环轭联物的制备方法及用途
技术领域
本发明属于有机合成和药物领域，具体涉及一种用于阿尔茨海默病的他克林-杂环轭联物和用途，特别是涉及通过将氨基他克林与杂环化合物反应来制备他克林-杂环轭联物，以及此他克林-杂环轭联物在制备抗阿尔茨海默药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默症(AD)是世界上最常见的神经退行性疾病，病因涉及神经、免疫以及血液循环等多个系统，最终导致神经损伤，记忆和认知衰退。面对如此复杂的系统性疾病，针对AD发病进程中的多重靶标，设计多功能抑制剂，已成为抗AD药物研发的全新方向。
他克林是首个被FDA批准用于治疗AD症的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，由于严重的肝毒性，被迫退出市场。然而其作为一个优秀的先导化合物，有望通过合理的结构改造或修饰，使之成为理想的药物。研究证实他克林的肝毒性与其游离的伯氨基密切相关，通过化学结构修饰，可以屏蔽游离的伯氨基，从而降低分子的肝毒性。近年来，许多研究小组针对数个AD致病环节，通过引入各种功能片段与他克林缀合，以期获得既能降低他克林的肝毒性，改善脑部微环境，又能体现轭联物多靶点作用特点的新型抗AD药物。
杂环化合物普遍存在于生物界里，与生物的生长、发育、繁殖以及遗传、变异等均有密切联系。此外，药物分子结构之中普遍含有杂环化合物，是药物活性的重要功能基团。为进一步探索发现多靶点的AD治疗药物，本发明我们设计将杂环化合物引入他克林分子，构建结构多样的他克林轭联物，增加其胆碱酯酶的抑制活性并降低肝毒性，寻找高效、低毒的治疗AD的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗阿尔茨海默病的他克林-杂环轭联物。
本发明的第二个目的是提供一种含他克林-杂环轭联物的药物组合物。
本发明的第三个目的是提供一种他克林-杂环轭联物及其药物组合物作为抗阿尔茨海默药物的用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种他克林-杂环轭联物，具有下述结构：
Figure BDA0001748315440000011
其中，
Figure BDA0001748315440000021
Figure BDA0001748315440000022
一种含他克林-杂环轭联物的药物组合物，其特征是包括他克林-杂环轭联物或其药用盐与药学上可接受的辅料，所述的他克林-杂环轭联物，具有下述结构：
Figure BDA0001748315440000023
其中，
Figure BDA0001748315440000024
Figure BDA0001748315440000025
所述的药用盐，是指任何药用盐。本发明所述的他克林-杂环轭联物含有碱部分，药用盐可以通过常规方法由他克林-杂环轭联物的母体化合物合成，通常将游离碱形式的他克林-杂环轭联物与化学计算量的适当酸在水中或者有机溶剂中反应制备，乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇为优选有机溶剂，药用盐可以是无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐；或有机酸盐，例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐和对甲苯磺酸盐。
一种他克林-杂环轭联物及其药物组合物在制备抗阿尔茨海默药物中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例4的他克林-呋喃轭联物的合成路线。
图2为本发明实施例4的他克林-呋喃轭联物的高分辨质谱图。
图3为本发明实施例5的他克林-噻吩轭联物的合成路线。
图4为本发明实施例5的他克林-噻吩轭联物的高分辨质谱图。
图5为本发明实施例6的他克林-噻吩轭联物的合成路线。
图6为本发明实施例6的他克林-噻吩轭联物的高分辨质谱图。
图7为本发明实施例7的他克林-噻唑轭联物的合成路线。
图8为本发明实施例7的他克林-噻唑轭联物的高分辨质谱图。
图9为本发明实施例8的他克林-噻唑轭联物的合成路线。
图10为本发明实施例8的他克林-噻唑轭联物的高分辨质谱图。
图11为本发明实施例9的他克林-噻唑轭联物的合成路线。
图12为本发明实施例9的他克林-噻唑轭联物的高分辨质谱图。
图13为本发明实施例10的他克林-甲基噻唑轭联物的合成路线。
图14为本发明实施例10的他克林-甲基噻唑轭联物的高分辨质谱图。
图15为本发明实施例11的他克林-香草酸轭联物的合成路线。
图16为本发明实施例11的他克林-香草酸轭联物的高分辨质谱图。
图17为本发明实施例12的他克林-甲基吡啶轭联物的合成路线。
图18为本发明实施例12的他克林-甲基吡啶轭联物的高分辨质谱图。
图19为本发明实施例13的他克林-哒嗪轭联物的合成路线。
图20为本发明实施例13的他克林-哒嗪轭联物的高分辨质谱图。
图21为本发明实施例14的他克林-哒嗪轭联物的合成路线。
图22为本发明实施例14的他克林-哒嗪轭联物的高分辨质谱图。
图23为本发明实施例15的他克林-吡嗪轭联物的合成路线。
图24为本发明实施例15的他克林-吡嗪轭联物的高分辨质谱图。
图25为本发明实施例16的他克林-甲氧基吡嗪轭联物的合成路线。
图26为本发明实施例16的他克林-甲氧基吡嗪轭联物的高分辨质谱图。
图27为本发明实施例17的他克林-川芎嗪轭联物的合成路线。
图28为本发明实施例17的他克林-川芎嗪轭联物的高分辨质谱图。
图29为本发明实施例18的他克林-苯丙噻吩轭联物的合成路线。
图30为本发明实施例18的他克林-苯丙噻吩轭联物的高分辨质谱图。
图31为本发明实施例19的他克林-甲基吲哚轭联物的合成路线。
图32为本发明实施例19的他克林-甲基吲哚轭联物的高分辨质谱图。
图33为本发明实施例20的他克林-吲哚轭联物的合成路线。
图34为本发明实施例20的他克林-吲哚轭联物的高分辨质谱图。
图35为本发明实施例22的他克林-川芎嗪轭联物对淀粉样蛋白Aβ自聚集的抑制活性。
图36为本发明实施例23的他克林-川芎嗪轭联物对PC12细胞的神经毒性和神经性保护作用。
图37为本发明实施例25的他克林-川芎嗪轭联物给药小鼠300秒内的跑步、行走和停滞三种行为模式时间。
图38为本发明实施例25的他克林-川芎嗪轭联物给药小鼠旷场实验的运动活性。
图39为本发明实施例25的他克林-川芎嗪轭联物物体识别实验的训练和测试时间。
图40为本发明实施例25的他克林-川芎嗪轭联物实验动物小鼠海马区HE染色。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围：
实施例1中间体1的合成
称取邻氨基苯甲酸(50.0g，364mmol)溶解于100ml甲苯中，加入(45.3ml，437mmol)环己酮，110.6℃回流反应2h，除去约6.8ml水。将混合物冷却至室温，析出针状结晶，进一步冷却至0℃，过滤，并用甲苯(50ml)和乙醇(50ml)洗涤。收集滤饼，真空干燥箱中干燥，得到中间体1白色晶体53.2g，收率67％。
实施例2中间体2的合成
三颈瓶中依次加入中间体1(67.0g，309mmol)、三氯氧磷(120ml，1.29mol)，85℃回流反应2h。冷却至室温，逐滴加入冷的54％KOH水溶液(540g，1000ml)，快速搅拌，加入完成后，析出沉淀(黄色固体)，上清液pH为10±1。再加入CH2Cl2(1500ml)溶解固体，并用CH2Cl2(3×1000ml)萃取水层，合并有机相，无水MgSO4干燥，过滤，回收溶剂，得到中间体2黄色固体60.0g，收率90％。
实施例3氨基他克林的合成
三颈瓶中依次加入中间体2(30.0g，0.14mol)、已二胺(54ml，0.42mol)和1.5g KI，200ml正戊醇溶解，140℃回流反应18h。将反应液冷却至0℃，6M的盐酸调pH至1.0，静置分层。水层用冷KOH溶液调pH至10.0，二氯甲烷萃取(3×200ml)，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤三次，无水Na2SO4干燥，过滤，减压蒸干。柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷：甲醇＝50：1-10：1-5：1，v：v，10ml三乙胺/1000ml)，得到氨基他克林淡黄色油状液体36.3g，收率88％。
实施例4他克林-呋喃轭联物的合成
圆底瓶中依次加入2-呋喃甲酸(0.188g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水二氯甲烷；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，反应液依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-呋喃轭联物(淡黄色油状物)0.456g，收率69％(合成路线见图1，表征图谱见图2)。
实施例5他克林-噻吩轭联物的合成
圆底瓶中依次加入2-噻吩甲酸(0.215g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×30ml)和饱和食盐水(30ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-噻吩轭联物(淡黄色油状物)0.424g，收率62％(合成路线见图3，表征图谱见图4)。
实施例6他克林-噻吩轭联物的合成
圆底瓶中依次加入3-噻吩甲酸(0.215g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×30ml)和饱和食盐水(30ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-噻吩轭联物(淡黄色油状物)0.446g，收率65％(合成路线见图5，表征图谱见图6)。
实施例7他克林-噻唑轭联物的合成
圆底瓶中依次加入噻唑-2-甲酸(0.217g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-噻唑轭联物(淡黄色油状物)0.378g，收率55％(合成路线见图7，表征图谱见图8)。
实施例8他克林-噻唑轭联物的合成
圆底瓶中依次加入噻唑-4-甲酸(0.217g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-噻唑轭联物(淡黄色油状物)0.342g，收率50％(合成路线见图9，表征图谱见图10)。
实施例9他克林-噻唑轭联物的合成
圆底瓶中依次加入噻唑-5-甲酸(0.217g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-噻唑轭联物(淡黄色油状物)0.379g，收率55％(合成路线见图11，表征图谱见图12)。
实施例10他克林-甲基噻唑轭联物的合成
圆底瓶中依次加入4-甲基-噻唑-5-甲酸(0.241g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-甲基噻唑轭联物(淡黄色油状物)0.403g，收率57％(合成路线见图13，表征图谱见图14)。
实施例11他克林-香草酸轭联物的合成
圆底瓶中依次加入香草酸(0.282g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×30ml)和饱和食盐水(30ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-香草酸轭联物(淡黄色油状物)0.452g，收率60％(合成路线见图15，表征图谱见图16)。
实施例12他克林-甲基吡啶轭联物的合成
圆底瓶中依次加入6-甲基吡啶-2-甲酸(0.230g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×30ml)和饱和食盐水(30ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-甲基吡啶轭联物(淡黄色油状物)0.470g，收率67％(合成路线见图17，表征图谱见图18)。
实施例13他克林-哒嗪轭联物的合成
圆底瓶中依次加入哒嗪-3-甲酸(0.190g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-哒嗪轭联物(淡黄色油状物)0.218g，收率32％(合成路线见图19，表征图谱见图20)。
实施例14他克林-哒嗪轭联物的合成
圆底瓶中依次加入哒嗪-4-甲酸(0.190g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-哒嗪轭联物(淡黄色油状物)0.204g，收率30％(合成路线见图21，表征图谱见图22)。
实施例15他克林-吡嗪轭联物的合成
圆底瓶中依次加入2-吡嗪甲酸(0.208g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-吡嗪轭联物(淡黄色油状物)0.243g，收率36％(合成路线见图23，表征图谱见图24)。
实施例16他克林-甲氧基吡嗪轭联物的合成
圆底瓶中依次加入5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(0.259g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×30ml)和饱和食盐水(30ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-甲氧基吡嗪轭联物(淡黄色油状物)0.292g，收率40％(合成路线见图25，表征图谱见图26)。
实施例17他克林-川芎嗪轭联物的合成
圆底瓶中依次加入川芎嗪酸(0.279g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和20ml无水二氯甲烷；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，反应液依次用水(2×20ml)和饱和食盐水(20ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：二氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-川芎嗪轭联物(淡黄色油状物)0.547g，收率73％(合成路线见图27，表征图谱见图28)。
实施例18他克林-苯丙噻吩轭联物的合成
圆底瓶中依次加入苯丙噻吩-2-甲酸(0.299g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×30ml)和饱和食盐水(30ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-苯丙噻吩轭联物(淡黄色油状物)0.331g，收率43％(合成路线见图29，表征图谱见图30)。
实施例19他克林-甲基吲哚轭联物的合成
圆底瓶中依次加入1-甲基吲哚-3-甲酸(0.294g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×30ml)和饱和食盐水(30ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-甲基吲哚轭联物(淡黄色油状物)0.291g，收率38％(合成路线见图31，表征图谱见图32)。
实施例20他克林-吲哚轭联物的合成
圆底瓶中依次加入吲哚-6-甲酸(0.271g，1.68mmol)、EDCI(0.387g，2.02mmol)、DMAP(0.062g，0.50mmol)和10ml无水N,N-二甲基甲酰胺；再加入氨基他克林(0.5g，1.68mmol)，常温搅拌反应12h。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10：1)检测反应基本完全，减压回收N,N-二甲基甲酰胺，20ml二氯甲烷溶解残渣，依次用水(2×30ml)和饱和食盐水(30ml)清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(洗脱液：三氯甲烷：甲醇＝20：1-10：1)，得到他克林-吲哚轭联物(淡黄色油状物)0.259g，收率35％(合成路线见图33，表征图谱见图34)。
实施例21由实施例4-20制备的他克林-杂环轭联物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性的体外评价，包括如下步骤：
乙酰胆碱酯酶溶液的配制：采用含0.1％w/v牛血清蛋白的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0.22U/ml，分装至5ml离心管，-20℃保存待用。人源乙酰胆碱酯酶溶液的配制：采用含0.1％w/v牛血清蛋白的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0.05U/ml，分装至5ml离心管，-20℃保存待用。丁酰胆碱酯酶溶液的配制：采用含0.1％w/v牛血清蛋白的Tris-HC1缓冲液配制成浓度为0.3U/ml，分装至5ml离心管，-20℃保存待用。人源丁酰胆碱酯酶溶液的配制：采用含0.1％w/v牛血清蛋白的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0.024U/ml，分装至5ml离心管，-20℃保存待用。5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液的配制：pH＝7.4的PBS配制成浓度1.5mM的溶液，4℃避光保存备用。碘化硫代乙酰胆碱/碘化硫代丁酰胆碱溶液的配制：采用pH＝7.4的PBS配制成浓度为30mM的溶液，分装至1ml离心管，-20℃保存待用。待测化合物溶液的配制：DMSO配制成0.01M浓度的母液，pH＝7.4的PBS稀释成对应的浓度梯度。
96孔板每孔加入20μl PBS，再加入20μl不同浓度的待测化合物溶液，随后每孔加50μl的乙酰胆碱酯酶溶液/丁酰胆碱酯酶溶液(人源乙酰胆碱酯酶溶液/人源丁酰胆碱酯酶溶液)。37℃摇床孵育5min后，加入100μl的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液，37℃避光摇床孵育5min。最后加入10μl的底物碘化硫代乙酰胆碱/碘化硫代丁酰胆碱溶液，37℃摇床孵育3min，酶标仪测定415nm处的吸光度(OD值)，每次实验独立重复三次。计算待测化合物对乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶(人源乙酰胆碱酯酶/人源丁酰胆碱酯酶)的抑制率，抑制率(％)＝(OD1-OD2)/(OD1-OD0)。(OD1：加酶不加待测化合物的OD值，OD0：不加酶加空白对照的OD值，OD2：加酶和待测化合物的OD值)。最后利用不同浓度下待测化合物所对应的抑制率计算IC50值，结果见表1。
表1化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性(IC50)
Figure BDA0001748315440000101
结果显示，本发明的他克林-杂环轭联物具有显著地乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性，效果优于阳性药他克林，其中实施例17的他克林-川芎嗪轭联物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性分别是他克林的近32倍和54倍；对人源乙酰胆碱酯酶的抑制活性是他克林的近7倍，对人源丁酰胆碱酯酶的抑制能力与他克林相近。
实施例22由实施例17制备的他克林-川芎嗪轭联物对淀粉样蛋白Aβ自聚集抑制活性的体外评价，包括如下步骤：
淀粉样蛋白Aβ42预处理及溶解：将Aβ42冻干粉溶解于适量的六氟异丙醇，超声5-10min使其充分溶解，室温静置过夜。常温下真空干燥除去六氟异丙醇，并将干燥的Aβ42干粉存于-20℃。将老化过的Aβ42干粉以2mM溶度溶解于DMSO作为母液，待使用时稀释至所需溶度。硫磺素T溶液的配制：取1mg硫磺素T于10ml离心管中，加入2ml PBS溶液(10mM，pH＝7.4)，超声5min溶解，过0.22μm的滤膜，得到硫磺素T储备液。取1ml硫磺素T储备溶液稀释至10μM，测定其在416nm的紫外吸光度，并微调整浓度使其吸光度达到0.266。待测化合物溶液的配制：先用DMSO配制成0.01M浓度的母液，然后用pH＝7.4的PBS稀释成对应的浓度梯度(0.0064,0.032,0.16,0.8,4,20,100μM)。
取10μl已配置好的淀粉样蛋白Aβ42溶液(40μM)加入96孔板，同时加入10μl不同浓度的待测化合物。将已配置好的混合液于37℃孵育24h，后加入180μl 10μM的硫磺素T溶液。全波长多功能酶标仪检测，激发波长435nm，读取485nm的荧光强度值。计算待测化合物的抑制率，抑制率(％)＝(F1-F2)/(F1-F0)。(F1：加Aβ42不加待测化合物的荧光值，F0：不加Aβ42和待测化合物时，硫磺素T溶液的背景荧光值，F2：加Aβ42和待测化合物的荧光值)，最后利用不同浓度下待测化合物所对应的抑制率作图。
样品制备：取2.5μl已配置好的淀粉样蛋白Aβ42溶液(2mM)加入96孔板，同时加入2.5μl(0.1mM)待测化合物。再加入45μl PBS(PH＝7.4)。将已配置好的混合液置于摇床震摇12h后放入37℃培养，并记录培养时间。分别在培养后4天制样进行观察。待测化合物用DMSO配制成2mM的储备液。空白对照组为2.5μl的淀粉样蛋白Aβ42溶液与2.5μl的DMSO溶于45μl的PBS缓冲液，其他处理条件同待测样品。样品检测：将96孔板中的混合液(1μl)稀释100倍，取5μl稀释好的溶液点于事先制备好的AFM云母片上，在干燥器中静置过夜干燥。原子力显微镜以智能模式扫描样品，力常数为3N/m。
结果显示(见图35)，他克林能一定程度抑制Aβ42蛋白的自聚集，而本发明的他克林-川芎嗪轭联物表现出显著的抑制淀粉样蛋白Aβ42自聚集活性。此外，他克林-川芎嗪轭联物的浓度-抑制率曲线，在0.0064-100μM浓度区间内，随着轭联物浓度的增加，其抑制率也相应增高，说明他克林-川芎嗪轭联物抑制Aβ42自聚集呈浓度依赖性。原子力显微镜成像结果显示(见图35)，孵育4天后，淀粉样蛋白Aβ42对照组和他克林组都表现出了明显的聚集状态，但他克林组没有形成明显的纤维状聚集。他克林-川芎嗪轭联物处理后，淀粉样蛋白Aβ42的聚集明显减少，没有形成明显的斑块状或纤维状聚集。
实施例23由实施例17制备的他克林-川芎嗪轭联物神经保护活性的体外评价，包括如下步骤：
待测化合物溶液的配制：待测化合物DMSO溶解，稀释成对应的浓度梯度(1.25，2.50，5，10μM)。
取完全培养基培养大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12，当细胞浓度达到适当数量时，倒掉原培养基，加空白的RPMI 1640，饥饿细胞14h。120μl接种于多聚赖氨酸包被过的96孔板中，90％RPMI 1640，10％胎牛血清，100U/ml双抗配的培养基培养，每孔细胞个数约7×103。另加0.05μg/ml的神经生长因子NGF诱导细胞分化，分化培养48h，待细胞生长出类似神经细胞的轴突。以终浓度为1.25，2.50，5，10μM加药，每一浓度平行4孔，对照组加入等体积培养液，以维生素E为阳性对照(Trolox)。化合物用DMSO溶解，培养基稀释，DMSO的终浓度小于0.1％。药物作用36h后，加入终浓度为300μM氯化钴(CoCl2)损伤PC12细胞。细胞造模损伤12h后加MTT 20μl(5mg/ml)，继续培养4h。小心除去上清液，防止生成的结晶被抽走。每孔加入100μl DMSO，置微量震荡器上震荡5min使其充分溶解，测定490nm处各孔的吸光度，导出数据。神经细胞毒性测试不加入氯化钴损伤PC12细胞，其他操作同上。数据以均值±标准差
Figure BDA0001748315440000122
表示，SAS8.2统计软件进行数据统计和单因素方差分析，独立重复三次实验，结果见图36。
结果表明，他克林和实施例17的他克林-川芎嗪轭联物神经毒性随着浓度的升高而增强，在2.5μM没有明显的细胞毒性；在5μM和10μM时PC12的细胞活性显著降低，分别达到了82％、76％和70％、61％。与正常组(NGF)对比，CoCl2损伤导致PC12细胞的存活率明显降低(51.2％)，阳性药维生素E浓度10μM时，细胞存活率为101％。给药组他克林、他克林-川芎嗪轭联物均能显著提高CoCl2损伤的PC12细胞的存活数量，其中他克林-川芎嗪轭联物在1.25μM和2.5μM时PC12的细胞存活率分别为78％和80％。此外，当浓度增高时，他克林-川芎嗪轭联物对CoCl2损伤PC12细胞的保护作用有一定的降低。
实施例24由实施例17制备的他克林-川芎嗪轭联物肝毒性的体内评价，包括如下步骤：
药品的配制：分析天平称取羧甲基纤维素钠1g，溶于盛有200ml蒸馏水的烧杯中，95℃水浴加热，并不断用玻璃棒搅拌，超声，反复搅拌超声数次，至羧甲基纤维素钠完全溶解。静置放凉，留待备用。称取一定量的药品他克林，配制成1.5mg/ml的药液，他克林-川芎嗪轭联物配制等摩尔量的药液即3.37mg/ml，现用现配。
小鼠适应环境一周后按体重随机分组，实验分为3个组：空白对照组(Control)，他克林组(Tacrine)，药物组(他克林-川芎嗪轭联物)，每组8只小鼠。给药之前饥饿十二小时，保证供水。灌胃给药(小鼠给药标准0.1ml/10g)，他克林给药剂量3mg/100g，药物组给予等摩尔量的他克林-川芎嗪轭联物，空白对照组动物灌胃给予等容量的0.5％羧甲基纤维素钠溶液。
分别在给药后8h，24h，36h时间点，眼眶取血。4℃放置1h，3000r转速离心15min，取上层血清-80℃保存。随后依照试剂盒说明书测定谷氨酸-丙酮酸转氨酶ALT/天门冬氨酸氨基转移酶AST。数据以均值±标准差
Figure BDA0001748315440000121
表示，SAS8.2统计软件进行数据统计和单因素方差分析，结果见表2。
表2口服他克林-川芎嗪轭联物后小鼠肝脏ALT/AST的变化(n＝8，
Figure BDA0001748315440000131
)
Figure BDA0001748315440000132
注：与同时间的空白对照组比较，*p≤0.05，**p≤0.01
结果显示，口服他克林导致其AST/ALT指标显著升高。而药物组他克林-川芎嗪轭联物能明显抑制AST/ALT，与原料药他克林相比，其肝损伤毒性大大缓解。这与我们实验预期结果符合，他克林侧链伯氨基的改变，其肝毒性显著降低，尤其是侧链川芎嗪的引入，可能起到部分保护肝损伤的作用。
实施例25由实施例17制备的他克林-川芎嗪轭联物对AD小鼠治疗作用的体内评价，包括如下步骤：
全自动小鼠行为定位系统使用红外光束中断传感器和电脑分析系统(H0514-MP2,Computar CCD)记录小鼠的空间位置。具体而言，通过MATLAB软件确定录像中每只小鼠的空间位置(10fps/s)，然后通过MATLAB软件建立像素并计算水平和垂直平面上的欧式距离，使用以下公式检测小鼠的位移和运动速度，从而确认小鼠空间位置动态。
Figure BDA0001748315440000133
Figure BDA0001748315440000134
实验分为3个组：AD模型小鼠组(APP/PS1+NS ig)，阳性药-他克林组(APP/PS1+他克林ig)，口服给药组(APP/PS1+他克林-川芎嗪轭联物ig)。将APP/PS1小鼠随机分组，每组6只。野生型本底鼠C57作为对照(WT+他克林-川芎嗪轭联物ig)。AD模型小鼠组(等量生理盐水)、他克林组(0.5mg/100g)、口服给药组(1.12mg/100g)灌胃给药，两天一次，持续30天。
旷场实验，通常用来评价实验动物的探索行为和自发性运动能力。对于研究生物体神经系统类疾病或活性都有着重要意义和参考价值。旷场实验在安静且光线昏暗(25％±5％lux)的房间内进行。具体实验装置包括一个较大的中央活动室(测试笼，长×宽×高：120×120×120cm)，小鼠在其中进行自由探索。四个位于外围且与中央室门连通的(标准笼子大小)的隔间，作为实验动物睡眠和隐藏的巢穴，构建实验动物四室一厅的测试平台，这一测试场地符合半自然的测试条件。在开始测试时，小鼠从中间场地的一个固定角落放入其中，允许其自由探索2min，以便小鼠充分适应实验场地。小鼠适应2min后，进行行为学记录，实验记录时间为300s。在旷场实验中，除标准记录的运动速度，运动总距离等数据外，我们同时对3种具体行为进行统计，定义如下：①行走时间(Walking time)：小鼠在旷场中以1～20cm/s速度运动。②奔跑时间(Running time)：小鼠在旷场中大于20cm/s速度运动。③停滞时间(Static time)：小鼠在旷场中基本静止不动(v<1cm/s)。
物体识别实验(Object recognition task，ORT)是一种利用啮齿类动物天生喜欢接近和探索新奇物体的本能来检测动物识别记忆的精细、敏感的行为学方法，广泛用于学习记忆及认知障碍等神经生物学方面的研究。实验分为三步。①适应阶段：将小鼠依次放入没有任何物体的测试箱中，适应实验环境，连续3d，共6次。②熟悉阶段：在距侧壁10cm处放入两个相同物体——黄色三角体(A1和A2，边长：10cm)，将小鼠以背对物体方向放入，自由探索5min后将小鼠取出，记录小鼠对两物体的探索时间。③测试阶段：24h后进行测试，将两个相同物体中A2替换成另一黄色立方体(N，长×宽×高：10×10×10cm)，即熟悉物体(F)和新奇物体(N)，记录小鼠5min内对两物体的探索时间。F和N的位置随机置换，以避免位置偏倚。探索活动定义为：小鼠鼻子在≤2cm范围内直指向物体或直接接触物体时的行为，小鼠转头或坐在物体上时不被认为是对物体的探索。“A1”、“A2”为熟悉阶段小鼠对物体的探索时间(10fps/s)。“N”为小鼠对新奇物体的探索时间，“F”为小鼠对熟悉物体的探索时间。
在上述行为学实验结束后，脱颈椎处死小鼠，解剖取小鼠的脑组织，置于4％多聚甲醛中固定保存，进行HE染色。HE染色操作流程：①固定好的组织置于真空组织脱水机中以梯度乙醇脱水及二甲苯透明，石蜡包埋。②包埋好的标本用切片机切石蜡切片，切片厚度3μm，经60℃烘片1h。③石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％乙醇5min-90％乙醇5min-80％乙醇5min-70％乙醇5min-蒸馏水洗。④苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染色3～8min，自来水洗，1％的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。⑤伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1～3min。⑥脱水封片：将切片依次放入95％乙醇I 5min-95％乙醇II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。⑦显微镜镜检，图像采集分析。染色结果：细胞核蓝色，细胞质红色。
数据以均值±标准差
Figure BDA0001748315440000141
表示，用SAS8.2统计软件和GraphPad Prism 5进行数据分析，两组间比较使用双尾非配对样本T检验，多组间数据选取单因素(Tukey’smultiple comparisons test)或双因素方差分析(Two way-ANOVA)进行比较。
运动活性：①具体行为时间我们统计了小鼠行走、奔跑和停滞这三种运动模式，并对其具体行为时间进行分析，结果见图37，各组小鼠的行走时间并无明显的差异。②运动距离测试不同处理小鼠在300s内的运动活性和运动状态(图38)。实验结果显示各组小鼠总的运动距离并没有表现出显著性差异。此外，对实验小鼠每个记录时间点的运动距离进行横向比较，同样没有表现出显著性差异。然而，分析数据我们可以看出，APP/PS1+他克林-川芎嗪轭联物ig组在各记录时间点的运动距离和总的运动距离相对较远，揭示他克林-川芎嗪轭联物表现出较强的运动活性。③运动速度运动速度上，各组间没有表现出显著性差异(图38)。相对而言，APP/PS1+他克林-川芎嗪轭联物ig组的运动速度高于其他给药组，揭示口服他克林-川芎嗪轭联物的小鼠运动活性较强。我们可以注意到，在本实验中AD模型小鼠的运动活性在旷场实验中并没有表现出显著性差异，这可能是因为我们选用的是5-6月龄的APP/PS1小鼠，处在AD早期阶段，其在运动活性上与本底鼠C57并无明显差异。
物体识别实验：利用啮齿类动物喜欢接触和探索新奇事物的天性，是典型的验证小鼠学习记忆能力的实验之一。在此实验中(图39)，我们首先对各组小鼠进行训练5min，Training组，使得各组小鼠对两种物体的偏好没有显著性差异。24小时后，将A2换成其他物体，进行实验，检测偏好性。结果显示，APP/PS1+生理盐水ig组并没有表现出对新奇物体的偏好性，说明该组小鼠有明显的痴呆现象。而APP/PS1+他克林ig组，APP/PS1+他克林-川芎嗪轭联物ig组都表现出显著性偏好，说明这几组小鼠在学习记忆能力上都有明显改善。WT+他克林-川芎嗪轭联物ig组小鼠表现出正常小鼠探索新奇事物的倾向。
此部分我们利用APP/PS1小鼠和C57本底小鼠考察他克林-川芎嗪轭联物对AD模型小鼠运动活性和认知/记忆功能的影响。旷场实验揭示他克林-川芎嗪轭联物给药并没有引起明显的运动活性变化。数据显示口服给药他克林-川芎嗪轭联物AD小鼠运动能力表现较好一些。物体识别实验证实他克林-川芎嗪轭联物具有显著改善小鼠记忆和认知能力的作用。
HE染色(图40)，镜下观察，APP/PS1+生理盐水ig小鼠海马体齿状回区细胞排列松散，海马回1和海马回3区域具有明显的神经细胞凋亡，呈现典型的海马体病理表现。说明在6月龄的APP/PS1小鼠中，海马体表现出明显的神经退行性病变。给药组(APP/PS1+他克林-川芎嗪轭联物ig，APP/PS1+他克林ig)中，海马体病理损伤都有较为明显的改善，齿状回区细胞层没有明显的松散和核固缩现象，细胞层间差异较为明显。同时与空白对照组(APP/PS1+生理盐水ig)相比，海马体中凋亡神经细胞数量也有所减少。以上结果揭示化合物他克林-川芎嗪轭联物能改善APP/PS1小鼠海马体病理损伤。
实施例26由实施例4-20制备的他克林-杂环轭联物血脑屏障通透性的体内评价，包括如下步骤：
实验组大鼠口服给予负荷剂量的他克林-杂环轭联物，使血药浓度达到稳态，采集血样120μl分离血浆，达到血浆稳态浓度后，处死动物取脑组织，蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干水分，称重后用生理盐水按1：6比例制成组织匀浆置于-80℃冰箱中保存待测。
血浆样品：50μl血浆加5μl乙腈和150μl内标工作液，涡旋振荡1min，4℃、18800×g离心10min，取上清液10μl进样分析。脑组织样品：取50μl组织匀浆，加5μl乙腈和150μl内标工作液，涡旋振荡1min，4℃、18800×g离心10min，取上清液10μl进样分析。
液相色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm,5μm)，流动相A(0.1％甲酸水溶液)和B(乙腈)按梯度洗脱，流速为1ml/min。质谱条件：以ESI源MRM方式检测，毛细管温度350℃，毛细管电压+4000V或-3500V，雾化电压35psi，干燥气流速10L/min。
待测物的稳态脑通透性用稳态脑血比值(Kp值)表示，由Kp＝C脑稳态/C血浆稳态计算得到，实验结果见表3。
表3他克林-杂环轭联物的脑血浓度比值(n＝3，
Figure BDA0001748315440000161
)
Figure BDA0001748315440000162
结果显示，本发明的他克林-杂环轭联物具有良好的血脑屏障通透性，脑/血浆浓度比值大于本项目组前期制备的他克林-芥子酸杂合体，甚至绝大多数他克林-杂环轭联物与阳性对照药他克林相当。

Claims (4)

1.一种他克林-杂环轭联物，其特征是具有下述结构：
Figure FDA0003021312640000011
其中，
Figure FDA0003021312640000012
Figure FDA0003021312640000013
2.一种含他克林-杂环轭联物的药物组合物，其特征是包括他克林-杂环轭联物或其药用盐与药学上可接受的辅料，所述的他克林-杂环轭联物，具有下述结构：
Figure FDA0003021312640000014
其中，
Figure FDA0003021312640000015
Figure FDA0003021312640000016
所述的药用盐，是指任何药用盐，本发明所述的他克林-杂环轭联物含有碱部分，药用盐可以通过常规方法由他克林-杂环轭联物的母体化合物合成，通常将游离碱形式的他克林-杂环轭联物与化学计算量的适当酸在水中或者有机溶剂中反应制备，所述的有机溶剂为乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇，药用盐可以是无机酸盐，所述的无机盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐；或有机酸盐，所述的有机盐为乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐和对甲苯磺酸盐。
3.权利要求1所述的他克林-杂环轭联物在制备抗阿尔茨海默药物中的应用。
4.权利要求2所述的含他克林-杂环轭联物的药物组合物在制备抗阿尔茨海默药物中的应用。
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