CN108794353A - 一种化合物用作抗体上糖基的封闭试剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到蛋白质糖基的检测，尤其涉及到一种化合物用作抗体上糖基的封闭试剂的应用。为了解决目前抗体本身的糖基对于检测的干扰的问题，本发明提供一种用作抗体上糖基的封闭试剂的化合物，所述化合物选自α‑氨基脲、乙酰肼、硫乙酰肼、氨基硫脲、天冬酰胺酰肼、酪氨酸肼、N(苄氧基羰基)‑L‑缬氨酰‑L‑酪氨酸酰肼、或N(苄氧基羰基)甘氨酸酰肼中的一种。用所述化合物对抗体进行预处理，可以避免植物凝集素结合到抗体上，从而使对于被捕获的蛋白上的糖基进行精确的定量，且封闭抗体的过程简单，为一步反应，缩短了现有封闭抗体的反应过程，且降低成本非常明显。

Description

一种化合物用作抗体上糖基的封闭试剂的应用
技术领域
本发明涉及到蛋白质糖基的检测，尤其涉及到一种化合物用作抗体上糖基的封闭试剂的应用。
背景技术
利用分子标志物对疾病进行早期诊断可显著降低疾病导致的死亡。蛋白的糖基化是最普遍的蛋白质翻译后修饰。这些修饰对蛋白质的物理、化学和生物性质都发挥重要作用；同时对各种生物过程，包括发育、细胞分化、受精、细胞免疫识别，宿主病原体相互作用，细胞间信号转导都发挥着非常重要的作用。由于糖基对于环境特别敏感。因此，检测异常糖基可以作为一种诊断疾病的一个特异的生物标志物，可以用于对于疾病的早期诊断。事实上，目前很多临床上常用的用于诊断的生物标志物就是蛋白质的糖基，比如CA19-9,CA125,和CA15-3等等。
检测蛋白质糖基的一个简单低成本的方式是用一种酶联免疫分析的方法进行：首先用抗体捕获特异性的蛋白，然后利用特异性的植物凝集素检测蛋白质上的糖基的变化。但是，由于抗体本身具有糖基，会对于检测结果有较大的干扰。
发明内容
为了解决目前抗体本身的糖基对于检测的干扰的问题，本发明提供一种化合物用作抗体上糖基的封闭试剂的应用，用此化合物对抗体进行预处理，这些化合物可以有效的和被高碘酸钠氧化的抗体上的糖基上的醛基反应，封闭糖基，避免植物凝集素结合到抗体上，从而使对于被捕获的蛋白上的糖基进行精确的定量。
为了解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：
本发明提供一种化合物的应用，所述化合物用作抗体的糖基的封闭试剂，所述化合物的通用结构式为：
其中，X选自O，N，或S；Y选自C，N，S，苄基环，氨基酸(谷氨酸除外)，或多肽的侧链基团。
进一步的，X选自O＝，NH＝，或S＝；Y选自－C≡，－N＝，－S－，苄基环，氨基酸(谷氨酸除外)，或多肽的侧链基团。
进一步的，Y选自CHR2，CH2R，CH3，NHR，或NH2。
进一步的，Y选自CH3，或NH2。
进一步的，X选自O，N，或S，其中吸电子能力从O，N，S，越来越弱，使酰肼基团与醛基的反应性越来越强。
进一步的，Y选自C，N，S，苄基环，氨基酸(谷氨酸除外)的侧链基团，或多肽的侧链基团，这些基团的推电子能力依次增强，使酰肼基团的反应能力也依次增强。
进一步的，所述X选自O、或S，Y选自甲基、氨基、或氨基酸的侧链基团。
所述的化合物选自α-氨基脲、乙酰肼、硫乙酰肼、氨基硫脲、天冬酰胺酰肼、酪氨酸肼、N(苄氧基羰基)-L-缬氨酰-L-酪氨酸酰肼、或N(苄氧基羰基)甘氨酸酰肼中的一种。
进一步的，所述化合物的化学结构式如下：
(a)α-氨基脲；(b)乙酰肼；(c)硫乙酰肼；(d)氨基硫脲；(e)天冬酰胺酰肼；(f)酪氨酸肼；(g)N(苄氧基羰基)-L-缬氨酰-L-酪氨酸酰肼；(h)N(苄氧基羰基)甘氨酸酰肼。
进一步的，所述Y是氨基酸的侧链基团或甲基，乙基等取代基团，或者是氨基。
进一步的，所述Y是氨基酸的侧链基团或甲基，乙基等取代基团，或者是氨基，可以增加酰肼与醛基的反应性。
进一步的，所述的化合物硫乙酰肼、氨基硫脲具有较高的反应活性，但对人体的毒性很大，在操作过程中需要更加小心。
一种使用所述的化合物封闭抗体的糖基的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)用高碘酸钠将抗体上的糖基上的羟基氧化成醛基；
(2)使化合物中的酰肼基与(1)中的醛基反应。
进一步的，醛基非常容易和酰肼基团上的氨基发生shiff base反应。
进一步的，当抗体上糖基的羟基被高碘酸钠氧化成醛基后，使用本发明中的化合物可以快速封闭抗体上的糖基。
进一步的，本发明提供的化合物封闭糖基的反应是一步反应，并且本发明提供的化合物的成本更低。
一种用于检测样品中蛋白上的糖基的抗体芯片，所述抗体芯片或者微孔板上包被抗体，所述抗体采用(a)-(h)中任一项所述的化合物封闭糖基。
进一步的，所述抗体芯片也可称为微孔板、或多孔板。
进一步的，包被抗体后的抗体芯片或者微孔板在低温(例如4-8℃)储存。
一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测样品中蛋白上的糖基的抗体芯片或者微孔板。
进一步的，所述试剂盒还包括植物凝集素。
进一步的，所述植物凝集素选自重组植物凝集素AAL(检测海藻糖)、野生植物凝集素AAL(检测海藻糖)、植物凝集素RCA120(检测葡萄糖酰胺)、或植物凝集素SNA(检测唾液酸)中的一种。
一种抗体芯片的制备方法，所述方法包括：
(1)将抗体(根据不同的抗体每个微孔0.1到10微克抗体)包被到抗体芯片或者微孔板的表面，加入50-250毫摩尔的高碘酸钠，再加入5-50毫摩尔pH 5.0-8.0醋酸钠缓冲液，在冰上2到8℃反应1-3小时，或室温反应0.2-1.0小时；
(2)加入封闭试剂，在室温下用相同的缓冲液孵育0.5-1.5小时；
(3)用小牛血清白蛋白封闭抗体芯片或者微孔板或者抗体芯片的表面0.5-1.5小时。
一种使用上述的试剂盒检测样品中蛋白上的糖基的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)将要检测的血清或者其它待检测溶液在已经封闭的抗体芯片或者微孔板或者抗体芯片上孵育0.5-1.5小时；
(2)在室温下，加入生物素标记的植物凝集素，孵育0.5-1.5小时；
(3)在室温下，加入荧光染料标记的链霉亲和素，孵育0.5-1.5小时，用荧光染料检测结合的植物凝集素的量。
进一步的，所述的抗体芯片的制备方法，所述方法包括：
(1)将抗体包被到微孔板的表面，加入150毫摩尔的高碘酸钠，加入20毫摩尔pH7.0醋酸钠缓冲液，在冰上4℃反应2小时，或室温0.5小时；
(2)加入封闭试剂，在室温下用相同的缓冲液孵育1小时；
(3)用小牛血清白蛋白封闭微孔板或者生物芯片的表面1小时。
进一步的，所述的试剂盒检测样品中蛋白上的糖基的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)将要检测的血清或者其它待检测溶液在已经封闭的微孔板或者生物芯片上孵育1小时；
(2)在室温下，加入生物素标记的植物凝集素，孵育1小时；
(3)在室温下，加入Cy3标记的链霉亲和素，孵育1小时，用Cy3荧光染料检测结合的植物凝集素的量。
进一步的，本发明对所有化合物进行测试。这些化合物可以有效的和被高碘酸钠氧化的抗体上的糖反应，并且有效的抑制了植物凝集素和抗体本身的结合。同时，由于反应条件温和，封闭后的抗体仍然保持了原有的对抗原的识别的特异性。
利用本发明中的化合物封闭抗体上的糖基，有下述优点：
背景干净。化合物的反应性可靠。用化合物封闭抗体的过程简单，为一步反应，缩短了现有封闭抗体的反应过程，由现有的2天缩短到本发明的1天之内完成封闭反应，提高了生产效率。降低成本非常明显，和以前的封闭试剂和封闭方法相比，试剂的成本也便宜，成本减少500倍。利用本发明的化合物封闭后的抗体保留了很好的活性，能进行精确的检测分析。
附图说明
图1为使用本发明的化合物作为封闭试剂，利用抗体芯片或者微孔板上进行酶联免疫反应和植物凝集素对特异蛋白上的糖基进行检测的过程示意图；
图2为实施例1-6提供的抗体芯片上的每个子区域的抗体位置图谱；
图3为实施例1-2提供的抗体芯片的检测结果；
图4为实施例3提供的抗体芯片的检测结果；
图5为实施例5提供的抗体芯片的检测结果；
图6为实施例6提供的抗体芯片的检测结果；
图7为本发明所述化合物的通式结构。
具体实施方式：
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的阐述，以下实施例只是对本发明的详细说明，不是对本发明所请求保护范围的限定。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均为市售产品。
图1中，antibody是抗体，antigen是抗原，biotin-lection是植物凝集素，glycangroups是糖基，blocker是封闭试剂，streptavidin是链霉亲和素。
如图1所示，使用本发明的化合物作为抗体上糖基的封闭试剂(简称封闭剂)，利用酶联免疫反应和植物凝集素对特异蛋白上的糖基进行检测。
使用本发明的化合物作为封闭试剂，利用酶联免疫反应和植物凝集素对特异蛋白上的糖基进行检测的步骤如图1所示，第一步先将抗体包被到抗体芯片或者微孔板或者抗体芯片的表面，加入150毫摩尔的高碘酸钠，加入20毫摩尔pH7.0的醋酸钠缓冲液，室温反应0.5小时，然后加入本发明的化合物，反应1小时，然后用小牛血清(BSA)封闭1小时。将要检测的血清或者其它待检测溶液在已经封闭的抗体芯片或者微孔板或者抗体芯片上孵育1小时，加入生物素标记的植物凝集素孵育1小时，最后使用Cy3荧光染料检测结合的植物凝集素的量，由于抗体捕获血清中特异的蛋白，植物凝集素检测被捕获蛋白上的特异的糖基的数量，这样我们就可以对特异性蛋白上的糖基进行精确定性或定量。
如图1所示，我们已经对本发明提供的化合物进行测试。这些化合物可以有效的和被高碘酸钠氧化的抗体上的糖反应，并且有效的抑制了植物凝集素和抗体本身的结合。同时，由于反应条件温和，封闭后的抗体仍然保持了原有的对抗原的识别的特异性。
虽然本发明提供的化合物都可以用相同的反应过程或者采用相同的封闭方法作为封闭剂使用，但不同的化合物具有不同的反应性、特异性、稳定性和稳定修饰抗体的能力。
实施例1
将抗体包被到抗体芯片的表面，加入150毫摩尔的高碘酸钠，加入20毫摩尔pH7.0醋酸钠缓冲液，在4℃反应2小时；加入封闭试剂a，在室温下用相同的缓冲液孵育1小时；用小牛血清封闭抗体芯片的表面1小时；在室温下，加入生物素标记的植物凝集素AAL，孵育1小时；再加入Cy3标记的链霉亲和素，孵育1小时；对制备的抗体芯片进行微阵列扫描检测，用Cy3荧光染料检测结合的植物凝集素的量，检测结果见图3中的左上方子阵列。
图2为抗体的阵列图，每个抗体重复3次，产生3个130微米直径的圆点。每个点使用(列，行)来表示，如第一行的第一个抗体表示为IgM#1(1,1)(2,1)(3,1)。
图3中每个子阵列的右下角BiotinBSA(7,9)(8,9)(9,9)是阳性对照，可以在其它抗体都不显色的时候，仍然可以判断抗体芯片工作正常。
图3中左上方子阵列所示，当用封闭剂a封闭抗体上的糖基后，用磷酸缓冲液孵育后的大部分抗体(即只加入缓冲液的阴性对照)不显色，说明封闭剂a能够有效的封闭大部分抗体上的糖基。子阵列中的抗体IgM#1(1,1)(2,1)(3,1)和DPPIV(7,7)(8,7)(9,7),经过封闭剂a封闭后仍然显色，表示封闭剂a对这两个抗体封闭并不成功，未有效封闭抗体上的糖基，而其它的抗体在磷酸缓冲液孵育后，没有显色，表明封闭剂a对这些抗体的封闭过程成功，封闭剂a可以有效的封闭这些抗体上的糖基。
如图3中左下方子阵列所示，无封闭剂封闭抗体上糖基的情况下，向抗体芯片的微孔内加入血清孵育后，大部分微孔显色，如图3中右下方子阵列所示，无封闭剂封闭抗体的糖基的抗体芯片，只加入缓冲液的阴性对照也会有一部分显色，说明抗体上的糖基在未封闭的情况下，会干扰检测结果，使检测结果不准确,既假阳性。
实施例2
将抗体包被到抗体芯片的表面，加入150毫摩尔浓度的高碘酸钠在20毫摩尔pH7.0醋酸钠缓冲液在4℃反应2小时；加入封闭试剂f，在室温下用相同的缓冲液孵育1小时；用小牛血清封闭抗体芯片的表面1小时；在室温下，加入生物素标记的植物凝集素AAL，孵育1小时；再加入Cy3标记的链霉亲和素，孵育1小时；对制备的抗体芯片进行微阵列扫描检测，用Cy3荧光染料检测结合的植物凝集素的量，检测结果见图3的右上方子阵列，图2为抗体的阵列图。
如图3右上方子阵列所示，当用封闭剂f封闭抗体上的糖基后，用磷酸缓冲液孵育后的大部分抗体不显色，说明封闭剂f能够有效的封闭大部分抗体上的糖基。由封闭剂f封闭抗体上的糖基后，抗体保留了较好的活性(检测样品中蛋白上的糖基的功能)。子阵列中的抗体IgM#1(1,1)(2,1)(3,1)和DPPIV#1(7,7)(8,7)(9,7),经过封闭剂f封闭后仍然显色，表示封闭剂f对这两个抗体的封闭并不成功，未有效封闭抗体上的糖基，而其它的抗体在和磷酸缓冲液孵育后，没有显色，表明封闭剂f对这些抗体的封闭过程成功，封闭剂f可以有效的封闭这些抗体上的糖基。
如图3中左下方子阵列所示，无封闭剂封闭抗体上糖基的情况下，向抗体芯片的微孔内加入血清孵育后，大部分微孔显色，如图3中右下方子阵列所示，无封闭剂封闭抗体的糖基的抗体芯片，只加入缓冲液的阴性对照也会有一部分显色，说明抗体上的糖基在未封闭的情况下，会干扰检测结果，使检测结果不准确,既假阳性。
实施例3
将抗体包被到抗体芯片的表面；用封闭剂a或封闭剂f封闭抗体上的糖基，用小牛血清封闭抗体芯片的表面1小时；加入血清或缓冲液，在室温下，加入生物素标记的重组植物凝集素AAL(检测海藻糖)、野生植物凝集素AAL(检测海藻糖)、植物凝集素RCA120(检测葡萄糖酰胺)、或植物凝集素SNA(检测唾液酸)，孵育1小时；再加入Cy3标记的链霉亲和素，孵育1小时；对制备的抗体芯片进行微阵列扫描检测，用Cy3荧光染料检测结合的植物凝集素的量。
如图4所示，用封闭剂f封闭抗体上的糖基后，当使用重组植物凝集素AAL(AleuriaAurantia Lectin橙黄网细胞凝集素)检测，阳性对照孔显色，阴性对照孔不显色，加血清样品的微孔显色非常微弱。当使用野生植物凝集素AAL检测，阳性对照孔显色，阴性对照孔不显色，加血清样品的微孔显色不明显。当使用植物凝集素RCA120(Ricinus communisagglutinin 120蓖麻凝集素120)检测，阳性对照孔显色，阴性对照孔不显色，加血清样品的微孔显色明显。当使用植物凝集素SNA(Sambucus nigra(SNA II)(Biotin)/黑接骨木凝集素)检测，阳性对照孔显色，阴性对照孔有微弱显色，加血清样品的微孔显色明显。这说明，用封闭剂f封闭抗体上的糖基，效果最好，且，当用封闭剂f封闭抗体后，使用植物凝集素RCA120检测的效果最好，无背景干扰，检测结果准确。
如图4所示，用封闭剂a封闭抗体上的糖基后，当使用重组植物凝集素AAL检测，阳性对照孔显色，阴性对照孔显色，加血清样品的微孔显色反而少了。当使用野生植物凝集素AAL检测，阳性对照孔显色，阴性对照孔显色，加血清样品的微孔显色。当使用植物凝集素RCA120检测，阳性对照孔显色，阴性对照孔有少量微孔显色，加血清样品的微孔显色明显。当使用植物凝集素SNA检测，阳性对照孔显色，阴性对照孔显色，加血清样品的微孔显色明显。这说明，用封闭剂a封闭抗体上的糖基，效果较好，且，当用封闭剂a封闭抗体后，使用植物凝集素RCA120检测的效果最好，背景干扰少，检测结果较准确。
分析图4，可以得出封闭试剂f的封闭效果高于试剂a：对比芯片的第二列和第四列的检测结果，使用封闭试剂a封闭的抗体芯片明亮部分多于封闭试剂f封闭的抗体芯片，说明封闭试剂f的封闭效率高于a；对比芯片的第一列和第三列的检测结果，可以看到使用封闭剂a的芯片干扰信号较多，使用封闭剂f的芯片干扰信号较少，即封闭试剂封闭抗体的效果不同，导致凝集素与抗体有一部分的结合，影响血清样品糖基的正常检测，进一步说明了封闭剂a的封闭效率低于f。
如磷酸缓冲液的对照所示，大多数抗体没有亮点，表明抗体上的糖基被成功的封闭了。如图中的血清样品所示，抗体仍然可以捕获血清中的特异抗原，表明由封闭剂封闭抗体上的糖基后，抗体保留了较好的活性(检测样品中蛋白上的糖基的功能)。这一结果表明，本发明提供的化合物用作封闭试剂可以有效地，并且高效地阻止凝集素结合到捕获抗体。
实施例4
本发明提供的抗体芯片，一个抗体芯片被食用石蜡分成(4×12)48个完全相同的子区域。图2为抗体芯片上的抗体位置图谱，如图2所示，每个子区域是9×9共81个点的点阵，每个抗体重复打印三次。每个子区域共有26个针对不同抗原的抗体加上1个生物素偶联的牛血清白蛋白作为阳性对照。使用封闭试剂e天冬酰胺酰肼按前述的封闭步骤封闭抗体。
另图2中右方表格内的抗体表示26个抗体和1个生物素的阳性对照，共27个。
实施例5
如图5所示，使用实施例4提供的抗体芯片，使用AAL植物凝集素对23个肝病病人和23个健康人的血清中的不同蛋白上AA的糖基的水平进行检测。
将上述血清样品1:1稀释，将23个健康人的血清样品分别加入到抗体芯片的第1列的1-12行和第3列的1-11行进行孵育；将23个肝病病人的血清样品分别加入到抗体芯片的第2列的1-12行和第4列的1-11行进行孵育；将磷酸缓冲液加入到抗体芯片的第3列第12行和第4列第12行进行孵育，作为阴性对照。稀释的血清样品孵育后，使用AAL植物凝集素平行检测26个抗体捕获的血清中相应的蛋白，对蛋白上的海藻糖的水平进行检测。
从图5中可以得出：本发明中的化合物作为封闭试剂，对大多数抗体的封闭效果好，封闭后的抗体保留了较好的活性。图5中，部分加入健康人的血清样品的子区域，也显示了亮点，这是由于健康人的血清中某种蛋白的糖含量较高，而芯片中的抗体不是仅针对肝癌中特定的蛋白，所述芯片中的抗体也检测出了健康人血清中的某种蛋白。部分加入肝癌病人的血清样品的子区域，未显示亮点，这是由于，不同的肝癌病人分别处于肝癌早期、初期、或中期，而对于不同的肝癌病人，使用不同的抗体进行检测，检测结果也会有所差别。本发明的目的是提供封闭抗体上糖基的封闭试剂，并未选择对肝癌病人特异性的抗体。
实施例6
如图6所示，使用实施例4提供的抗体芯片，使用RCA120植物凝集素对23个肝病病人和23个健康人的血清中的不同蛋白上的糖基的水平进行检测。
将上述血清样品1:1稀释，将23个健康人的血清样品分别加入到抗体芯片的第1列的1-12行和第3列的1-11行进行孵育；将23个肝病病人的血清样品分别加入到抗体芯片的第2列的1-12行和第4列的1-11行进行孵育；将磷酸缓冲液加入到抗体芯片的第3列第12行和第4列第12行进行孵育，作为阴性对照。稀释的血清样品孵育后，使用RCA120植物凝集素平行检测26个抗体捕获的血清中相应的蛋白，对蛋白上的葡萄糖酰胺的水平进行检测。
从图6中可以看出，抗体芯片上第一列和第三列的微孔的显色部分为每个子区域的BSA点阵，说明天冬酰胺酰肼有效封闭了抗体上的糖基，封闭后的抗体对健康人的血清样品的糖基检测未产生干扰信号；加入肝病病人血清样品的子区域有大量抗体微孔显色，说明天冬酰胺酰肼封闭后的抗体保留了与抗原结合的特异性，仍能捕获肝病病人的血清样品的特异性蛋白，从而对蛋白上的葡萄糖酰胺的水平进行检测。
由图5和图6可得出，使用本发明的封闭试剂e(天冬酰胺酰肼)对抗体的糖基进行封闭，并且利用酶联免疫反应和植物凝集素对血液或者其他人体组织或者体液中特异的蛋白上的海藻糖糖基化修饰和葡萄糖酰胺糖基化修饰可以进行定量检测，从而达到检测特定蛋白上的糖基的变化。由此作为一种灵敏的生物标志物对疾病进行诊断。
被封闭抗体的稳定性是指抗体修饰过程简单，对抗体影响小，因此抗体相对稳定，放置时间长，重复性也好。
本发明提供的实施例表明，本发明中的化合物作为封闭试剂，在本发明提供的封闭过程中，对于大多数抗体可以在不影响抗体活性的情况下对抗体的糖基进行封闭。本发明提供的封闭方法的操作时间不到7小时，可在一个工作日内完成。提高了抗体封闭的效率。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡是根据本发明内容所做的均等变化与修饰，均涵盖在本发明的专利范围内。

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物用作抗体的糖基的封闭试剂，所述化合物的通用结构式为：
其中，X选自O，N，或S；Y选自C，N，S，苄基环，氨基酸(谷氨酸除外)，或多肽的侧链基团。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自α-氨基脲、乙酰肼、硫乙酰肼、氨基硫脲、天冬酰胺酰肼、酪氨酸肼、N(苄氧基羰基)-L-缬氨酰-L-酪氨酸酰肼、或N(苄氧基羰基)甘氨酸酰肼中的一种。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述Y是氨基酸的侧链基团、甲基、乙基、或氨基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述X选自O、或S，Y选自甲基、氨基、或氨基酸的侧链基团。
5.一种使用权利要求1所述的化合物封闭抗体的糖基的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)用高碘酸钠将抗体上的糖基上的羟基氧化成醛基；
(2)使化合物中的酰肼基与(1)中的醛基反应。
6.一种用于检测样品中蛋白上的糖基的抗体芯片，其特征在于，所述抗体芯片或者微孔板上包被抗体，所述抗体采用权利要求1-4中任一项所述的化合物封闭糖基。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述的用于检测样品中蛋白上的糖基的抗体芯片或者微孔板。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括植物凝集素。
9.一种权利要求6所述的抗体芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将抗体(根据不同的抗体每个微孔0.1到10微克抗体)包被到抗体芯片或者微孔板的表面，加入50-250毫摩尔的高碘酸钠，再加入5-50毫摩尔pH5.0-8.0的醋酸钠缓冲液，在冰上2到8℃反应1-3小时，或室温反应0.2-1.0小时；
(2)加入封闭试剂，在室温下用相同的缓冲液孵育0.5-1.5小时；
(3)用小牛血清白蛋白封闭抗体芯片或者微孔板或者抗体芯片的表面0.5-1.5小时。
10.一种使用权利要求7所述的试剂盒检测样品中蛋白上的糖基的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)将要检测的血清或者其它待检测溶液在已经封闭的抗体芯片或者微孔板或者抗体芯片上孵育0.5-1.5小时；
(2)在室温下，加入生物素标记的植物凝集素，孵育0.5-1.5小时；
(3)在室温下，加入荧光染料标记的链霉亲和素，孵育0.5-1.5小时，用荧光染料检测结合的植物凝集素的量。
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