CN108785342A - 一种具有降血糖活性的辣木叶提取物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有降血糖活性的辣木叶提取物及其制备方法。该制备方法采用粉碎过筛、碱法处理、蛋白酶酶解、纤维素酶酶解、高压均质、高温提取、低温高速离心、超滤分离浓缩、蛋白酶酶解、低温高速离心、二次超滤分离浓缩、冷冻干燥等工艺，得到一种具有降血糖活性的辣木叶提取物。该提取物多糖含量>30%，经过2型糖尿病大鼠动物实验模型验证具有良好的降血糖活性，能够有效地降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖并增强其口服葡萄糖耐受量，其作用效果与等剂量的二甲双胍相近。本发明提取工艺简单、整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域当中。

Description

一种具有降血糖活性的辣木叶提取物及其制备方法
技术领域
本发明属于辣木叶深加工、高值化领域，具体涉及一种具有降血糖活性的辣木叶提取物及其制备方法。
背景技术
目前，随着生活水平的提高，糖尿病的发病率逐年增加，己成为继肿瘤、心脑血管疾病之后的第三位严重危害人类健康的慢性疾病。由于糖尿病给人类带来的巨大危害，世界卫生组织称之为21世纪的灾难。2015年全球糖尿病患者数量上升到4.15亿。因此，具有降血糖活性、安全性高的植物提取物的开发具有显著的社会经济效益。
辣木（Moringa oleifera Lam.），原产于印度，是辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，广泛种植于亚洲和非洲热带和亚热带地区，在我国广东、广西、云南、福建、台湾等地引种栽培。辣木，具有环境适应性强、生长快速、营养丰富全面、多种生物活性等优点。辣木的叶、花、种子、茎、根等部位均具有食用以及药用价值，辣木在印度传统医学中应用历史悠久，具有潜在的开发前景。2012年，辣木叶被我国卫生部批准作为新资源食品。辣木叶含有丰富的蛋白质（干叶粗蛋白含量27%-30.3%）、矿物质、维生素、不饱和脂肪酸、糖苷、多酚类化合物、甾醇及生物碱。辣木叶具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂、降血压等多种生物活性。
然而，对于辣木叶提取物降血糖产品尚未有相关的报道。本发明提供了一种辣木叶提取物及其制备方法，通过动物模型验证该辣木叶提取物体内降血糖活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，得到一种具有良好降血糖活性的辣木叶提取物。该提取物多糖含量>30%，通过动物实验验证具有良好的降血糖功效。本发明提取工艺简单、整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域当中。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，以辣木干叶为原料，采用粉碎过筛、碱法处理、蛋白酶酶解、纤维素酶酶解、高压均质、高温提取、低温高速离心、超滤分离浓缩、蛋白酶酶解、二次超滤分离浓缩、冷冻干燥等工艺进行纯化，得到一种具有良好降血糖活性的辣木叶提取物。该提取物多糖质量含量>30%，具有良好的降血糖功效。
进一步地，上述具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法具体包括：
（1）粉碎过筛：将干辣木叶粉碎后过筛，得到辣木叶干粉。
（2）碱法处理：将步骤（1）所得辣木叶干粉与去离子水混合均匀，加入氢氧化钠调节pH，恒温搅拌，得混悬液1。
（3）蛋白酶酶解：在混悬液1中加入蛋白酶，恒温搅拌进行酶解，得混悬液2。
（4）纤维素酶酶解：在混悬液2中加入纤维素酶，恒温搅拌进行酶解，得混悬液3。
（5）高压均质：将混悬液3高速剪切后过胶体磨，高压均质后，得混悬液4。
（6）高温提取：加热混悬液4，高温提取后，得混悬液5。
（7）低温高速离心：混悬液5冷却至室温后，低温高速离心后，取上清液，得提取液1。
（8）超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液1，得提取液2。
（9）蛋白酶酶解：在提取液2中加入蛋白酶，恒温搅拌进行酶解，得提取液3。
(10) 低温高速离心：提取液3冷却至室温后，低温高速离心后，取上清液，得提取液4。
（11）二次超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液4，得提取液5。
（12）冷冻干燥：对提取液5进行冷冻干燥，得辣木叶提取物。
进一步地，步骤（1）中，所述过筛是过80~100目筛。
进一步地，步骤（2）中，所述辣木叶干粉与去离子水的料液比为1:10~25g/mL。
进一步地，步骤（2）中，所述氢氧化钠调节pH范围为8.0~9.0。
进一步地，步骤（2）中，所述提取温度为45~55℃，搅拌速率为120~180r/min，处理时间为30~60min。
进一步地，步骤（3）中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和NS37071碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量占总酶量的70~90%， NS37071碱性蛋白酶的加入量占总酶量的10~30%；加入蛋白酶的总量为4%~8%辣木干叶粉重。
进一步地，步骤（3）中，所述酶解温度为45~55℃，搅拌速率为120~180r/min，酶解时间为4~12h。
进一步地，步骤（4）中，所述加入纤维素酶的加入量为3%~6%辣木干叶粉重。
进一步地，步骤（4）中，所述酶解温度为45~55℃，搅拌速率为120~180r/min，酶解时间为6~10h。
进一步地，步骤（5）中，所述高速剪切，剪切速率为8000~10000rpm，剪切时间为6~10min。
进一步地，步骤（5）中，所述过胶体磨，次数为2~3次。
进一步地，步骤（5）中，所述高压均质处理，高压均质机的均质压力为20~40MPa，均质次数为2~3次。
进一步地，步骤（6）中，所述高温提取，提取温度为95~105℃，提取时间为30~60min。
进一步地，步骤（7）、（10）中，所述低温高速离心，温度为4~10℃，离心力为8000~10000g，离心时间为15~20min。
进一步地，步骤（8）、（11）中，所述超滤膜分子量为10000Da，超滤次数为4~6次。
进一步地，步骤（8）、（11）中，所述提取液2、提取液5，为分子量>10000Da的超滤截留液。
进一步地，步骤（9）中，所述加入蛋白酶为胰酶，加入量为固形物质量的1~3%。
进一步地，步骤（9）中，酶解温度为45~55℃，搅拌速率为120~180r/min，酶解时间为2~4h。
一种具有降血糖活性的辣木叶提取物，由上述制备方法制备。
所制得的辣木叶提取物具体涉及有2型糖尿病大鼠动物模型的降血糖活性及增强口服葡萄糖耐受量的活性，可用于制备降血糖类保健品或辅助性治疗药物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
（1）本发明的制备方法制备得到一种主要含辣木叶大分子活性物质的具有良好降血糖作用的辣木叶提取物，该提取物多糖含量>30%。
（2）本发明的整个制备工艺流程均可达食品级要求。
（3）本发明所得辣木叶提取物经过2型糖尿病大鼠动物实验模型验证具有良好的降血糖活性，能够有效地降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖并增强其口服葡萄糖耐受量，其作用效果与等剂量的二甲双胍相近。可用于制备降血糖类保健品或辅助性治疗药物。
附图说明
图1为实施例1~3所得辣木叶提取物对二型糖尿病大鼠空腹血糖值的作用效果柱状图。
图2为实施例1~3所得辣木叶提取物灌胃二型糖尿病大鼠4周后，进行口服葡萄糖耐受量测试（Oral Glucose Tolerance Test, OGTT）所得血糖—时间变化曲线。
图3为实施例1~3所得辣木叶提取物对二型糖尿病大鼠口服葡萄糖耐受量（口服葡萄糖耐受量以OGTT所得血糖—时间变化曲线下面积表示，即AUC, Area Under Curve）的作用效果柱状图。
具体实施方式
下面将具体阐明动物实验的具体操作并结合附图和具体实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
1、2型糖尿病大鼠模型降血糖动物实验具体操作：
（1）实验动物：雄性SD大鼠，21d龄，100g~110g，购于广东省医学实验动物中心。
（2）动物饲养环境：室温22±2℃，相对湿度50%~70% ,每日光照黑暗各12小时，饮用水采用反渗透紫外灭菌水。
（3）动物实验：适应性饲养7天结束后，随机分为实验组、正常组（12只）。实验组大鼠开始喂养45%高脂饲料4周，正常组大鼠同时喂养普通饲料。4周后，实验组大鼠禁食12h后，注射链脲佐菌素STZ（25mg/kg体重/d，连续注射两天），注射3天后，测量空腹血糖，空腹血糖值>11.1mmol/L的认为造模成功。按空腹血糖值将造模成功的实验组大鼠随机分成5组，每组n=12只，分别为模型组、阳性药物组（二甲双胍，500mg/kg体重）、辣木叶提取物1组（500mg/kg体重）、辣木叶提取物2组（500mg/kg体重）、辣木叶提取物3组（500mg/kg体重）。造模结束后对大鼠进行灌胃（正常组及模型组大鼠灌胃生理盐水），灌胃4周。每周测量一次大鼠空腹血糖值，四周后测量大鼠口服葡萄糖糖耐受量。
2、大鼠空腹血糖的测定方法：
大鼠禁食12h后，采用血糖仪、通过尾静脉采血测定大鼠空腹血糖值，其中，血糖仪型号为罗氏血糖仪NC型号。
3、大鼠口服葡萄糖耐受量的测定方法：
配置0.5g/mL的葡萄糖溶液，大鼠禁食12h后测定空腹血糖值，后按2g葡萄糖/kg体重的量灌胃大鼠定量葡萄糖，并于灌胃后30min、1h、2h采用血糖仪、通过尾静脉采血测定大鼠血糖值。以血糖值为纵坐标、时间为横坐标作图，得大鼠口服葡萄糖耐受量测试OGTT血糖—时间变化曲线，所得血糖—时间变化曲线下面积AUC表征大鼠口服葡萄糖耐受量。
实施例1
一种具有降血糖活性的辣木叶提取物，具体包括如下步骤：
（1）粉碎过筛：将干辣木叶粉碎后过80目筛，得到辣木叶干粉。
（2）碱法处理：将辣木叶干粉与去离子水按料液比1:10g/mL混合均匀，加入氢氧化钠调节pH至8.0，45℃恒温，120r/min搅拌30min，得混悬液1。
（3）蛋白酶酶解：在混悬液1中按4%辣木干叶粉重加入蛋白酶，其中，木瓜蛋白酶加入量占总酶量70%，NS37071碱性蛋白酶加入量占总酶量30%，45℃恒温，120r/min搅拌，酶解4h，得混悬液2。
（4）纤维素酶酶解：在混悬液2中按3%辣木干叶粉重加入纤维素酶，45℃恒温，120r/min搅拌，酶解6h，得混悬液3。
（5）高压均质：将混悬液3以8000rpm剪切速率高速剪切6min，后过2次胶体磨，以20MPa均质压力高压均质2次，得混悬液4。
（6）高温提取：将混悬液4加热至95℃，高温提取30min，得混悬液5。
（7）低温高速离心：将混悬液5冷却至室温后，4℃低温，8000g高速离心15min，取上清液，得提取液1。
（8）超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液1，超滤4次，取分子量>10000Da的组分，得提取液2。
（9）蛋白酶酶解：在提取液2中按固形物质量的1%加入胰酶，45℃恒温，120r/min搅拌，酶解2h，得提取液3。
(10) 低温高速离心：将提取液3冷却至室温后，4℃低温，8000g高速离心15min，取上清液，得提取液4。
（11）二次超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液4，超滤4次，取分子量>10000Da的组分，得提取液5。
（12）冷冻干燥：对提取液5进行冷冻干燥，得辣木叶提取物1。多糖质量含量为33.3%。
实施例2
一种具有降血糖活性的辣木叶提取物，具体包括如下步骤：
（1）粉碎过筛：将干辣木叶粉碎后过80目筛，得到辣木叶干粉。
（2）碱法处理：将辣木叶干粉与去离子水按料液比1:17.5g/mL混合均匀，加入氢氧化钠调节pH至8.5，50℃恒温，150r/min搅拌45min，得混悬液1。
（3）蛋白酶酶解：在混悬液1中按6%辣木干叶粉重加入蛋白酶，其中，木瓜蛋白酶加入量占总酶量80%，NS37071碱性蛋白酶加入量占总酶量20%，50℃恒温，150r/min搅拌，酶解8h，得混悬液2。
（4）纤维素酶酶解：在混悬液2中按4.5%辣木干叶粉重加入纤维素酶，50℃恒温，150r/min搅拌，酶解8h，得混悬液3。
（5）高压均质：将混悬液3以9000rpm剪切速率高速剪切8min，后过2次胶体磨，以30MPa均质压力高压均质2次，得混悬液4。
（6）高温提取：将混悬液4加热至100℃，高温提取45min，得混悬液5。
（7）低温高速离心：将混悬液5冷却至室温后，7℃低温，9000g高速离心17.5min，取上清液，得提取液1。
（8）超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液1，超滤5次，取分子量>10000Da的组分，得提取液2。
（9）蛋白酶酶解：在提取液2中按固形物质量的2%加入胰酶，50℃恒温，150r/min搅拌，酶解3h，得提取液3。
(10) 低温高速离心：将提取液3冷却至室温后，7℃低温，9000g高速离心17.5min，取上清液，得提取液4。
（11）二次超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液4，超滤5次，取分子量>10000Da的组分，得提取液5。
（12）冷冻干燥：对提取液5进行冷冻干燥，得辣木叶提取物2。多糖质量含量为31.2%。
实施例3
一种具有降血糖活性的辣木叶提取物，具体包括如下步骤：
（1）粉碎过筛：将干辣木叶粉碎后过100目筛，得到辣木叶干粉。
（2）碱法处理：将辣木叶干粉与去离子水按料液比1:25g/mL混合均匀，加入氢氧化钠调节pH至9.0，55℃恒温，180r/min搅拌60min，得混悬液1。
（3）蛋白酶酶解：在混悬液1中按8%辣木干叶粉重加入蛋白酶，其中，木瓜蛋白酶加入量占总酶量90%，NS37071碱性蛋白酶加入量占总酶量10%，55℃恒温，180r/min搅拌，酶解12h，得混悬液2。
（4）纤维素酶酶解：在混悬液2中按6%辣木干叶粉重加入纤维素酶，55℃恒温，180r/min搅拌，酶解10h，得混悬液3。
（5）高压均质：将混悬液3以10000rpm剪切速率高速剪切10min，后过3次胶体磨，以40MPa均质压力高压均质3次，得混悬液4。
（6）高温提取：将混悬液4加热至105℃，高温提取60min，得混悬液5。
（7）低温高速离心：将混悬液5冷却至室温后，10℃，10000g高速离心20min，取上清液，得提取液1。
（8）超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液1，超滤6次，取分子量>10000Da的组分，得提取液2。
（9）蛋白酶酶解：在提取液2中按固形物质量的3%加入胰酶，55℃恒温，180r/min搅拌，酶解4h，得提取液3。
(10) 低温高速离心：将提取液3冷却至室温后，10℃，10000g高速离心20min，取上清液，得提取液4。
（11）二次超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液4，超滤6次，取分子量>10000Da的组分，得提取液5。
（12）冷冻干燥：对提取液5进行冷冻干燥，得辣木叶提取物3。多糖质量含量为32.1%。
动物实验结果分析
1、大鼠空腹血糖的实验结果分析：
本次实验分为实验组和对照组，实验组有5组，对照组有1组，每组大鼠12只（n=12）。在图1从左往右，每组对象分别表示正常组、糖尿病模型组、二甲双胍药物组（500mg/kg）、辣木叶提取物1组（500mg/kg）、辣木叶提取物2组（500mg/kg）、辣木叶提取物3组（500mg/kg）。带“*”符号表示在相同时期条件下，该组与正常组的空腹血糖值相比具有显著性差异（p<0.05）;带“#”符号表示在相同时期条件下，该组与模型组的空腹血糖值相比具有显著性差异（p<0.05）。带字母“a”表示这些组别间无显著性差异（p>0.05）。
由图1可知，在适应性饲养结束时，各组大鼠空腹血糖值没有显著性差异（n=12，p>0.05）。在造模后，各实验组大鼠之间空腹血糖值没有显著性差异（n=12，p>0.05），而各实验组均与正常组大鼠空腹血糖值具有显著性差异（n=12，p<0.05）。通过4周的灌胃实验后，二甲双胍药物组（500mg/kg体重）与辣木叶提取物1~3组（500mg/kg体重）的大鼠空腹血糖值均显著下降，并在第3、4周时与糖尿病模型组大鼠具有显著性差异（n=12，p<0.05）。同时，在第4周时，统计学分析表明，二甲双胍药物组与辣木叶提取物1~3组的大鼠空腹血糖值没有显著性差异（n=12，p>0.05）。由此说明，本发明所得辣木叶提取物能够有效降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖值，其降低空腹血糖的作用效果与等剂量二甲双胍效果相近。
2、大鼠口服葡萄糖耐受量测试的实验结果分析：
图2的曲线从上到下表示糖尿病模型组、辣木叶提取物1组（500mg/kg）、辣木叶提取物3组（500mg/kg）、辣木叶提取物2组（500mg/kg）、二甲双胍药物组（500mg/kg）、正常组。
由图2可知，在大鼠灌胃4周后，辣木叶提取物1~3组大鼠在禁食12h后灌胃定量葡萄糖后，其血糖—时间曲线位于糖尿病模型组下方，而位于二甲双胍药物组略上方。
图3从左往右，分别表示正常组、2型糖尿病模型组、二甲双胍药物组（500mg/kg）、辣木叶提取物1组（500mg/kg）、辣木叶提取物2组（500mg/kg）、辣木叶提取物3组（500mg/kg）。每个对象上标注字母“a”或“b”或“c”，标注了相同字母的分组表示它们间没有显著性差异（p>0.05），标注了不同字母的分组表示它们间有显著性差异（p<0.05）。
由附图图3可知，图2中，所得曲线下面积AUC表示大鼠口服葡萄糖耐受量，辣木叶提取物1~3组大鼠口服葡萄糖耐受量较糖尿病模型组显著性增强（n=12，p<0.05）而与二甲双胍药物组没有显著性差异（n=12，p>0.05）。
本发明实施例可见，整个制备工艺流程简单、各环节均可达食品级要求，制备成本低。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，其特征在于，辣木叶依次经过粉碎过筛、碱法处理、蛋白酶酶解、纤维素酶酶解、高压均质、高温提取、低温高速离心、超滤分离浓缩、蛋白酶酶解、低温高速离心、二次超滤分离浓缩和冷冻干燥，得到具有降血糖活性的辣木叶提取物。
2.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）粉碎过筛：将干辣木叶粉碎后过筛，得到辣木叶干粉；
（2）碱法处理：将步骤（1）所得辣木叶干粉与去离子水混合均匀，加入氢氧化钠调节pH，恒温搅拌，得混悬液1；
（3）蛋白酶酶解：在混悬液1中加入蛋白酶，恒温搅拌进行酶解，得混悬液2；
（4）纤维素酶酶解：在混悬液2中加入纤维素酶，恒温搅拌进行酶解，得混悬液3；
（5）高压均质：将混悬液3高速剪切后过胶体磨，高压均质后，得混悬液4；
（6）高温提取：加热混悬液4，高温提取后，得混悬液5；
（7）低温高速离心：混悬液5冷却至室温后，低温高速离心后，取上清液，得提取液1；
（8）超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液1，得提取液2；
（9）蛋白酶酶解：在提取液2中加入蛋白酶，恒温搅拌进行酶解，得提取液3；
(10) 低温高速离心：提取液3冷却至室温后，低温高速离心后，取上清液，得提取液4；
（11）二次超滤分离浓缩：采用超滤膜超滤分离提取液4，得提取液5；
（12）冷冻干燥：对提取液5进行冷冻干燥，得辣木叶提取物，该提取物多糖含量>30%，具有降血糖功效。
3.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述过筛是过80~100目筛。
4.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，步骤（2）中，辣木叶干粉与去离子水的料液比为1:10~25g/mL；所述调节pH值为8.0~9.0，温度为45~55℃，搅拌速率为120~180r/min，处理时间为30~60min；步骤（3）中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和NS37071碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量占总酶量的70~90%，NS37071碱性蛋白酶的加入量占总酶量的10~30%；加入蛋白酶的总量为4%~8%辣木干叶粉重，酶解温度为45~55℃，搅拌速率为120~180r/min，酶解时间为4~12h；步骤（4）中，所述纤维素酶的加入量为3%~6%辣木干叶粉重，酶解温度为45~55℃，搅拌速率为120~180r/min，酶解时间为6~10h。
5.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，步骤（5）中，所述高速剪切处理，剪切速率为8000~10000 rpm，剪切6~10min，过胶体磨次数为2~3次，高压均质机的均质压力为20~40MPa，均质次数为2~3次。
6.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，步骤（6）中，所述高温提取，提取温度为95~105℃，提取时间为30~60min。
7.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，步骤（7）、（10）中，所述低温高速离心，温度为4~10℃，离心力为8000~10000 g，离心时间为15~20min。
8.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，步骤（8）、（11）中，所述超滤膜分子量为10000Da，超滤次数为4~6次，所述提取液2、提取液5为分子量>10000Da的超滤截留液。
9.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物的制备方法，步骤（9）中，所述加入蛋白酶为胰酶，加入量为固形物质量的1~3%，酶解温度为45~55℃，搅拌速率为120~180r/min，酶解时间为2~4h。
10.由权利要求1~9任一项所述制备方法制得的一种具有降血糖活性的辣木叶提取物。
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Assignee: Jiangxi tadpole Technology Co.,Ltd.

Assignor: SOUTH CHINA University OF TECHNOLOGY

Contract record no.: X2022440000052

Denomination of invention: The invention relates to a spicy wood leaf extract with hypoglycemic activity and a preparation method thereof

Granted publication date: 20210716

License type: Common License

Record date: 20220720

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