CN108774282A - 一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷 - Google Patents

一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷，本发明中所述的达玛烷型三萜皂苷及达玛烷型三萜皂苷组分，对果蝇阿兹海默症果蝇模型的学习记忆能力具有显著的挽救效果，具有很好的治疗阿尔茨海默症的作用。

Description

一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷
技术领域
本发明具体涉及一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷。
背景技术
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)是葫芦科绞股蓝属多年生草质攀缘植物，又名第二人参、不老长生草、福音草等。该属植物基源复杂、品种繁多，广泛分布于亚热带国家和地区。全世界约有16种和3变种，我国有14种和3变种，主要分布在陕西、云南、甘肃、湖南、湖北、广西等省。
该植物味苦、微甘，性凉，无毒；归肺、脾、肾经；具有补益脾气，化痰止咳，清热解毒之功效。绞股蓝可全草入药，具有延缓衰老、抗疲劳、抗癌、改善脑力活动、提高大脑机能、增强人体免疫力、调节内分泌、降低胆固醇和转氨酶、抑制溃疡、缓解紧张、镇静、镇痛等功效，尤其在防治老年病方面具有积极作用。
现代研究表明，绞股蓝中主要活性成分是达玛烷型三萜皂苷，目前已经从中分离得到200余个达玛烷型三萜皂苷。达玛烷型三萜皂苷具有多种药理活性，如、抑制神经细胞凋亡、保护神经细胞以及促进学习记忆能力、抗衰老、抗肿瘤、保护心脑血管、降血糖、调血脂、增强免疫力、保肝等。通过对绞股蓝中达玛烷型三萜皂苷进行果蝇阿兹海默症果蝇模型的学习记忆能力挽救效果研究，寻找具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷，对抗阿尔茨海默病的新药研究以及绞股蓝的开发利用都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷，另一目的是提供一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的制备方法，还有一目的是提供一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的制备方法。
为了满足上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷，其特征在于所述达玛烷型三萜皂苷的结构通式同下：
其中R1选自以下基团：
-CH3、-CHO；
其中R2选自以下基团：
-H、-OH；
其中R3选自以下基团：
-H、-OH；
基团R4选自以下基团：
-OH、-O(CH2)nCH3(n＝1，2，......30)；
其中基团R5选自以下基团：
化合物20位、21位和23位的绝对构型各自独立的为：(20R,21R, 23R)、(20R,21R,23S)、(20R,21S,23R)、(20R,21S,23S)、(20S,21R, 23R)、(20S,21R,23S)、(20S,21S,23R)、(20S,21S,23S)。
优选的，所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的制备方法，具体步骤如下：
2.1将绞股蓝全草粉碎，粉碎至长度小于1厘米，再用体积百分数为30％～90％的乙醇、体积百分数为30％～100％的甲醇、乙酸乙酯或丙酮其中的一种为提取溶剂，通过提取方法为室温冷浸提取、加热回流提取或室温渗漉提取中的一种方法对粉碎后的绞股蓝全草进行提取得提取液，再减压至-0.05～-0.09MPa浓缩所得提取液，浓缩至浸膏为粘稠溶液，得总浸膏A；
2.2将总浸膏A进行D101大孔吸附树脂柱层析，分别用水、甲醇、甲醇的水溶液等份收集洗脱液，将所得洗脱液浓缩至稠膏，分别得到洗脱液为水的浸膏B、洗脱液体积比为30％甲醇的浸膏C、洗脱液体积比为50％甲醇的浸膏D、洗脱液体积比为70％甲醇的浸膏E、洗脱液体积比为90％甲醇的浸膏F、洗脱液为甲醇的浸膏G；
2.3分别对浸膏B、浸膏C、浸膏D、浸膏E、浸膏F、浸膏G 进行硅胶柱层析、ODS反相柱层析、薄板制备层析、MCI柱层析、制备HPLC或Sephedex LH-20柱层析中的一种层析方法，用体积比为0:100～100:0的甲醇/水、体积比为0:100～100:0的氯仿/甲醇、体积比为0:100～100:0的氯仿/丙酮、体积比为0:100～100:0的石油醚/ 丙酮、或体积比为0:100～100:0的石油醚/乙酸乙酯中的一种洗脱剂洗脱，得到不同的浸膏组分；
2.4对实验步骤2.3所得到的浸膏组分进行硅胶柱层析、薄板制备层析、制备型高效液相色谱仪进行分离纯化，得到多种活性化合物，通过核磁共振谱(NMR谱)，确定各活性化合物的结构。
优选的，所述步骤2.4硅胶柱层析所用硅胶的目数为200-300目。
优选的，所述步骤2.4硅胶柱层析所用洗脱剂氯仿/甲醇体系中氯仿与甲醇的体积比为30:1～1:1。
优选的，所述步骤2.4制备型高效液相色谱仪所用流动相甲醇/ 水体系中甲醇与水的体积比为60:40～100:0。
优选的，所述步骤2.5所述薄板制备层析所用硅胶型号为化学纯 GF254。
优选的，所述达玛烷型三萜皂苷具有对果蝇阿兹海默症果蝇模型的学习记忆能力挽救效果。
优选的，所述达玛烷型三萜皂苷及其达玛烷型三萜皂苷组分在治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
优选的，所述达玛烷型三萜皂苷组分为两种或两种以上达玛烷型三萜皂苷的组合。
优选的，所述达玛烷型三萜皂苷及达玛烷型三萜皂苷组分的应用包括以下操作步骤：
10.1AD果蝇模型建立：
本实验中使用的所有果蝇均经过至少5代的回交，使之均处于 w1118(isoCJ1)的遗传背景下，以避免不同遗传背景对结果的影响，因此，w1118(isoCJ1)简称为“2U”品系的果蝇作实验对照组背景果蝇，致病性可调控人源Aβ42蛋白通过和启动Aβ42基因表达的果蝇Gal4line elav-GAL4c155杂交后，其子代会在神经系统中表达Aβ42蛋白，将 P35与遗传背景果蝇2U杂交，其子代果蝇则不会表达Aβ42蛋白在分析前1小时，苍蝇被移到黑暗的房间里，以便苍蝇能够熟悉环境，所述致病性可调控人源UAS-Aβ42被称为H29.3，所述果蝇Gal4 line elav-GAL4c155称为P35；
10.2样品测试溶液配制
称取适量待测样品，使用DMSO配制成10mM母液，之后，吸取部分10mM母液，用DMSO稀释成1mM的母液，再用4％蔗糖水稀释成10μM工作液，所述DMSO终浓度为1％，所有化合物的工作液均为透明澄清溶液，工作液存放于-20℃冰箱中，备用。
10.3阳性药物对照组溶液配制
对照化合物美金刚MEM的母液存储于-20℃冰箱中，喂药开始前一天，MEM会以4％蔗糖工作液稀释至10μM或100μM，存放于-20℃冰箱中，备用。
10.4分组
①遗传背景对照组：2U×H29.3；
②Aβ42疾病对照组：P35×H29.3；
③阳性药物对照组：MEM 10μM或100μM，PC；
④样品组：
10.5果蝇饲养
所有果蝇在24℃和40～60％相对湿度RH，每天12小时光照的标准环境中饲养，子代果蝇羽化后的第二日起，选择新孵出的2U×H29.3雄果蝇和P35×H29.3果蝇(AD果蝇)并放入小瓶，每小瓶含有大约120只果蝇，在喂药过程中将这些果蝇放置在29℃和40±15％RH条件下，将果蝇从第2天至第8天喂药4小时后转移到新的小瓶中，将所有果蝇放置在29℃和40±15％RH条件下直到巴甫洛夫嗅觉学习测定前1小时；
10.6巴甫洛夫式嗅觉记忆
学习记忆测试是在25℃和70％相对湿度的恒温恒湿避光的行为房中进行，在训练期间，将约100只果蝇装入一个内铺有铜网的训练管，先后通入3-辛醇(3-OCT)和4-甲基环己醇(4-MCH)两种气味的气体，每种气味持续60秒，中间间隔45秒的新鲜空气，当且仅当果蝇闻到第一种气味(CS+)时，果蝇受到60V的脉冲电击刺激，脉冲时长1.5s，间隔3.5s；果蝇闻到第二种气味(CS-)时不给于电击，如此完成一个训练周期；测试阶段，将果蝇在完成一个训练周期后立即转移到T-Maze的选择点，然后在2分钟内，同时从相对的两个方向分别通入两种气味，之后，分别统计处于不同容器的果蝇，并计算行为指数PI，得到的两个PI的平均值作为一次实验的PI使用，PI＝0 表示果蝇对于两种气味的选择为1:1，表明果蝇无法记忆点击与气味的联系；PI＝100表明全部果蝇均会记住气味和点击的联系，会依照气味避免遭受点击，行为指数的计算公式为：PI＝[(CS-)－(CS+)]/ [(CS-)+(CS+)]×100。
本发明的有益效果为：绞股蓝提取物具有显著的抗阿尔茨海默病 (AD)活性，绞股蓝中发现一类达玛烷型三萜皂苷，该类达玛烷型三萜皂苷的化合物及其组分对果蝇阿兹海默症果蝇模型的学习记忆能力具有显著的挽救效果，具有治疗AD的作用。达玛烷型三萜皂苷及达玛烷型三萜皂苷组分的改善转基因果蝇阿尔茨海默病模型学习记忆的研究，为AD的治疗提供了一种研究思路，为AD治疗药物的研制提供了药理基础支持。
附图说明
图1为化合物1-18对果蝇阿兹海默症果蝇模型的学习记忆能力的挽救效果。
具体实施方式
化合物1-18的提取纯化实验，化合物结构见图1。
实施例1：
将干燥的绞股蓝全草2.0Kg，粉碎至1cm，用体积百分数为70％的乙醇室温冷浸浸提取3次、每次7天，减压-0.05MPa浓缩提取液至浸膏为粘稠溶液，得总浸膏A1为30.0g。
实施例2
将干燥的绞股蓝全草2.0Kg，粉碎至0.8cm，用体积百分数为60％的甲醇加热回流提取3次、每次7天，减压-0.07MPa浓缩提取液至浸膏为粘稠溶液，得总浸膏A2为30.0g。
实施例3
将干燥的绞股蓝全草2.0Kg，粉碎至0.8cm，用乙酸乙酯室温渗漉提取3次、每次7天，减压-0.08MPa浓缩提取液至浸膏为粘稠溶液，得总浸膏A3为30.0g。
实施例4
将干燥的绞股蓝全草2.0Kg，粉碎至1cm，用丙酮室温渗漉提取 3次、每次7天，减压-0.09MPa浓缩提取液至浸膏为粘稠溶液，得总浸膏A4为30.0g。
实施例5
②将实施例2中的总浸膏A2进行D101大孔吸附树脂柱层析，用水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、90％甲醇、甲醇为洗脱剂3 倍柱体积洗脱，同比例洗脱液合并、浓缩，得到浸膏B(水)、浸膏 C(30％甲醇)、浸膏D(50％甲醇)、浸膏E(70％甲醇)、浸膏F(90％甲醇、甲醇)、浸膏G(甲醇)；
③用200目的硅胶对浸膏C(30.0g)进行硅胶柱层析，用氯仿/ 甲醇(10:1-1:1，v/v)为洗脱剂反复洗脱，分离纯化，得到C-1～C-6 组分，用300目的硅胶对浸膏C-2进行硅胶柱层析分离，用石油醚/ 乙酸乙酯(10:1-1:1，v/v)为洗脱剂反复洗脱，分离纯化，得到C-2-1 组分，该组分用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相：70％甲醇/水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，分别在34min分离得到化合物18和62min分离得到化合物9；C-3组分用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相：80％甲醇/水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，在39min得到纯化合物6；C-4组分用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相：77％甲醇/水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，分别在40min得到化合物11，45min得到化合物12；C-4组分用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相： 75％甲醇/水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，分别在40min 得到化合物10；
④对浸膏D用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相： 84％甲醇/水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，分别在30min 得到纯化合物16和37min得到纯化合物17；
⑤对浸膏E用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相：86％甲醇/水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，分别在31min得到纯化合物14和46min得到纯化合物15,51min得到纯化合物8和 E-1组分；E-1组分用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相：80％甲醇/水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，分别在33min 得到化合物13，在36min得到化合物7；
⑥对浸膏F进行硅胶柱层析，用氯仿/甲醇(20:1-1:1，v/v)为洗脱剂反复洗脱，分离纯化，得到F-1～F-3组分，F-1组分用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相：73％甲醇/水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，分别在20min得到纯化合物3；F-2用氯仿/甲醇(40:1-1:1，v/v)为洗脱剂反复洗脱，分离纯化，得到F-2-1组分, 该组分用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相：77％甲醇/ 水，流速：10ml/min，检测波长：208nm)，分别在28min得到化合物4，在21min得到化合物5；F-3用氯仿/甲醇(40:1-1:1，v/v)为洗脱剂反复洗脱，分离纯化得到化合物2和F-3-1组分，F-3-1组分用制备型高效液相色谱仪进行分离纯化(流动相：95％甲醇/水，流速： 10ml/min，检测波长：208nm)，分别在10min得到化合物1。
通过核磁共振波谱(NMR谱)解析确定化合物1-18的结构，结构式和数据如下：
化合物1
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.30(d,J＝8.8Hz,H-24),5.20(m,H-23),4.32 (d,J＝7.8Hz,H-1′),3.83(m,Ha-6′),3.67(dd,J＝11.9,5.0Hz,Hb-6′),3.18(m,H-3), 2.50(dd,J＝13.2,7.1Hz,Ha-22),1.78(s,CH3-26),1.76(s,CH3-27),1.04(s, CH3-28),1.03(s,CH3-18),0.92(s,CH3-30),0.90(s,CH3-19),0.85(s,CH3-29),0.80 (d,J＝11.7Hz,H-5)；碳谱数据见表1。
化合物2
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.21(d,J＝8.8Hz,H-24),5.35(m,H-23),4.31 (d,J＝7.8Hz,H-1′),3.84(m,Ha-6′),3.65(dd,J＝11.8,5.0Hz,Hb-6′),3.18(m,H-3), 2.20(dd,J＝13.7,5.8Hz,Ha-22),1.79(s,CH3-26),1.77(s,CH3-27),1.04(s, CH3-28),0.99(s,CH3-18),0.92(s,CH3-30),0.89(s,CH3-19),0.84(s,CH3-29),0.79 (d,J＝11.3Hz,H-5)；碳谱数据见表1。
化合物3
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.21(d,J＝8.8Hz,H-24),5.36(m,H-23),4.24 (d,J＝6.7Hz,H-1′),3.18(dd,J＝11.8,4.1Hz,H-3),2.18(dd,J＝13.8,5.6Hz, Ha-22),1.80(s,CH3-26),1.77(s,CH3-27),1.11(s,CH3-28),0.88(s,CH3-18),0.97(s, CH3-30),10.2(s,CH3-19),0.80(s,CH3-29),1.27(d,J＝11.3Hz,H-5)；碳谱数据见表1。
化合物4
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.31(d,J＝9.2Hz,H-24),5.21(m,H-23),4.41 (d,J＝7.3Hz,H-1′),3.85(brd,J＝11.7Hz,Ha-6′),3.66(dd,J＝11.7,5.1Hz,Hb-6′), 5.37(brs,H-1"),3.14(m,H-3),2.51(dd,J＝13.4,6.6Hz,Ha-22),1.77(s,CH3-26), 1.76(s,CH3-27),1.21(d,J＝6.2Hz,H-6"),1.03(s,CH3-28),1.02(s,CH3-18),0.93 (s,CH3-30),0.89(s,CH3-19),0.85(s,CH3-29),0.79(d,J＝10.9Hz,H-5)；碳谱数据见表1。
化合物5
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.22(d,J＝8.8Hz,H-24),5.37(m,H-23),4.41 (d,J＝7.3Hz,H-1′),3.85(brd,J＝11.7Hz,Ha-6′),3.66(dd,J＝11.7,5.1Hz,Hb-6′), 5.37(brs,H-1"),3.14(m,H-3),2.18(dd,J＝13.4,7.1Hz,Ha-22),1.80(s,CH3-26), 1.78(s,CH3-27),1.21(d,J＝6.2Hz,H-6"),1.03(s,CH3-28),1.00(s,CH3-18),0.94 (s,CH3-30),0.89(s,CH3-19),0.85(s,CH3-29),0.79(d,J＝10.8Hz,H-5)；碳谱数据见表1。
化合物6
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.31(d,J＝8.8Hz,H-24),5.20(m,H-23),4.36 (d,J＝7.9Hz,H-1′),4.35(m,Ha-6′),4.23(dd,J＝11.7,6.3Hz,Hb-6′),4.50(d,J＝ 7.5Hz,H-1"),3.90(dd,J＝11.3,5.3Hz,H-5"),3.14(dd,J＝11.3,4.5Hz,H-3),2.52 (dd,J＝13.4,7.1Hz,Ha-22),2.05(s,CH3-OAc),1.78(s,CH3-26),1.76(s,CH3-27), 1.04(s,CH3-28),1.03(s,CH3-18),0.93(s,CH3-30),0.90(s,CH3-19),0.83(s, CH3-29),0.79(d,J＝11.4Hz,H-5)；碳谱数据见表1。
化合物7
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.42(d,J＝8.8Hz,H-24),4.79(m,H-23),4.50 (d,J＝5.2Hz,H-1′),5.18(brs,H-1"),4.46(d,J＝6.8Hz,H-1″′),3.14(dd,J＝11.2, 4.4Hz,H-3),2.19(dd,J＝13.0,9.4Hz,Ha-22),1.72(s,CH3-26),1.67(s,CH3-27), 1.22(d,J＝6.2Hz,H-2"),1.01(s,CH3-28),1.00(s,CH3-18),0.93(t,J＝7.4Hz, H-4″″),0.89(s,CH3-30),0.89(s,CH3-19),0.85(s,CH3-29),0.78(d,J＝10.8Hz, H-5)；碳谱数据见表1。
化合物8
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.26(d,J＝8.9Hz,H-24),4.65(m,H-23),4.45 (d,J＝7.5Hz,H-1′),4.37(m,Ha-6′),4.23(dd,J＝11.7,6.5Hz,Hb-6′),5.40(brs, H-1"),4.45(d,J＝7.5Hz,H-1″′),3.14(dd,J＝11.6,4.0Hz,H-3),2.16(dd,J＝12.5, 7.1Hz,Ha-22),1.69(s,CH3-26),1.66(s,CH3-27),1.21(d,J＝6.1Hz,H-2"),1.02(s, CH3-28),0.99(s,CH3-18),0.94(t,J＝7.4Hz,H-4″″),0.90(s,CH3-30),0.88(s, CH3-19),0.84(s,CH3-29),0.77(d,J＝10.8Hz,H-5)；碳谱数据见表1。
化合物9
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.42(brs,H-1″),5.31(d,J＝8.9Hz,H-24),5.21 (m,H-23),4.46(d,J＝7.4,H-1′),4.45(d,J＝7.4Hz,H-1″′),3.70(dd,J＝9.5,3.0Hz, Hb-6′),3.20(dd,J＝11.5,3.9Hz,H-3),2.52(dd,J＝13.3,7.0Hz,Ha-22),1.78(s, H3-26),1.76(s,H3-27),1.21(d,J＝6.2Hz,H3-6″),1.03(s,H3-28),1.02(s,H3-18), 0.93(s,H3-30),0.89(s,H3-19),0.86(s,H3-29),0.79(d,J＝9.6Hz,H-5)；碳谱数据见表2。
化合物10
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.42(brs,H-1″),5.37(m,H-23),5.20(m,H-24),4.46(d,J＝7.5Hz,H-1′),4.46(d,J＝7.5Hz,H-1″′),3.70(dd,J＝9.5,3.3Hz,Hb-6′),3.20(dd,J＝11.5,3.9Hz,H-3),2.21(dd,J＝13.3,5.6Hz,Ha-22),1.80(s,H3-26),1.78(s,H3-27),1.21(d,J＝6.1Hz,H3-6″),1.03(s,H3-28),1.00(s,H3-18),0.94(s,H3-30),0.89(s,H3-19),0.86(s,H3-29),0.79(d,J＝10.3Hz,H-5)；碳谱数据见表2。
化合物11
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.41(brs,H-1″),5.31(d,J＝8.8Hz,H-24),5.21 (m,H-23),4.46(d,J＝7.5Hz,H-1′),4.45(d,J＝7.5Hz,H-1″′),4.38(dd,J＝12.0, 2.0Hz,Ha-6′),4.23(dd,J＝11.7,6.5Hz,H-6′),3.72(dd,J＝9.5,2.9Hz,Hb-6′),3.14 (dd,J＝11.4,4.1Hz,H-3),2.52(dd,J＝13.4,7.0Hz,Ha-22),2.06(s,H3-Ac),1.78(s, H3-26),1.76(s,H3-27),1.21(d,J＝6.1Hz,H3-6″),1.03(s,H3-28),1.03(s, H3-18),0.93(s,H3-30),0.89(s,H3-19),0.85(s,H3-29),0.78(d,J＝10.9Hz,H-5)；碳谱数据见表2。
化合物12
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.41(brs,H-1′),5.37(m,H-23),5.21(d,J＝8.8 Hz,H-24),4.46(d,J＝7.5Hz,H-1′),4.45(d,J＝7.5Hz,H-1″′),4.38(dd, J＝12.0,2.0Hz,H-6′),4.23(dd,J＝11.7,6.5Hz,H-6′),3.71(dd,J＝9.6,3.1Hz,Hb-6′), 3.14(dd,J＝11.4,4.0Hz,H-3),2.21(dd,J＝13.3,5.6Hz,Ha-22),2.06(s,H3-Ac), 1.80(s,H3-26),1.78(s,H3-27),1.21(d,J＝6.2Hz,H3-6″′),1.03(s,H3-28),1.00(s, H3-18),0.95(s,H3-30),0.89(s,H3-19),0.85(s,H3-29),0.78(d,J＝11.1Hz,H-5)；碳谱数据见表2。
化合物13
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.41(brs,H-1″),5.26(d,J＝8.7Hz,H-24),4.67 (s,H-21),4.45(d,J＝3.2Hz,H),4.44(d,J＝7.5Hz,H-1′),4.44(d,J＝7.4Hz, H-1″′),3.69(dd,J＝11.9,4.2Hz,Hb-6′),3.20(dd,J＝11.5,4.1Hz,H-3),2.16(dd,J ＝12.6,7.2Hz,Ha-22),1.70(s,H3-26),1.66(s,H3-27),1.20(d,J＝6.0Hz,H3-6″), 1.02(s,H3-28),0.99(s,H3-18),0.94(t,J＝7.4Hz,H3-4″″),0.90(s,H3-30),0.88(s, H3-19),0.85(s,H3-29),0.78(d,J＝10.6Hz,H-5)；碳谱数据见表2。
化合物14
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.41(d,J＝6.6Hz,H-1″),4.77(m,H-23),4.69 (s,H-21),4.44(d,J＝7.5Hz,H-1′),4.44(d,J＝7.4Hz,H-1″′),3.72(dd,J＝9.6, 3.3Hz,Hb-6′),3.19(dd,J＝11.5,4.1Hz,H-3),2.18(dd,J＝13.0,9.4Hz,Ha-22), 1.71(s,H3-26),1.66(s,H3-27),1.20(d,J＝6.1Hz,H3-6″),1.02(s,H3-28),0.99(s, H3-18),0.93(s,H3-4″″),0.88(s,H3-30),0.88(s,H3-19),0.85(s,H3-29),0.77(d,J＝ 11.6Hz,H-5)；碳谱数据见表2。
化合物15
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:5.26(d,J＝8.8Hz,H-24),5.18(brs,H-1″),4.67 (s,H-21),4.48(d,J＝5.3Hz,H-1′),4.46(d,J＝6.9Hz,H-1″′),3.70(dd,J＝9.6, 3.4Hz,Hb-6′),3.12(dd,J＝11.4,4.2Hz,H-3),2.16(dd,J＝12.6,7.2Hz,Ha-22), 1.70(s,H3-26),1.66(s,H3-27),1.21(d,J＝6.2Hz,H3-6″),1.00(s,H3-28),0.99(s, H3-18),0.94(t,J＝7.4Hz,H3-4″″),0.91(s,H3-30),0.88(s,H3-19),0.84(s,H3-29), 0.77(d,J＝11.0Hz,H-5)；碳谱数据见表2。
化合物16
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:10.18(s,H-19),5.26(d,J＝8.7Hz,H-24),5.19(brs,H-1″),4.65(s,H-21),4.45(t,J＝5.3Hz,H-1′),3.70(dd,J＝9.6,3.3Hz,Hb-6′),3.18(dd,J＝11.9,4.1Hz,H-3),2.49(d,J＝12.9Hz,Ha-1),2.15(dd,J＝12.6,7.2Hz, Ha-22),1.71(s,H3-26),1.67(s,H3-27),1.21(d,J＝6.2Hz,H3-6″),1.08(s,H3-28), 0.95(t,J＝7.4Hz,H3-4″″),0.94(m,H3-18),0.88(s,H3-30),0.80(s,H3-29)；碳谱数据见表2。
化合物17
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:10.18(s,H-19),5.41(d,J＝8.6Hz,H-24),5.19(brs,H-1″),4.67(s,H-21),4.46(d,J＝3.5Hz,H-1′),3.70(dd,J＝9.3,2.4Hz,Hb-6′),3.19(dd,J＝11.5,3.9Hz,H-3),2.51(d,J＝12.4Hz,Ha-1),2.18(dd,J＝12.7,9,6Hz, Ha-22),1.72(s,H3-26),1.66(s,H3-27),1.21(d,J＝6.0Hz,H3-6″),1.08(s, H3-28),0.94(t,J＝7.4Hz,H3-4″″),0.91(s,H3-18),0.88(s,H3-30)0.80(s,H3-29)；碳谱数据见表2。
化合物18
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δH:10.18(s,H-19),5.41(d,J＝8.8Hz,H-24),5.20(brs,H-1″),5.05(s,H-21),4.45(d,J＝6.0Hz,H-1′),3.70(dd,J＝9.5,2.9Hz,Hb-6′),3.18(dd,J＝13.1,4.9Hz,H-3),2.50(d,J＝12.6Hz,Ha-1),2.22(dd,J＝13.0,9.6Hz, Ha-22),1.71(s,H3-26),1.67(s,H3-27),1.21(d,J＝6.1Hz,H3-6″),1.09(s,H3-28), 0.93(s,H3-18),0.89(s,H3-30),0.80(s,H3-29)；碳谱数据见表2。
表1.化合物1-8的13C NMR数据(100MHz，MeOH-d4)
13C-NMR:化合物6:OAc:172.8,20.9；化合物7:OAc:172.87,20.6。表2.化合物9-18的13C NMR数据(100MHz，MeOH-d4)
实施例6：
达玛烷型三萜皂苷1-18对果蝇阿兹海默症果蝇模型的学习记忆 能力具有显著的挽救效果，图1为化合物1-18对果蝇阿兹海默症果 蝇模型的学习记忆能力的挽救效果图；
6.1AD果蝇模型建立：
本实验中使用的所有果蝇均经过至少5代的回交，使之均处于 w1118(isoCJ1)的遗传背景下，以避免不同遗传背景对结果的影响，因此，w1118(isoCJ1)(简称“2U”)品系果蝇作实验的对照组背景果蝇。致病性可调控人源Aβ42蛋白(UAS-Aβ42被称为H29.3)通过和启动 Aβ42基因表达的果蝇Gal4line elav-GAL4c155(P35)杂交后，其子代会在神经系统中表达Aβ42蛋白。将P35与遗传背景果蝇2U杂交，其子代果蝇则不会表达Aβ42蛋白在分析前1小时，苍蝇被移到黑暗的房间里，以便苍蝇能够熟悉环境；
6.2样品测试溶液配制
称取适量待测样品，使用DMSO配制成10mM母液。之后，吸取部分10mM母液，用DMSO稀释成1mM的母液，再用4％蔗糖水稀释成10μM工作液(DMSO终浓度为1％)。所有化合物的工作液均为透明澄清溶液。工作液存放于-20℃冰箱中，备用。
6.3阳性药物对照组溶液配制
对照化合物美金刚(Memantine，MEM)母液(10mM)存储于 -20℃冰箱中。喂药开始前一天，MEM会以4％蔗糖工作液稀释至10 μM或100μM，存放于-20℃冰箱中，备用。
6.4分组
①遗传背景对照组：2U×H29.3；
②Aβ42疾病对照组：P35×H29.3；
③阳性药物对照组：MEM 10μM或100μM，PC；
④样品组：
6.5果蝇饲养
所有果蝇在24℃和50％相对湿度(RH)，每天12小时光照的标准环境中饲养。子代果蝇羽化后的第二日起，选择新孵出的2U× H29.3雄果蝇和P35×H29.3果蝇(AD果蝇)并放入小瓶，每小瓶含有大约120只果蝇，在喂药过程中将这些果蝇放置在29℃和40±15％ RH条件下，将果蝇从第2天至第8天喂药4小时后转移到新的小瓶中，将所有果蝇放置在29℃和40±15％RH条件下直到巴甫洛夫嗅觉学习测定前1小时；
6.6巴甫洛夫式嗅觉记忆
学习记忆测试是在25℃和70％相对湿度的恒温恒湿避光的行为房中进行，在训练期间，将约100只果蝇装入一个内铺有铜网的训练管，先后通入两种气味[3-辛醇(3-OCT)或4-甲基环己醇(4-MCH)] 的气体，每种气味持续60秒，中间间隔45秒的新鲜空气。当且仅当果蝇闻到第一种气味(CS+)时，果蝇受到60V的脉冲电击刺激，脉冲时长1.5s，间隔3.5s；果蝇闻到第二种气味(CS-)时不给于电击，如此完成一个训练周期。测试阶段，将果蝇在完成一个训练周期后立即转移到T-Maze的选择点，然后在2分钟内，同时从相对的两个方向分别通入两种气味，之后，分别统计处于不同容器的果蝇，并计算行为指数PI。得到的两个PI(行为指数)的平均值作为一次实验的 PI使用，PI＝0表示果蝇对于两种气味的选择为1:1，表明果蝇无法记忆点击与气味的联系；PI＝100表明全部果蝇均会记住气味和点击的联系，会依照气味避免遭受点击。行为指数的计算公式为：PI＝[(CS-) －(CS+)]/[(CS-)+(CS+)]×100。
6.7结果：
使用美金刚作为阳性对照的转基因果蝇AD模型评估1-19的短 期记忆增强活性。图1显示了这些化合物表现出不同程度的抗AD活 性，并且一些化合物表现出接近于美金刚的短期记忆增强能力。
实施例7：
达玛烷型三萜皂苷组分(高剂量组GQ-C1，低剂量组GQ-C2) 改善转基因果蝇阿尔茨海默病模型学习记忆的作用。
7.1对果蝇进行分组，分为以下四组：
①遗传背景对照组：(2U×H29.3)；
②Aβ42疾病对照组：(P35×H29.3)；
③阳性药物对照组：(美金刚100μM，PC)；
④样品组：(达玛烷型三萜皂苷组分高剂量组GQ-C1，达玛烷型三萜皂苷低剂量组GQ-C2)。
7.2实验操作与实施例2中实验操作相同。
7.3结果：
使用美金刚作为阳性对照的转基因果蝇AD模型评估GQ-C1和 GQ-C2的短期记忆增强活性。达玛烷型三萜皂苷组分高剂量组GQ-C1，达玛烷型三萜皂苷低剂量组GQ-C2表现出与实施例2中单体化合物类似的抗AD活性。

Claims (10)

1.一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷，其特征在于所述达玛烷型三萜皂苷的结构通式同下：
其中R1选自以下基团：
-CH3、-CHO；
其中R2选自以下基团：
-H、-OH；
其中R3选自以下基团：
-H、-OH；
基团R4选自以下基团：
-OH、-O(CH2)nCH3(n＝1，2，......30)；
其中基团R5选自以下基团：
化合物20位、21位和23位的绝对构型各自独立的为：(20R,21R,23R)、(20R,21R,23S)、(20R,21S,23R)、(20R,21S,23S)、(20S,21R,23R)、(20S,21R,23S)、(20S,21S,23R)、(20S,21S,23S)。
2.根据权利要求1所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
2.1将绞股蓝全草粉碎，粉碎至长度小于1厘米，再用体积百分数为30％～90％的乙醇、体积百分数为30％～100％的甲醇、乙酸乙酯或丙酮其中的一种为提取溶剂，通过提取方法为室温冷浸提取、加热回流提取或室温渗漉提取中的一种方法对粉碎后的绞股蓝全草进行提取得到提取液，再减压至-0.05～-0.09MPa浓缩所得的提取液，浓缩至浸膏为粘稠溶液，得总浸膏A；
2.2将总浸膏A进行D101大孔吸附树脂柱层析，分别用水、甲醇、甲醇的水溶液等份收集洗脱液，将所得洗脱液浓缩至稠膏，分别得到洗脱液为水的浸膏B、洗脱液体积比为30％甲醇的浸膏C、洗脱液体积比为50％甲醇的浸膏D、洗脱液体积比为70％甲醇的浸膏E、洗脱液体积比为90％甲醇的浸膏F、洗脱液为甲醇的浸膏G；
2.3分别对浸膏B、浸膏C、浸膏D、浸膏E、浸膏F、浸膏G进行硅胶柱层析、ODS反相柱层析、薄板制备层析、MCI柱层析、制备HPLC或Sephedex LH-20柱层析中的一种层析方法，用体积比为0:100～100:0的甲醇/水、体积比为0:100～100:0的氯仿/甲醇、体积比为0:100～100:0的氯仿/丙酮、体积比为0:100～100:0的石油醚/丙酮、或体积比为0:100～100:0的石油醚/乙酸乙酯中的一种洗脱剂洗脱，得到不同的浸膏组分；
2.4对实验步骤2.3所得到的浸膏组分进行硅胶柱层析、薄板制备层析、制备型高效液相色谱仪进行分离纯化，得到多种活性化合物，通过核磁共振谱，确定各活性化合物的结构。
3.如权利要求2所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤2.4硅胶柱层析所用硅胶的目数为200-300目。
4.如权利要求2所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤2.4硅胶柱层析所用洗脱剂氯仿/甲醇体系中氯仿与甲醇的体积比为30:1～1:1。
5.如权利要求2所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤2.4制备型高效液相色谱仪所用流动相甲醇/水体系中甲醇与水的体积比为60:40～100:0。
6.如权利要求2所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于步骤2.5所述薄板制备层析所用硅胶型号为化学纯GF254。
7.根据权利要求1所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的应用，其特征在于：所述达玛烷型三萜皂苷具有对果蝇阿兹海默症果蝇模型的学习记忆能力挽救效果。
8.根据权利要求书1所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的应用，其特征在于：所述达玛烷型三萜皂苷及其达玛烷型三萜皂苷组分在治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
9.根据权利要求书1或8所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的应用，其特征在于：所述达玛烷型三萜皂苷组分为两种或两种以上达玛烷型三萜皂苷的组合。
10.根据权利要求9所述的一种绞股蓝中具有抗阿尔茨海默病的达玛烷型三萜皂苷的应用，其特征在于：所述达玛烷型三萜皂苷及达玛烷型三萜皂苷组分的应用包括以下操作步骤：
10.1 AD果蝇模型建立：
本实验中使用的所有果蝇均经过至少5代的回交，使之均处于w1118(isoCJ1)的遗传背景下，以避免不同遗传背景对结果的影响，因此，w1118(isoCJ1)简称为“2U”品系的果蝇作实验对照组背景果蝇，致病性可调控人源Aβ42蛋白通过和启动Aβ42基因表达的果蝇Gal4 lineelav-GAL4c155杂交后，其子代会在神经系统中表达Aβ42蛋白，将P35与遗传背景果蝇2U杂交，其子代果蝇则不会表达Aβ42蛋白在分析前1小时，苍蝇被移到黑暗的房间里，以便苍蝇能够熟悉环境，所述致病性可调控人源UAS-Aβ42被称为H29.3，所述果蝇Gal4 line elav-GAL4c155称为P35；
10.2样品测试溶液配制
称取适量待测样品，使用DMSO配制成10mM母液，之后，吸取部分10mM母液，用DMSO稀释成1mM的母液，再用4％蔗糖水稀释成10μM工作液，所述DMSO终浓度为1％，所有化合物的工作液均为透明澄清溶液，工作液存放于-20℃冰箱中，备用。
10.3阳性药物对照组溶液配制
对照化合物美金刚MEM的母液存储于-20℃冰箱中，喂药开始前一天，MEM会以4％蔗糖工作液稀释至10μM或100μM，存放于-20℃冰箱中，备用。
10.4分组
①遗传背景对照组：2U×H29.3；
②Aβ42疾病对照组：P35×H29.3；
③阳性药物对照组：MEM 10μM或100μM，PC；
④样品组：
10.5果蝇饲养
所有果蝇在24℃和40～60％相对湿度RH，每天12小时光照的标准环境中饲养，子代果蝇羽化后的第二日起，选择新孵出的2U×H29.3雄果蝇和P35×H29.3果蝇及AD果蝇并放入小瓶，每小瓶含有大约120只果蝇，在喂药过程中将这些果蝇放置在29℃和40±15％RH条件下，将果蝇从第2天至第8天喂药4小时后转移到新的小瓶中，将所有果蝇放置在29℃和40±15％RH条件下直到巴甫洛夫嗅觉学习测定前1小时；
10.6巴甫洛夫式嗅觉记忆
学习记忆测试是在25℃和70％相对湿度的恒温恒湿避光的行为房中进行，在训练期间，将约100只果蝇装入一个内铺有铜网的训练管，先后通入3-辛醇和4-甲基环己醇两种气味的气体，每种气味持续60秒，中间间隔45秒的新鲜空气，当且仅当果蝇闻到第一种气味CS+时，果蝇受到60V的脉冲电击刺激，脉冲时长1.5s，间隔3.5s；果蝇闻到第二种气味CS-时不给于电击，如此完成一个训练周期；测试阶段，将果蝇在完成一个训练周期后立即转移到T-Maze的选择点，然后在2分钟内，同时从相对的两个方向分别通入两种气味，之后，分别统计处于不同容器的果蝇，并计算行为指数PI，得到的两个PI的平均值作为一次实验的PI使用，PI＝0表示果蝇对于两种气味的选择为1:1，表明果蝇无法记忆点击与气味的联系；PI＝100表明全部果蝇均会记住气味和点击的联系，会依照气味避免遭受点击，行为指数的计算公式为：PI＝[(CS-)－(CS+)]/[(CS-)+(CS+)]×100。
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