CN108753825A - 携带her2/erbb突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents

携带her2/erbb突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明是一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，本发明的AAV/HER2是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入HER2抗原基因得到野生型重组腺相关病毒载体，再通过点突变得到具有HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体。本发明的重组腺相关病毒载体及其衍生产品可用来制备免疫药物，治疗表达HER2基因的癌症。

Description

携带HER2/ERBB突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构 建方法与应用
【技术领域】
本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗 HER2/ERBB阳性的肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
HER2分子是癌基因ERBB2的编码产物,其编码基因定位于人染色体17q21, 起始于35109922位点,终末于35138436位点,基因共28 515bp,转录出全长为4 624nt的mRNA,从5′端起长238nt的序列为5′端调控区,起始密码子位于第 289～291碱基处,编码区长为3768nt,加尾信号位点在4519～4 524nt区域内,4 539～4 624nt区域为polyA。编码蛋白长1255氨基酸,前653氨基酸为胞外区, 654～675氨基酸的区域为穿膜区,676～1 255氨基酸区域为胞内区,分子量约为185 ku,是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白,属于表皮生长因子受体家族的成员。
HER2与其他受体结合成异二聚体发挥信号转导功能,相比不含HER2的二聚体信号更强；另一方面,HER2的异二聚体大大减弱了EGFR与cab1的偶联, 减少了EGFR在细胞内吞过程中的降解,促进EGFR循环回到细胞膜,使EGFR 在细胞膜过度表达,加速了细胞的增殖,导致肿瘤形成和增长加快。
HER2通过多种细胞内分子参与信号转导,其主要下游物质包括丝裂原活化蛋白(MAP)激酶、PI3激酶、C-src、Shc及Grb2等；HER2介导的胞内信号途径主要包括促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase,PI-3K)及丝-苏氨酸激酶(AKT) 途径,HER2介导的另一信号途径为在细胞存活中发挥重要作用的PI-3K/AKT途径。HER2过表达可激活AKT及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB),持续活化的AKT和NF-κB能导致抗凋亡级联反应,使癌细胞产生对TNF-α的抗性,降低宿主对肿瘤的防御能力。有研究显示,在MCF-7人乳癌细胞内转染入HER2基因后,可以看到DNA合成增加50％～70％,细胞生长速度增长30％～50％,软琼脂中生长速度增长225％,裸鼠中致癌性和转移能力增加。
因此，HER2蛋白是癌症主动免疫治疗的理想靶点,理论上,HER2疫苗能特异性激发细胞和体液免疫反应,使其成为抗肿瘤治疗的理想靶位。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是：提出一种安全性高、携带人表皮生长因子2(HER2/ERBB)抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus， rAAV)载体及其构建方法与应用。
本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
本发明提供了一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为 HER2/ERBBY1191/1192G突变抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
本发明通过对该蛋白1191位和1192位用PCR法点突变，使得其在转染后能够大大降低磷酸化比例，从而降低致癌风险，但保留其免疫活性，实现预防和治疗癌症的作用。
已知的腺相关病毒载体具有巨噬细胞病毒(CMV)启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因插入后成功构建的质粒的启动子替换为p5启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的任意一种。
本发明还提供一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。
本发明所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将 AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因HER2/ ERBB与被切断的AAV载体DNA进行连接，定点突变，得到携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为p5 启动子或者下述启动子中的一种：β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。
本发明还提供了一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，包括HER2/ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的质粒载体、HER2/ERBBY1191/1192G重组腺相关病毒的病毒载体、被所述HER2/ ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述HER2/ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述 HER2/ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的病毒载体由所述HER2/ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。
本发明还提供了一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品的制备方法，HER2/ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如上述携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含 100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到HER2/ERBB重组腺相关病毒的质粒载体；BST2重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述HER2/ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到HER2/ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的病毒载体；HER2/ERBBY1191/1192G重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备：用所述HER2/ERBB Y1191/1192G重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染单核细胞、树突状细胞或T淋巴细胞得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系、T淋巴细胞系。
一种如上所述的携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的产品在制备抗HER2/ERBB突变抗原阳性的癌症药物中的应用。
药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将AAV/HER2/ERBB 的病毒载体感染或转染患者的单核细胞。或将转化有HER2/ERBB的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞回输肿瘤患者。
上述药物的用量一般为100μl/5×106个单核细胞/每次，每月2次，疗程通常为6个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。
为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行组合治疗。
本发明与现有技术对比的有益效果是：
本发明提供了一种稳定性高、携带人表皮生长因子(HER2/ERBB)突变抗原基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体。在本发明的重组腺相关病毒 (AAV/HER2/ERBB Y1191/1192G)载体可将其携带的HER2/ERBB突变抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，存在HER2/ERBB突变抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在体外和患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗HER2/ERBB突变抗发明的携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗HER2/ERBB突变抗原阳性的恶性肿瘤的细胞免疫治疗。本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
【附图说明】
图1：HER2/ERBB野生型和突变体HER2/ERBB Y1191/1192G质粒转染HEK293 细胞电泳测试结果
【具体实施方式】
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1构建重组腺相关病毒质粒
S1：改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；
S2：逆转录PCR后，用引物1：atgcccatctggaagtttccagatgaggag和引物2：gactctagatcacactggcacgtccagac扩增得到HER2/ERBB核心致癌cDNA；
S3：将步骤S2中HER2cDNA进行酶切反应，之后和步骤S1产物pAAV- GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和HER2基因的重组腺相关病毒载体；
S4：使用引物3：cagcccagccttcgacaacctcggtggctgggaccaggacccaccag进行点突变 PCR，将HER2/ERBB基因突变为HER2Y1191/1192G突变抗原基因；
将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子。
实施例2细胞杀伤实验
AAV/HER2/ERBB Y1191/1192G系统可以在动物细胞培养基中被供体的树突细胞吞噬，进而经由免疫递呈活化供体的T细胞，并诱发对携带有HER2抗原的癌症细胞系SK-BR-3的免疫反应治疗有效性可通过对携带HER2的SK-BR-3细胞的体外杀伤实验证实。
具体地，包括以下步骤：
根据SK-BR-3/U266两种细胞系HLA抗原表型，筛选携带HLA-2基因的志愿者作为免疫细胞供体。
1)抽取供体50ml血液，分离其中的单核细胞与T细胞前体细胞；
2)细胞计数后，用单核细胞：AAV/HER2/ERBB Y1191/1192G＝1：1000的比例加入6孔板一孔中，并加入适当细胞因子的2ml 1640培养基培养7天，观察细胞状态及时更换培养基。单核细胞经过刺激成为识别了HER2的成熟树突细胞。同时用AAV GFP诱导产生不识别HER2的树突细胞做对照；
3)T细胞前体细胞，加入适当细胞因子的2ml 1640培养基培养7天，观察细胞状态及时更换培养基；
4)按照1：1000的比例混合2)和3)的产物细胞。再用加入适当细胞因子的1640培养基培养7天，得到成熟的CD4+T细胞；
5)以40：1的比例用分别诱导的CD4+T细胞对携带HER2的SK-BR-3细胞进行杀伤实验；
6)细胞杀伤6小时后，加入MTS试剂检测细胞活性。
MTS试剂作用4小时后，将细胞培养板放入酶标仪，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。
细胞杀伤测试结果如表1，
表1 SK-BR-3细胞杀伤试验测试结果
空白组 SK-BR-3 AAV GFP AAV HER2 GFP+SK HER2+SK
149 2210 937 822 2766 1777
153 2069 865 825 2908 1848
143 2287 928 851 2764 1805
细胞杀伤率计算公式为
杀伤率＝1-(效应细胞HER2+靶细胞SK-BR-3-混合细胞HER2和SK-BR-3)/
(效应细胞HER2+靶细胞SK-BR-3)
经换算，HER2/ERBB的CTL杀伤实验结果见表2：
表2SK-BR-3细胞杀伤试验结果
空白组 AAV-GFP组 HER2/ERBB组
细胞杀伤率 —— 4.91％ 39.01％
根据表2所示，试验结果表明HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体通过树突细胞诱导的杀伤率为39.01％，远高于对照组GFP杀伤SK-BR-3的4.91％。
实施例3突变后致癌性风险测试
1)体外培养HEK293；
2)以1：100比例稀释三种腺相关病毒GFP，HER2 WT，HER2/ERBB Y1191/1192G(病毒滴度每毫升5×1010)加入上述细胞，培养3天；
3)收集细胞后，立即加入含磷酸酶抑制剂的裂解液，破碎细胞收集蛋白质；
4)使用锰离子磷酸化western(AAL-107FUJIFILM)测试HER2磷酸化能力的变化，结果如附图1所示。
根据试验结果，与HER2/ERBB野生型相比突变体HER2/ERBB Y1191/1192G 的磷酸化比例(phos.)明显减少。根据前人研究HER2的磷酸化是活化致癌能力的关键，因此突变体的致癌风险更低，可以用于腺相关病毒免疫治疗。如图所示产物失去与自我磷酸化的致癌能力，但保留了原来的免疫源性。最后将其嵌入腺相关病毒载体中包装成可诱导DC细胞免疫反应且不具有致癌性的 HER2/ERBB2疫苗。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京安斯晨睿生物科技有限公司
<120> 携带HER2/ERBB突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3678
<212> DNA
<213> HER2/ERBB突变抗原基因(Human epidermal growth factor receptor-2)
<400> 1
atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag acccacctgg acatgctccg ccacctctac 60
cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg gaactcacct acctgcccac caatgccagc 120
ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa 180
gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac 240
aactatgccc tggccgtgct agacaatgga gacccgctga acaataccac ccctgtcaca 300
ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa 360
ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag 420
gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg 480
gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag ggctcccgct gctggggaga gagttctgag 540
gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca 600
ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt gctgccggct gcacgggccc caagcactct 660
gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc 720
ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag tccatgccca atcccgaggg ccggtataca 780
ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc 840
tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg 900
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cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat atccaggagt ttgctggctg caagaagatc 1020
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tacatctcag catggccgga cagcctgcct gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta 1200
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caagctctgc tccacactgc caaccggcca gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc 1440
tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac 1500
tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc 1560
cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag 1620
aatggctcag tgacctgttt tggaccggag gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat 1680
aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac 1740
atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc 1800
acccactcct gtgtggacct ggatgacaag ggctgccccg ccgagcagag agccagccct 1860
ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc 1920
tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag aagatccgga agtacacgat gcggagactg 1980
ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg 2040
cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct 2100
tttggcacag tctacaaggg catctggatc cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg 2160
gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa 2220
gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca tatgtctccc gccttctggg catctgcctg 2280
acatccacgg tgcagctggt gacacagctt atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc 2340
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aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac 2460
gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa attacagact tcgggctggc tcggctgctg 2520
gacattgacg agacagagta ccatgcagat gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg 2580
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actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc aaaccttacg atgggatccc agcccgggag 2700
atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg ctgccccagc cccccatctg caccattgat 2760
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ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc ctccccacac atgaccccag ccctctacag 3240
cggtacagtg aggaccccac agtacccctg ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc 3300
ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg aaccagccag atgttcggcc ccagccccct 3360
tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc cgacctgctg gtgccactct ggaaaggccc 3420
aagactctct ccccagggaa gaatggggtc gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc 3480
gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct 3540
cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc tattactggg accaggaccc accagagcgg 3600
ggggctccac ccagcacctt caaagggaca cctacggcag agaacccaga gtacctgggt 3660
ctggacgtgc cagtgtga 3678

Claims (7)

1.一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，通过切除腺相关病毒基因中病毒包装识别位点内的全部基因，插入HER2/ERBB抗原基因，定点突变，替换CMV启动子，得到HER2/ERBB Y1191/1192G突变的重组腺相关病毒载体；其中，突变位点为1191和1192位，由酪氨酸突变为甘氨酸，所述病毒包装识别位点内的全部基因为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的启动子为p5启动子，beta启动子或SV40启动子。
2.一种含有权利要求1所述携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原的重组腺相关病毒载体的产品，包括重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体/颗粒感染或转染的细胞系。
3.制备权利要求1所述携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：
1)改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；
2)PCR法得到HER2/ERBB抗原的DNA；
3)将步骤2)中HER2/ERBB抗原的DNA进行错位PCR，之后和步骤1)产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和HER2/ERBB抗原基因的质粒；
4)利用点突变方法改变致癌相关的氨基酸；
5)将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子，得到携带β-肌动蛋白启动子、p5启动子或SV40早期启动子的重组腺相关病毒载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中包括以下步骤：
1)从表达HER2/ERBB的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；
2)以所述总cDNA为模板，在引物1：atgcccatctggaagtttccagatgaggag和引物2：gactctagatcacactggcacgtccagac的引导下进行PCR扩增，得到的HER2/ERBB抗原的DNA。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤4)的操作方法为：
使用引物3：cagcccagccttcgacaacctcggtggctgggaccaggacccaccag进行点突变PCR，将HER2基因突变为HER2 Y1191/1192G突变抗原基因。
6.一种含有携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，其特征在于：包括HER2/ERBB Y1191/1192G突变重组腺相关病毒的质粒载体，HER2/ERBBY1191/1192G突变重组腺相关病毒的病毒载体、被所述HER2/ERBB突变重组腺相关病毒的载体感染或转染的细胞系；所述HER2/ERBB突变重组腺相关病毒的的质粒载体由权利要求1所述的或者权利要求3～5任一项所述的构建方法制得的携带HER2/ERBB Y1191/1192G抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述HER2/ERBB Y1191/1192G突变重组腺相关病毒的病毒载体由所述HER2/ERBB Y1191/1192G突变重组腺相关病毒的质粒载体和重组腺相关病毒包装辅助质粒pAAV-RC2和pAAV-Helper进行细胞培养得到。
7.一种权利要求1所述的携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变重组腺相关病毒的病毒载体或者权利要求2所述相关的产品在制备治疗HER2/ERBB抗原阳性的癌症或癌前病变药物中的应用。
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