CN108753782A

CN108753782A - 表达抑制spa基因的发卡rna的dna分子及其应用

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Publication number: CN108753782A
Application number: CN201810607231.7A
Authority: CN
Inventors: 李保云; 郭丹丹; 张玉峰; 梁荣奇; 尤明山; 解超杰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2018-11-06

Abstract

本发明公开了表达抑制SPA基因的发卡RNA的DNA分子及其应用。本发明公开的表达抑制SPA基因的发卡RNA的DNA分子，为如式(I)所示的DNA片段：SEQ_正向‑X‑SEQ_反向(I)；SEQ_正向的序列为SPA基因的序列或其任意片段；SEQ_反向的序列与SEQ_正向的序列反向互补或有90％以上的核苷酸互补；X是SEQ_正向与SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，X与SEQ_正向与SEQ_反向均不互补。实验证明，本发明将表达抑制SPA基因的发卡RNA的DNA分子转化植物，得到了SPA基因表达被抑制的转基因植物，该转基因植物中种子品质发生了变化，可用于改变种子品质。

Description

表达抑制SPA基因的发卡RNA的DNA分子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，表达抑制SPA基因的发卡RNA的DNA分子及其应用。

背景技术

小麦是世界三大粮食作物之一，食物利用的主要形式是由水和储藏蛋白形成的具有独特弹性和延展性的面团。储藏蛋白由谷蛋白和醇溶蛋白构成，占面粉蛋白质的70-80％，是决定小麦品质优劣的主要因素。谷蛋白又可以分为高分子量谷蛋白亚基(highmolecular weight glutenin subunit,HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(low molecularweight glutenin subunit,LMW-GS)，两者能够依靠分子间二硫键形成一种独特的谷蛋白大聚体，HMW-GS呈链状组成聚合体骨架，LMW-GS呈簇状构成聚合体分枝。HMW-GS包括1Dy、1Dx、1By和1Bx亚基。醇溶蛋白则是一种单体蛋白，为面团提供延展性。蛋白质的组成及表达量对于改良小麦品质具有极为关键的作用。储藏蛋白的表达调控主要发生在转录水平，因此理解转录因子对蛋白的调控作用对于指导小麦品质遗传改良具有重要理论意义。SPA基因是一种属于opaque2亚家族的bZIP类转录因子。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控种子中储藏蛋白的含量。

本发明首先提供了如式(I)所示的DNA片段：

SEQ_正向-X-SEQ_反向 (I)

所述SEQ_正向的序列为SPA基因的序列或其任意片段；

所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补或有90％以上的核苷酸互补；

所述X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ_正向与所述SEQ_反向均不互补。

上述DNA片段中，所述SEQ_正向的序列可为如下a1)至a4)中的任一种：

a1)序列表中序列1的第791-1242位；

a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；

a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的序列；

a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的序列。

所述SEQ_反向的序列为如下b1)至b4)中的任一种：

b1)序列表中序列1的第2419-2870位；

b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；

b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的序列；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的序列。

所述X的序列可为含有FAD2基因的内含子的序列。

a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列为在序列1的第785-1242位的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的序列。b2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列为在序列1的第2419-2870位的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1的第791-1242位或第2419-2870位的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。

上述DNA片段中，所述FAD2基因的内含子的序列可为序列1的第1270-2400位。

所述X的序列具体可为序列表中序列1的第1243-2418位。

上述DNA片段的核苷酸序列可为序列表中序列1的第791-2870位。

本发明还提供了与所述DNA片段相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)含有所述DNA片段的表达盒；

B2)含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B5)含有B1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B2)所述重组载体的转基因植物组织；

B6)含有B1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B2)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，B1)所述表达盒中，驱动所述DNA片段转录的启动子可为胚乳特异性启动子。

所述表达盒中终止所述DNA片段转录的终止子可为NOS终止子。

所述胚乳特异性启动子具体可为Glu-1D启动子。所述Glu-1D启动子的序列具体可为序列表中序列1的第1-761位。其中序列1的第1-325位为增强子序列。

所述NOS终止子的序列具体可为序列表中序列1的第2893-3140位。

所述表达盒具体可为序列表中序列1所示的DNA片段。

本发明还提供了所述DNA片段编码得到的RNA分子。

本发明还提供了所述DNA片段，或所述生物材料，或所述RNA分子，或SPA基因或其任意片段在如下m1)-m16)中的任一种中的应用：

m1)抑制SPA基因表达；

m2)降低SPA基因编码蛋白质的活性；

m3)降低SPA基因编码蛋白质的水平；

m4)降低植物种子储藏蛋白含量；

m5)降低植物种子谷蛋白含量；

m6)降低植物种子高分子量谷蛋白亚基含量；

m7)降低植物种子高分子量谷蛋白亚基中1Dy亚基、1Dx亚基、1By亚基或1Bx亚基含量；

m8)降低植物低分子量谷蛋白亚基含量；

m9)降低植物种子高分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例；

m10)降低植物种子高分子量谷蛋白亚基中1Dx亚基或1Bx亚基在谷蛋白中的比例；

m11)提高植物种子低分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例；

m12)降低植物种子中高分子量谷蛋白亚基与低分子量谷蛋白亚基的比例；

m13)降低植物种子中谷蛋白与醇溶蛋白的比例；

m14)降低植物种子的SDS沉降值；

m15)培育转基因植物；

m16)调控植物种子品质。

进一步，在本发明的一个实施例中，m1)中所述抑制SPA基因表达具体为使SPA基因在RNA水平的表达量降低。

m15)所述转基因植物具有如下n1)-n15)中任一特性：

n1)SPA基因表达被抑制；

n2)SPA基因编码蛋白质的活性降低；

n3)SPA基因编码蛋白质的水平降低；

n4)种子储藏蛋白含量降低；

n5)种子谷蛋白含量降低；

n6)种子高分子量谷蛋白亚基含量降低；

n7)种子高分子量谷蛋白亚基中1Dy亚基、1Dx亚基、1By亚基或1Bx亚基含量降低；

n8)低分子量谷蛋白亚基含量降低；

n9)种子高分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例降低；

n10)种子高分子量谷蛋白亚基中1Dx亚基或1Bx亚基在谷蛋白中的比降低例；

n11)种子低分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例提高；

n12)种子中高分子量谷蛋白亚基与低分子量谷蛋白亚基的比例降低；

n13)种子中谷蛋白与醇溶蛋白的比例降低；

n14)种子的SDS沉降值降低；

n15)植物种子品质改变。

本发明还提供了下述X1)或X2)的方法：

X1)一种培育转基因植物的方法，所述方法包括：将所述的DNA片段导入目的植物中，得到与所述目的植物相比具有如下n1)-n15)中任一特性的转基因植物：

n1)SPA基因表达被抑制；

n2)SPA基因编码蛋白质的活性降低；

n3)SPA基因编码蛋白质的水平降低；

n4)种子储藏蛋白含量降低；

n5)种子谷蛋白含量降低；

n6)种子高分子量谷蛋白亚基含量降低；

n8)低分子量谷蛋白亚基含量降低；

n9)种子高分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例降低；

n11)种子低分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例提高；

n13)种子中谷蛋白与醇溶蛋白的比例降低；

n14)种子的SDS沉降值降低；

n15)植物种子品质改变；

X2)一种培育转基因植物的方法，包括：通过抑制目的植物中SPA基因的表达或降低SPA基因编码蛋白质的含量或活性，得到与所述目的植物相比具有上述n4)-n15)中任一特性的转基因植物。

本发明中，所述植物可为下述c1)、c2)、c3)或c4)：

c1)单子叶植物；

c2)双子叶植物；

c3)禾本科植物；

c4)小麦，如春麦品种Fielder。

本发明将含有SPA基因片段发卡结构转化植物，得到了SPA基因表达被抑制的转基因植物，该转基因植物中种子储藏蛋白含量、谷蛋白含量、高分子量谷蛋白亚基含量、高分子量谷蛋白亚基中1Dy亚基、1Dx亚基、1By亚基或1Bx亚基含量、低分子量谷蛋白亚基含量、高分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例、高分子量谷蛋白亚基中1Dx亚基或1Bx亚基在谷蛋白中的比降、低分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例、高分子量谷蛋白亚基与低分子量谷蛋白亚基的比例、谷蛋白与醇溶蛋白的比例均降低，并改变了其SDS沉降值，使植物种子的品质发生了变化。

附图说明

图1为各载体示意图。

图2为SDS沉降值的检测结果。A和B中ck均为Fielder，A和B中34分别为编号为34的单株的T₁代与T₂代株系。**表示p<0.01。

图3为种子中SPA基因的表达量的检测结果。RQ表示相对表达量，ck为Fielder，10DPA、14DPA、18DPA、22DPA分别为花后10、14、18、22天。

图4为种子中醇溶蛋白RP-UPLC分离图谱。上图为醇溶蛋白6.5-14.5min峰图，下图为醇溶蛋白14.5-26min峰图。

图5为种子中谷蛋白RP-UPLC分离图谱。上图为谷蛋白15-27min峰图，下图为谷蛋白27-39min峰图。

图6为ω-、α/β-、γ-醇溶蛋白以及11min48s ω-醇溶蛋白的含量。左图为ω-、α/β-、γ-醇溶蛋白的含量；右图为11min48s ω-醇溶蛋白的含量；gli表示醇溶蛋白。ck表示春麦品种Fielder，34表示转基因株系。

图7为HMW-GS与LMW-GS的含量。左图为HMW-GS含量；右图为LMW-GS含量。ck表示春麦品种Fielder，34表示转基因株系。

图8为HMW-GS及其各组分和LMW-GS占谷蛋白总量的比值。左图为HMW-GS、LMW-GS占谷蛋白总量的比值；右图为HMW-GS各亚基占谷蛋白总量的比值；glu表示谷蛋白。ck表示春麦品种Fielder，34表示转基因株系。

图9为不同蛋白含量的比值。左图为HMW-GS与LMW-GS含量的比值；右图为谷蛋白含量与醇溶蛋白含量的比值；gli表示醇溶蛋白，glu表示谷蛋白。ck表示春麦品种Fielder，34表示转基因株系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的植物表达载体CUB载体(谢树章等，农杆菌介导抗虫基因GmCry1F转化玉米的研究，西南农业学报，2018年28卷3期)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

干扰载体pBAC47p-SPAII记载在“王黎黎.小麦SPA转录因子超表达与RNAi转基因研究[D].北京.中国农业大学，2014”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的春麦品种Fielder(胡冬梅等，加拿大优质春小麦品种的适应性筛选与分析评价，种子，2003年第5期(总第131期))公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、SPA基因可以调控小麦储藏蛋白的含量

一、重组载体与重组菌的构建

将干扰载体pBAC47p-SPAII(图1中A)利用BamHI和HindIII进行双酶切，回收大小约780bp的DNA片段(将该DNA片段记为DNA片段1)；将植物表达载体CUB(图1中B)利用BamHI和HindIII进行双酶切，回收大小约8.8kb的DNA片段(将该DNA片段记为DNA片段2)；连接DNA片段1和DNA片段2得到重组载体，将该重组载体命名为CUB-Glu1D-bar，其结构示意图如图1中C所示。

用SacI和BamHI双酶切上述CUB-Glu1D-bar，回收大小约9.6kb的DNA片段，将该DNA片段记为DNA片段3；用SacI和BamHI双酶切干扰载体pBAC47p-SPAII，回收大小约2.1kb的DNA片段，将该DNA片段记为DNA片段4；连接DNA片段3和DNA片段4得到重组载体，将该重组载体命名为CUB-SPAII-bar，其结构示意图如图1中D所示。图1中，CUB-SPAII-bar中的自Glu-1D Promoter至NOS的序列为SPAI-intron-SPAII的表达盒，其序列表中序列1。SPAI-intron-SPAII的序列为序列表中序列1的第791-2870位，SPAI和SPAII分别为SPA基因的部分正向片段(其序列为序列表中序列1的第791-1242位)和反向片段(其序列为序列表中序列1的第2419-2870位)，intron为拟南芥FAD2基因的内含子片段(其序列为序列表中序列1的第1270-2400位)；NOS为终止子片段(其序列为序列表中序列1的第2893-3140位)。SPAI-intron-SPAII的表达由Glu-1D启动子(Glu-1D Promoter，其序列为序列表中序列1的第1-761位)驱动，序列1的第1-325位为增强子序列。

将CUB-SPAII-bar导入宿主农杆菌C58C1中，得到重组菌，将该重组菌命名为C58C1-CUB-SPAII-bar；将CUB-Glu1D-bar导入宿主农杆菌C58C1中，得到对照菌。

二、转基因小麦的获得及表型检测

1、配置下列培养基：

愈伤组织诱导培养基MSD2：为向不含维生素的MS培养基中添加蔗糖、Dicamba和植物凝胶后得到的无菌培养基，蔗糖、Dicamba和植物凝胶在愈伤组织诱导培养基MSD2中的浓度分别30g/L蔗糖，2mg/L Dicamba，2.4g/L植物凝胶，pH为5.8。

1/10WCC滤液的制备方法为：20mL MS维生素(100×)，1.0g谷氨酰胺，0.2g维生素C，0.2g水解酪蛋白，4.4mg Pircoloram，78mg AS，加水定容至50mL，过滤灭菌。其中，MS维生素(100×)的组分及浓度为10g/50mL肌醇，0.05g/50mL盐酸，0.05g/50mL盐酸吡哆醇(VB6)，0.01g/50mL盐酸硫胺素(VB1)。

1/10WCC重悬液的制备方法为：将不含维生素的MS培养基稀释10倍后添加麦芽糖、MgCl₂、Dicamba和MES，麦芽糖、MgCl₂、Dicamba和MES的添加量分别为40g/L麦芽糖，0.75g/LMgCl₂，2mg/L Dicamba，1.95g/L MES，调pH为5.4后121℃高压灭菌15min，然后加入50mL/L1/10WCC滤液。

恢复培养基：向MS培养基中添加蔗糖、Dicamba和植物凝胶，蔗糖、Dicamba和植物凝胶的添加量分别为30g/L蔗糖，2mg/L Dicamba，2.4g/L植物凝胶，调pH为5.8后121℃高压灭菌15min，然后加入300mg/L羧苄青霉素。

筛选培养基：向MS培养基中添加蔗糖、Dicamba和植物凝胶，蔗糖、Dicamba和植物凝胶的添加量分别为30g/L蔗糖，2mg/L Dicamba，2.4g/L植物凝胶，调pH为5.8后121℃高压灭菌15min，然后加入300mg/L羧苄青霉素和25mg/L G418。

分化培养基：向MS培养基中添加蔗糖和植物凝胶，蔗糖和植物凝胶的添加量分别为20g/L蔗糖，2.4g/L植物凝胶，调pH为5.8后121℃高压灭菌15min，然后加入300mg/L羧苄青霉素和25mg/L G418。

壮苗培养基：将不含维生素的MS培养基稀释2倍后添加VB1、VB6、甘氨酸、烟酸和肌醇，VB1、VB6、甘氨酸、烟酸和肌醇的添加量分别为0.5mg/L VB1，0.25mg/L VB6，1mg/L甘氨酸，0.25mg/L烟酸，50mg/L肌醇，调pH为5.8后121℃高压灭菌15min，然后再加入300mg/L羧苄青霉素。

2、转基因小麦的制备

将C58C1-CUB-SPAII-bar涂布在含卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃培养2d。挑取少量菌体加入5mL含卡那霉素的YEP液体培养基上，28℃过夜培养，再扩大培养至50mL，摇菌至菌液OD₆₀₀＝0.5，3500rpm离心10min，收集农杆菌菌体，用1/10WCC重悬液将菌体重悬浮，得到菌体悬液，用于侵染。

取春麦品种Fielder花后14天的未成熟籽粒，用70％乙醇水溶液消毒1min，再用15％NaClO灭菌15min，而后无菌蒸馏水漂洗3次，得到灭菌籽粒。在无菌培养皿中剥离灭菌籽粒的幼胚作为外植体材料，将幼胚盾片朝上接种在愈伤组织诱导培养基MSD2上，25℃暗培养4天，得到预处理愈伤组织。取生长状况良好的预处理愈伤组织于50mL离心管中，加入5mL菌体悬液侵染30min。侵染结束后将愈伤组织转移至无菌滤纸上，25℃暗培养3天，得到经农杆菌侵染的愈伤组织。

将经农杆菌侵染的愈伤组织转移至恢复培养基上，25℃恢复培养4天；恢复培养结束后再将愈伤组织转移至筛选培养基上，25℃黑暗下筛选培养21天；筛选培养结束后将愈伤组织转移至分化培养基上进行绿芽分化，培养条件为25℃光照培养2-3周，光密度为45μM/m²·s，时间为16h光照和8h黑暗，得到分化出的绿芽；将分化出的绿芽转移至壮苗培养基上，继续培养3-4周，得到转基因幼苗；转基因幼苗生长健壮后移栽到花盆中继续生长，得到T₀代转基因小麦。

按照上述方法，将C58C1-CUB-SPAII-bar替换为CUB-Glu1D-bar，制备转空载体对照植株。

3、转基因小麦的筛选

取T₀代转基因小麦叶片，利用CTAB法提取基因组DNA。

根据干扰载体序列设计了3对引物进行阳性检测。ips上游引物位于Glu-1Dpromoter上，下游引物位于SPA正向片段SPAI上，PCR产物长360bp；ipi上游引物位于Glu-1Dpromoter上，下游引物位于FAD2基因的内含子intron上，PCR产物长725bp；iin上游引物位于intron上，下游引物位于终止子NOS上，PCR产物长953bp。引物序列如下：

ips-F(ips上游引物)：5’-TTATCATCACCCACAACACC-3’；

ips-R(ips下游引物)：5’-TTTCTACTCCTTGAGCGTCT-3’；

ipi-F(ipi上游引物)：5’-CCACAACACCGAGCACCACA-3’；

ipi-R(ipi下游引物)：5’-ATCCCTTTCACAACCTGATTTCC-3’；

iin-F(iin上游引物)：5’-AAATTGGTCAAAGCAAATCA-3’；

iin-R(iin下游引物)：5’-AACCCATCTCATAAATAACG-3’。

利用上述3对引物从T₀代转基因小麦筛选得到46个阳性转基因单株(即RNAi单株)。

4、阳性转基因单株的SDS沉降值检测

在46个阳性转基因单株中选取编号为34的单株测定其T₁代、T₂代种子的SDS沉降值，利用春麦品种Fielder以及空载体对照植株作为对照，方法如下：取各单株的成熟种子，磨粉，得到面粉；称量2.0g面粉加入35mL具塞量筒中，再加入16.7mL溴酚蓝(添加量为0.01g/L)溶液混匀，放在沉降值测定仪中摇匀5min；取下量筒，然后再向量筒中加入16.7mL乳酸-SDS溶液(该溶液的制备方法为：将100mL 85％(v/v)乳酸水溶液加800mL水回流6h以上得到乳酸溶液，将乳酸溶液与2g/100mL SDS水溶液按1：50的体积比进行混合得到乳酸-SDS溶液)，混匀后继续放在沉降值测定仪上摇匀5min；取下量筒，置于水平桌面上静置5min后读取量筒内沉淀体积。

经SDS沉降值检测发现，编号为34的单株的T₁代与T₂代的SDS沉降值与Fielder相比均极显著降低(图2)，Fielder与空载体对照植株SDS沉降值无显著差异。

5、阳性转基因单株的SPA基因表达量检测

取春麦品种Fielder、空载体对照植株和编号为34的单株的T₂代的花后10、14、18、22天种子，于-80℃冰箱保存。用天根植物总RNA提取试剂盒提取种子RNA，用TakaraPrimeScript^TM RT Reagent kit with gDNA Eraser进行gDNA的去除和cDNA的合成，反转录的cDNA置于-20℃冰箱备用。

利用检测SPA基因表达量的由qSPA-F(5’-TGCGACTCTTAATAGTGAGACC-3’)和qSPA-R(5’-TATGGAAGGGGAGGCACAAACA-3’)组成的引物对进行实时荧光定量PCR检测种子中SPA基因(该基因GeneBank登录号为Y09013)的表达量。以GAPDH(qGAPDH-F：5’-TTCAACATCATTCCAAGCAGC-3’，qGAPDH-R：5’-CGTAACCCAAAATGCCCTTG-3’)基因为内参基因(该基因引物引自“Nucleotide Polymorphism in the Wheat TranscriptionalActivator Spa Influences Its Pattern of Expression and Has PleiotropicEffects on Grain Protein Composition,Dough Viscoelasticity,and GrainHardness”)。

从图3可以看出，花后10天转基因株系34表达量略高于春麦品种Fielder。但春麦品种Fielder表达量从花后10天至花后14天缓慢提高，从花后14天开始迅速上升，至花后18天达到高峰，之后开始迅速降低。空载体对照植株SPA基因与春麦品种Fielder的表达模式基本相同，每个时期均无显著差异。而转基因株系在这4个时期表达量基本不变，维持在较低水平，表明转基因小麦的SPA基因表达量被显著抑制。

6、储藏蛋白含量的检测

取编号为34的转基因植株的T₂代株系成熟种子，磨粉，得到面粉；称取80mg面粉，置于1.5mL离心管中；向离心管中加入1mL 50％(v/v)正丙醇水溶液涡旋震荡5min，65℃水浴提取10min，12000rpm离心5min，收集上清液和沉淀；上清液即为醇溶蛋白溶液，用0.45μM有机系滤膜将醇溶蛋白溶液过滤于2mL标准进样小瓶中，得到的滤液即可放入超高效液相色谱仪样品管理器中；

向收集到的沉淀中继续加入1mL 50％(v/v)正丙醇水溶液，12000rpm离心5min，弃去上清液，重复4次，收集沉淀；将得到的沉淀于45℃下烘干30min，然后向沉淀中加入250μL提取液1(提取液1的制备方法为：将异丙醇、1M Tris-HCl(pH6.8)和水混合，三者所用的体积比为5：2：3，得到混合液，向混合液中加入DTT即得到提取液1，提取液1中DTT的浓度为1mg/100mL)充分混匀后于65℃水浴30min，然后加入250μL提取液2(提取液2的制备方法为：将异丙醇、1M Tris-HCl(pH6.8)和水混合，三者所用的体积比为5：2：3，得到混合液，向混合液中加入4-VP即得到提取液2，提取液2中4-VP的浓度为1.4％(体积比))充分混匀后继续水浴30min，然后12000rpm离心10min；取上清液加入是上清液1.5倍体积的预冷丙酮，-20℃过夜沉淀；过夜后于12000rpm离心10min，弃去上清液，向沉淀中加入1mL无水乙醇洗涤，12000rpm离心10min，弃去上清，即得到谷蛋白。室温干燥谷蛋白沉淀，干粉保存于-20℃备用。向谷蛋白沉淀中加入100μL溶解液(该溶解液由50％乙腈，0.5％三氟乙酸和49.5％的水组成，百分比均为体积比)静置充分溶解后，于4℃12000rpm离心10min，得到的谷蛋白上清液可以直接加入2mL标准进样小瓶，放入超高效液相色谱仪样品管理器中。

开机设置程序，波长设为214nm，色谱柱温度设为60℃，样品设为25℃，所用色谱柱为Agilent ZORBAX 300SB-C18液相色谱柱StableBond Analytical 4.6x 150mm,5μm，(DE-NKY-883995-902)。流动相A为含有0.06％(V/V)三氟乙酸水溶液，流动相B为含有0.06％(V/V)三氟乙酸的三氟乙酸-乙腈溶液，所配流动相过0.45μM有机系滤膜，流速为1mL/min。洗脱条件如下(％表示体积百分比)：

醇溶蛋白和谷蛋白的RP-UPLC图谱如图4和图5所示，利用春麦品种Fielder和空载体对照植株作为对照。在35min的分离时间内，ω-醇溶蛋白在6.5-14min时完成了良好的分离；α/β-醇溶蛋白出现共洗脱，主要在14-20min洗脱下来；γ-醇溶蛋白则在20-26min时才被洗脱下来。谷蛋白的分离时间为1h，HMW-GS亚基在15-25min之内完成分离，y型亚基先于x型亚基，其中1Dy亚基早于1By亚基，1Dx亚基早于1Bx亚基，LMW-GS则在28-37min时才被洗脱下来。利用工作站软件Empower积分获取各组分面积，相应峰的面积即表示为蛋白的含量。

通过含量分析发现，只有一种在11min48s起峰保留时间为18s的ω-醇溶蛋白(记为11min48s ω-醇溶蛋白)含量有显著差异，转基因植株比春麦品种Fielder含量高了1.2倍，ω-醇溶蛋白、α/β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白含量在转基因植株中与春麦品种Fielder均无明显差异。且11min48s ω-醇溶蛋白含量的变化并没有对ω-醇溶蛋白总含量造成差异(图6)。空载体对照植株与春麦品种Fielder的ω-醇溶蛋白含量无显著差异。

转基因植株中的谷蛋白含量则与春麦品种Fielder相比均呈现明显降低趋势。HMW-GS总含量降低了78％，其中1Dy和1By亚基分别降低了35.5％和33.2％，1Dx亚基的下降幅度最大为90％，1Bx亚基次之，为77.3％(图7)；相比较而言，LMW-GS含量下降幅度较小，为55.4％(图7)。HMW-GS与谷蛋白总量的比值降低，相应LMW-GS占谷蛋白总量的比例则增加(图8)，而其中两种x-型亚基(1Dx亚基和1Bx亚基)占谷蛋白总量的比例均呈显著性降低，两种y-型亚基(1Dy和1By亚基)则比例不变(图8)。因此HMW-GS与LMW-GS比值也显著下降(图9)，谷蛋白与醇溶蛋白比值也显著降低(图9)。空载体对照植株与春麦品种Fielder的各谷蛋白含量均无显著差异。

<110> 中国农业大学

<120> 表达抑制SPA基因的发卡RNA的DNA分子及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

agctttgagt ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac 60

cccaagaagg ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca 120

cacttctgca aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact 180

gtccaaaaat ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt 240

tggcaaactg cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac 300

aaacctcacc gtgcacgcag ccatgagctt tgagtggccg tagatttgca aaagcaatgg 360

ctaacagaca catattctgc caaaccccaa gaaggataat cacttttctt agataaaaaa 420

gaacagacca atatacaaac atccacactt ctgcaaacaa tacatcagaa ctaggattac 480

gccgattacg tggctttagc agactgtcca aaaatctgtt ttgcaaagct ccaattgctc 540

cttgcttatc cagcttcttt tgtgttggca aactgcgctt ttccaaccga ttttgttctt 600

ctcgcgcttt cttcttaggc taaacaaacc tcaccgtgca cgcagccatg gtcctgaacc 660

ttcacctcgt ccctataaaa gcctagccaa ccttcacaat cttatcatca cccacaacac 720

cgagcaccac aaactagaga tcaattcact gatagtccac ccggtcgact ctagaggatc 780

cccgggtacc gtcgccatgt tgaggaccac tccgggaatt tgccgacaaa gctcccatga 840

caatggagca tcgcaaaatc cagattccat ccaaggctca gaaaaccaca ccggggatgt 900

cagtgtgcat cagcttagct cttcctcatt ggagccatca ccatcagatg gtgatatgga 960

aggggaggca caaacaattg gaactatgca tattagtgca gagaaagcga ataagaggaa 1020

agaatctaac agggattcgg caagacgctc aaggagtaga aaagcagctc atacgaagga 1080

actagaggag caggtctcac tattaagagt cgcaaataac tctttgatga gacatcttgc 1140

agatgtaagt caaagatacg ttaatatctc tattgacaat agggtactca aggcaaatgt 1200

tgaaacccta gaagcaaagg taaagatggc cgaggaaact atgaattctc gagacctgca 1260

cctatgtttc tgcagaaaac caaaagcaaa agaatcaaca agctgaaaac tcaagactat 1320

ggaatagttt tatcattaat tctaaaaaac agagcatgca caagaaacaa gtggtaacga 1380

tccaagagag tcttcagaca aatgatccaa agtgggaaat caggttgtga aagggattgc 1440

cacaaataga aaatgcgtgg accaaaagga ataaagagta gagaagcggc ataatgtgag 1500

aaatacaaaa acgattgcgt tgagaatacg actagtagta agtaatacga tgttaataag 1560

gcaggtcaca tctcttgctt gtggttaaca tcagtttgct tgtattaaaa attcagcgat 1620

cgaaatcaca aatcgtattg aaaaccaagt tgacaaacaa agccaaaaga aaacagttga 1680

agtgatgtat aagccaccag aatttgtcga catcatatat cagatttaga tatttaaaca 1740

gaaaataaaa tgtgacgacg gatctagaaa atttgccatg caactgtaat cgcatctgaa 1800

tcaatcaaag agcatctgat cctgaattat tttgattcca acttttatcg taaggggttt 1860

aagagaatct ataaaacttt tgttttcctt ttattatgta tttttactat aaaaacccaa 1920

taggagtaaa aaatccagga aagattcaat agtagaagca gatttttacc cagaacaaat 1980

agccaaaaaa tgaatacatt aacaaataac aatttatgct gttttttttt ttttcaattt 2040

ccaccaaccc accagaaaat aaaataaaat aaagatctaa acaaattggt caaagcaaat 2100

catcttagaa aaaaagaaga aaagtgaaaa tgcaacatat cgttttgtag acgagagaaa 2160

ctaatcattg tatgaatgag agagttcatt attattaatg gtgacagaac ataaacaaac 2220

atcagattct cgaccaaaag aaaaaaacag agaaacagag aatcgagacc agatctaagg 2280

ttgaatgtaa ggagtataag cagatctatc gtgagcggag aaattcacag agcaggagct 2340

actggaaaga aataagaatc aaaatcgaaa atgagaagaa atggaagaga agcgacggac 2400

ctggagaagc ttgaattcat agtttcctcg gccatcttta cctttgcttc tagggtttca 2460

acatttgcct ttagtaccct attgtcaata gagatattga cgtatctgtg acttacatct 2520

gcaagatgtc tcatcaaaga gttatttgcg actcttaata gtgagacctg ctcctctagt 2580

tccttcgcat gagctgcttt tctactcctt gagcgtctcg ccgaatccct gttagattct 2640

ttcctcttat tcgctttctc tgcactaata tgcatagttc caattgtttg tgcctcccct 2700

tccatatcac catctgatgg tgatggctcc aatgaggaag agctaagttg atgcaaactg 2760

acatctccgg tgtggttttc tgagccttgg atggaatctg aattttgcga tgctccattg 2820

tcatgggagc tttgtgggca aattccccga gtggtcctca acatggcgac ggtaccgagc 2880

tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 2940

gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 3000

aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 3060

tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 3120

gcggtgtcat ctatgttact 3140

Claims

1.如式(I)所示的DNA片段：

SEQ_正向-X-SEQ_反向 (I)

所述SEQ_正向的序列为SPA基因的序列或其任意片段；

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：所述SEQ_正向的序列为如下a1)至a4)中的任一种：

a1)序列表中序列1的第791-1242位；

a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的序列；

a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的序列；

和/或，所述SEQ_反向的序列为如下b1)至b4)中的任一种：

b1)序列表中序列1的第2419-2870位；

b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的序列；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的序列；

和/或，所述X的序列为含有FAD2基因的内含子的序列。

3.根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于：所述FAD2基因的内含子的序列为序列1的第1270-2400位。

4.根据权利要求1-3任一所述的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列1的第791-2870位。

5.与权利要求1-4中任一所述DNA片段相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)含有权利要求1-4中任一所述DNA片段的表达盒；

B2)含有B1)所述表达盒的重组载体；

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：B1)所述表达盒中，驱动所述DNA片段转录的启动子为胚乳特异性启动子；

和/或，所述表达盒中终止所述DNA片段转录的终止子为NOS终止子。

7.权利要求1-4中任一所述DNA片段编码得到的RNA分子。

8.权利要求1-4中任一所述的DNA片段，或权利要求5或6所述的生物材料，或权利要求7所述的RNA分子，或SPA基因或其任意片段在如下m1)-m16)中的任一种中的应用：

m1)抑制SPA基因表达；

m2)降低SPA基因编码蛋白质的活性；

m3)降低SPA基因编码蛋白质的水平；

m4)降低植物种子储藏蛋白含量；

m5)降低植物种子谷蛋白含量；

m6)降低植物种子高分子量谷蛋白亚基含量；

m8)降低植物低分子量谷蛋白亚基含量；

m9)降低植物种子高分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例；

m11)提高植物种子低分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例；

m13)降低植物种子中谷蛋白与醇溶蛋白的比例；

m14)降低植物种子的SDS沉降值；

m15)培育转基因植物；

m16)调控植物种子品质。

9.下述X1)或X2)的方法：

X1)一种培育转基因植物的方法，包括：将权利要求1-4中任一所述的DNA片段导入目的植物中，得到与所述目的植物相比具有如下n1)-n15)中任一特性的转基因植物：

n1)SPA基因表达被抑制；

n2)SPA基因编码蛋白质的活性降低；

n3)SPA基因编码蛋白质的水平降低；

n4)种子储藏蛋白含量降低；

n5)种子谷蛋白含量降低；

n6)种子高分子量谷蛋白亚基含量降低；

n8)低分子量谷蛋白亚基含量降低；

n9)种子高分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例降低；

n11)种子低分子量谷蛋白亚基在谷蛋白中的比例提高；

n13)种子中谷蛋白与醇溶蛋白的比例降低；

n14)种子的SDS沉降值降低；

n15)植物种子品质改变；

10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为下述c1)、c2)、c3)或c4)：

c1)单子叶植物；

c2)双子叶植物；

c3)禾本科植物；

c4)小麦。