CN108743969B - 一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，采用将超支化聚酯H30通过开环聚合ε‑己内酯，再对其末端‑OH进行修饰以得到含有Pd(Ⅱ)的催化剂，并以此聚合L‑型亲水苯异腈单体和叠氮化物官能化的苯异腈单体，然后将末端炔基修饰的胍基与叠氮基团通过click反应连接上，形成两亲性嵌段共聚物，并通过自组装以获得带正电的单分子胶束；最后，二甲基马来酸酐和叶酸共同改性的PEI与上述得到的单分子胶束共组装，从而得到拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体。本发明方法制备的肿瘤靶向纳米载体，易于药物的负载、输运和可控释放，对肿瘤细胞能够起到良好的光热‑化学治疗效果。

Description

一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法
技术领域
本发明涉及聚合物反应领域，具体为一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法。
技术背景
近年来，随着纳米技术与合成化学的飞速发展，纳米载体在生物医学领域中的应用研究收到越来越多的关注；其中，高分子基纳米载体为生物医学成像、诊断、以及药物输运提供了新的手段和思路。研究表明，纳米至亚微米尺度的载体对组织粘膜有着较强的吸附和穿透，高分子基胶束、囊泡等纳米结构可通过在肿瘤组织内的增强渗透和滞留(EPR)效应而“被动靶向”至肿瘤部位。
对于具有生物相容性的两亲性嵌段共聚物而言，其在水溶液中的浓度达到临界胶束浓度(CMC)以上时能形成以亲水嵌段为外壳、以疏水嵌段为内核的组装体，这就赋予了疏水内核增溶憎水性染料分子或药物分子的能力，从而实现对肿瘤部位的光学成像及抗癌药物的输运。
药物分子能够顺利实现跨膜输送至细胞核是实施肿瘤治疗的关键，然而，细胞膜的生物屏障作用会阻止很多高分子物质进入细胞内，从而很大程度上限制人工合成高分子作为药物载体的可能性以及在后续治疗上的应用。因此，如何便捷引导这类物质穿透细胞膜是一个迫切需要解决的问题。目前，有效介导大分子穿透细胞膜的方法之一即为细胞穿透肽(CPPs)，CPPs能够以非受体依赖和非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞，达到高效输送药物分子的目的。已知的部分CPPs要么具有固有的螺旋结构，要么能够在细胞膜表面形成螺旋结构，加上疏水部分能形成刚性的两亲性结构，两者的协同效应使CPPs能够更加有效的与细胞膜磷脂层作用，从而促进细胞通透性。
聚苯异腈(PPIs)是最早发现的具有稳定螺旋构象的高分子之一，其性质稳定、单体易得、聚合方法简单、在溶液中和固态时均能很好的保持螺旋结构，因而是一种非常有意义的人工合成螺旋聚合物。日本Yashima教授等报道了在金属催化剂催化下的活性聚合苯基异腈及其聚合物的组装行为，这种聚苯异腈可以形成非常稳定的刚性螺旋构象，并能稳定的存在于溶液、本体、以及基材表面。
因此结合以上的论述，研发一种基于聚苯异腈的拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备工艺，实现肿瘤靶向纳米载体的制备，可以用于药物负载、输运和可控释放，对肿瘤细胞起到良好的治疗效果的目标。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，制备的肿瘤靶向纳米载体，易于药物的负载、输运和可控释放，对肿瘤细胞能够起到良好的光热-化学治疗效果。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，将超支化聚酯H30通过开环聚合ε-己内酯，再对其末端-OH进行修饰以得到含有Pd(Ⅱ)的催化剂，并以此聚合L-型亲水苯异腈单体和叠氮化物官能化的苯异腈单体，然后将末端炔基修饰的胍基与叠氮基团通过click反应连接上，形成两亲性嵌段共聚物，并通过自组装以获得带正电的单分子胶束；最后，二甲基马来酸酐和叶酸共同改性的PEI与上述得到的单分子胶束共组装，从而得到拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体。
优选地，所述两亲性嵌段共聚物的结构式为：
Figure BDA0001671979180000031
其中R1为左手螺旋的PEG亲水链，R2为末端含有胍基的基团。
优选地，所述PEI的改性反应过程为：
Figure BDA0001671979180000041
，其中X为pH响应性基团，Y为叶酸基团。
优选地，所述的单分子胶束呈球形结构，疏水部分为聚ε-己内酯，亲水部分为聚L-型亲水苯异腈且具有左手螺旋，并加入少量叠氮化物官能化的苯异腈以方便连接上胍基；所述的纳米载体呈球形胶束结构，是通过带有正电荷的单分子胶束和带有负电荷的改性的PEI链共组装得到。
优选地，一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、L-型亲水苯异腈单体的合成：
a、将cbz-L-丙氨酸与五乙二醇单甲醚反应，分离、洗涤并干燥后得到产物Ⅰ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000042
b、将产物Ⅰ与氢气反应，分离、洗涤并干燥后得到产物Ⅱ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000051
c、将产物Ⅱ与五氟苯酚异腈单体反应，分离、洗涤并干燥后得到L-型亲水苯异腈单体Ⅰ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000052
S2、叠氮化物官能化的苯异腈单体的合成：
a、将2-溴-2-甲基丙酰溴与乙二醇反应，分离、洗涤并干燥后得到产物Ⅲ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000053
b、产物Ⅲ与叠氮化钠反应，分离、洗涤并干燥后得到产物Ⅳ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000054
c、产物Ⅳ与五氟苯酚异腈单体反应，分离、洗涤并干燥后得到叠氮化物官能化的苯异腈单体Ⅱ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000055
S3、末端带有Pd(Ⅱ)的聚ε-己内酯大分子催化剂的合成：
a、在聚合瓶中加入超支化聚酯H30、辛酸亚锡催化剂和ε-己内酯，即在辛酸亚锡的催化下，H30的端羟基引发ε-己内酯的开环聚合，得到聚合物Ⅰ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000061
b、聚合物Ⅰ与4-氧代-4-(丙-2-炔-1-基氧基)丁酸反应，分离、洗涤并干燥后得到中间体Ⅰ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000062
c、中间体Ⅰ与三乙基膦二氯化钯反应，分离、洗涤并干燥后得到末端带有Pd(Ⅱ)的中间体Ⅱ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000063
S4、两亲性嵌段共聚物的合成：
a、在聚合瓶中加入中间体Ⅱ、单体Ⅰ和单体Ⅱ，即钯引发剂引发L-型亲水苯异腈单体和叠氮化物官能化的苯异腈单体进行无规共聚，分离、洗涤并干燥后得到聚合物Ⅱ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000064
其中R1为左手螺旋的PEG亲水链，R3为叠氮化物功能化的基团；
b、聚合物Ⅱ与末端炔基修饰的胍基反应，分离、洗涤并干燥后得到聚合物Ⅲ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000071
其中R1为左手螺旋的PEG亲水链，R2为末端含有胍基的基团；
S5、二甲基马来酸酐和叶酸共同改性的具有pH响应性和可通过受体介导内吞作用的PEI链的合成：
在反应瓶中加入PEI和叶酸，待叶酸反应完全后再加入二甲基马来酸酐进行反应，分离、洗涤并干燥后得到改性的PEI聚合物Ⅳ，PEI的改性反应过程为：
Figure BDA0001671979180000081
，其中X为pH响应性基团，Y为叶酸基团；
S6、肿瘤靶向纳米载体的合成：
将聚合物Ⅲ、抗癌药物喜树碱(CPT)和具有近红外吸收特性的花箐分子(IR780)溶于少量DMF中，将去离子水缓慢滴入到快速搅拌的DMF溶液中，滴完后，透析得到外部带有正电荷的单分子胶束；再将上述得到的单分子胶束滴加到快速搅拌的改性后的PEI聚合物Ⅳ的去离子水溶液中，从而得到以拟细胞穿膜肽功能的螺旋高分子为基础组装而成的具有“集束炸弹”结构的肿瘤靶向尺寸可切换的纳米载体。
优选地，经制备的肿瘤靶向纳米载体，其外围的叶酸部分可通过受体介导的内吞作用被肿瘤细胞有效内化；在肿瘤细胞酸性的微环境中，其改性后的PEI中的酰胺键具有pH响应性以实现电荷反转，释放出由两亲性嵌段共聚物组装并包裹CPT及IR780的单分子胶束。
优选地，所述S1-a步骤中，产物Ⅰ的合成原料包括：cbz-L-丙氨酸、五乙二醇单甲醚、EDCI、DMAP，其摩尔比为1：1：1.1：0.2。
优选地，所述S3-b步骤中，中间体Ⅰ的合成原料包括：聚合物Ⅰ、4-氧代-4-(丙-2-炔-1-基氧基)丁酸、EDCI、DMAP,其摩尔比1：10：10：5。
优选地，所述S3-c步骤中，中间体Ⅱ的合成原料包括：中间体Ⅰ、三乙基膦二氯化钯、氯化亚铜、二乙胺，其摩尔比为1：2：0.05：2。
优选地，所述S4-b步骤中，聚合物Ⅲ的合成原料包括：聚合物Ⅱ、(丙-2-炔-1-基)胍、碘化亚铜、DBU，其摩尔比1：1.5：0.1：0.1。
本发明的有益效果在于：
本发明一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，聚合过程可控，得到的聚合物分子量均一，分子量分布窄，经制备的肿瘤靶向纳米载体，其最外层具有叶酸基团，叶酸是癌细胞靶向部分，可通过受体介导的内吞作用被肿瘤细胞有效内化；纳米载体其最外层显示负电性，单分子胶束的外层螺旋结构为左手螺旋，与细胞膜相互作用更强；单分子胶束的外层为具有螺旋结构的聚苯异腈亲水链，在水中能保持很好的螺旋结构，并且在亲水段引入胍基，模拟细胞穿膜肽，促进纳米载体更快、更高效地进入细胞；单分子胶束外层的亲水链为PEG修饰，无毒，具有良好的生物相容性；球形结构的纳米载体，可以负载药物，且在体内可以逐步被降解，达到程序控释药物的目的；纳米载体，包裹的药物喜树碱(CPT)和具有近红外吸收的光热效应的花菁分子(IR780)，可达到化学-光热协同治疗的效果。
附图说明
图1：本发明S2步骤中叠氮化物官能化的苯异腈单体的合成路线以及1H NMR(CDCl3，600M Hz)和红外谱图；
图2为本发明S3步骤中的末端带有Pd(Ⅱ)的聚ε-己内酯大分子催化剂的合成过程的每步1H NMR(CDCl3，600M Hz)；
图3：本发明S3步骤中的末端带有Pd(Ⅱ)的聚ε-己内酯大分子催化剂的合成过程的每步红外谱图；
图4：本发明S4步骤中的两亲性嵌段共聚物的合成路线；
图5：本发明S4步骤中的两亲性嵌段共聚物click反应前后的红外谱图；
图6：本发明S5步骤中的改性前后的PEI链的紫外光谱图，以及改性后在不同pH值溶液中的Zeta电位图；
图7：本发明S6步骤中的胶束结构的纳米载体的合成路线图；
图8a：本发明的胶束结构的纳米载体在不同pH值溶液中的Zeta电位图；图8b：本发明的纳米载体在生理条件和弱酸性条件下的DLS图；图8c：本发明的纳米载体在不同浓度下的光热转换图；图8d：本发明的纳米载体在有无光照条件下的药物释放对比图；
图9：本发明的纳米载体在808nm激光辐射200秒的过程中的体外光热图；
图10：本发明实的纳米载体的体外光声成像图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，包括如下步骤：
S1、L-型亲水苯异腈单体的合成：
a、将cbz-L-丙氨酸、五乙二醇单甲醚、EDCI、DMAP按摩尔比1:1:1.1:0.2，加入两口瓶中，以二氯甲烷为溶剂，常温反应过夜；TLC显示反应完全后，用水洗3次，饱和碳酸氢钠溶液洗3次，饱和氯化钠溶液洗3次，收集有机相，加无水硫酸钠干燥3h，抽滤除去无水硫酸钠，旋蒸除去溶剂，过硅胶柱提纯(洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为1：1)，收集产物，除去溶剂，真空干燥，得产物Ⅰ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000111
b、将产物Ⅰ和Pd/C按质量比1：0.1的比例加入双口瓶中，加入THF，先置换氮气，然后置换为氢气，常温反应，TLC跟踪反应至完全，抽滤除去Pd/C，旋蒸除去溶剂，过硅胶柱提纯(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为15：1)，收集产物，除去溶剂，真空干燥，得产物Ⅱ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000112
c、将产物Ⅱ和五氟苯酚异腈按摩尔比1.1:1，加入双口瓶中，置换氮气3-5次，加入4个当量的三乙胺，以及适量THF，室温反应；TLC跟踪反应至完全，取下反应，用水洗3次，饱和碳酸氢钠溶液洗3次，饱和氯化钠溶液洗3次，收集有机相，加无水硫酸钠干燥3h，抽滤除去无水硫酸钠，旋蒸除去溶剂，过硅胶柱提纯(洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚，其中乙酯和石油醚的体积比为2：1)，收集产物，除去溶剂，真空干燥，得到L-型亲水苯异腈单体Ⅰ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000121
S2、叠氮化物官能化的苯异腈单体的合成：
如图1a所示为叠氮化物官能化的苯异腈单体的合成路线，具体包括以下步骤：
a、将无水乙二醇和三乙胺按摩尔比1：1加入两口瓶中，以二氯甲烷为溶剂，将两口瓶放入冰浴并用磁力搅拌棒搅拌；此后，在1小时内滴加0.9个当量的2-溴异丁酰溴二氯甲烷溶液；然后，将反应混合物在室温下再搅拌5小时，通过抽滤除去不溶性盐后，将滤液浓缩并通过过硅胶柱进一步提纯(洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚，其中乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：6)，除去溶剂，真空干燥。得到产物Ⅲ，结构式为其结构式为：
Figure BDA0001671979180000122
b、将产物Ⅲ和叠氮化钠按摩尔比1：1.2的投料，将产物Ⅲ加入到在40mL DMF中的叠氮化钠溶液中，并将反应混合物在室温搅拌12h；然后，加入50mL的二氯甲烷并将溶液用水洗涤以除去过量的叠氮化钠和DMF；收集有机相，加无水硫酸钠干燥3h，抽滤除去无水硫酸钠，旋蒸除去溶剂，真空干燥，得到产物Ⅳ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000131
c、将产物Ⅳ、五氟苯酚异腈、4-二甲基氨基吡啶按摩尔比1.2：1：1加入到两口瓶中，再加入25mL无水THF，所得混合物在30℃下搅拌12小时，取下反应，用水洗3次，饱和碳酸氢钠溶液洗3次，饱和氯化钠溶液洗3次，收集有机相，加无水硫酸钠干燥3h，抽滤除去无水硫酸钠，旋蒸除去溶剂，过硅胶柱提纯(洗脱剂为二氯甲烷)，收集产物，除去溶剂，真空干燥，得到单体Ⅱ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000132
如图1b、c、d所示为叠氮化物官能化的苯异腈单体的1H NMR(CDCl3，600M Hz)和红外谱图。由1H NMR可知，叠氮化物官能化的苯异腈单体合成成功，红外谱图在叠氮基团反应前后的叠氮峰更加说明了反应的进行。
S3、末端带有Pd(Ⅱ)的聚ε-己内酯大分子催化剂的合成：
a、将H30(0.017mmol；[-OH]＝0.54mmol)，ε-己内酯(18.9mmol)和辛酸亚锡(0.027mmol；[催化剂]/[-OH]＝1/20)装入10mL聚合瓶中并在惰性氮气气氛下加热至130℃，将反应混合物在130℃下搅拌6小时；冷却至室温后，将粗产物溶于氯仿中，并沉淀入过量的冷甲醇中以除去残余单体和催化剂，真空干燥，得到聚合物Ⅰ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000141
b、将聚合物Ⅰ中的[-OH]、4-氧代-4-(丙-2-炔-1-基氧基)丁酸、EDCI、DMAP按摩尔比1：10：10：5加入到两口瓶中，加入25mL氯仿，所得的混合物在55℃反应24小时，冷却至室温后，将氯仿旋至少量，并沉淀入过量的冷甲醇中以除去残余单体和催化剂，真空干燥，得到中间体Ⅰ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000142
c、将中间体Ⅰ中的炔基、三乙基膦二氯化钯、氯化亚铜、二乙胺按摩尔比1：2：0.05：2加入到两口瓶中，加入25mL氯仿，所得的混合物在室温下避光反应24小时，取下反应后用硅藻土抽滤，将滤液旋至少量，并沉淀入过量的冷甲醇中以除去残余单体，真空干燥，得到末端带有Pd(Ⅱ)的中间体Ⅱ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000143
如图2所示，为本发明的末端带有Pd(Ⅱ)的聚ε-己内酯大分子催化剂的合成过程的每步1H NMR(CDCl3，600M Hz)；图3所示，为本发明中的末端带有Pd(Ⅱ)的聚ε-己内酯大分子催化剂的合成过程的每步红外谱图；由图2和3可知，1H NMR和红外谱图显示了在每一步反应过程中相应的氢的位置以及红外特征峰的归属，证明了反应的成功进行。
S4、两亲性嵌段共聚物的合成：
如图4所示为两亲性嵌断共聚物的合成路线，其具体包括以下步骤：
a、在聚合瓶中加入末端带有Pd(Ⅱ)的中间体Ⅱ、单体Ⅰ、单体Ⅱ，其摩尔比分别为1：40：5，抽真空-充氮气，在氮气氛围下加入无水甲苯，80℃下搅拌反应过夜；将所得溶液倒入过量的冷乙醚中，然后过滤收集沉淀的固体，用乙醚和甲醇洗涤数次，除去残留的金属盐和未反应的单体，真空干燥，得到聚合物Ⅱ，其结构试为：
Figure BDA0001671979180000151
其中R1为左手螺旋的PEG亲水链，R3为叠氮化物功能化的基团；
b、将聚合物Ⅱ中的叠氮基团、(丙-2-炔-1-基)胍、碘化亚铜、DBU按摩尔比1：1.5：0.1：0.1加入到两口瓶中，再加入20mL DMF，所得的混合物在40℃反应48小时，取下反应后用硅藻土抽滤，将所得滤液倒入过量的冷乙醚中，然后过滤收集沉淀的固体，用乙醚和甲醇洗涤数次，除去残留的金属盐和未反应的单体，真空干燥，得到聚合物Ⅲ，其结构式为：
Figure BDA0001671979180000161
其中R1为左手螺旋的PEG亲水链，R2为末端含有胍基的基团；
如图5所示为两亲性嵌段共聚物click反应前后的红外谱图，由图可知，在click反应前，红外图中有叠氮特征峰的存在，但当反应过后，叠氮的特征峰完全消失，证明了click反应的成功进行。
S5、二甲基马来酸酐和叶酸共同改性的具有pH响应性和可通过受体介导内吞作用的PEI链的合成：
在100mL两口瓶中，将PEI(0.34g，0.034mmol；[-NH2]：～2.05mmol)溶于20mL去离子水中，然后加入含有叶酸(88.28mg，0.2mmol)、EDCI(39mg，0.2mmol)和DMAP(0.02g，0.17mmol)的DMF20mL，并将混合物在避光条件下30℃搅拌24小时；然后，加入含有2,3-二甲基马来酸酐(0.5g，4.0mmol)的DMF10mL，在相同条件下再反应10小时，减压除去溶剂后，将混合物沉淀到大量的无水乙醚中，除去所有溶剂并在真空烘箱中干燥后，得到改性的PEI聚合物Ⅳ，其反应过程为：
Figure BDA0001671979180000171
，其中X为pH响应性基团，Y为叶酸基团。
如图6所示为改性前后的PEI链的紫外光谱图，以及改性后在不同pH值溶液中的Zeta电位图；由图可以看到，改性后的PEI处于生理环境或碱性环境时，所带电荷为负电，当处于类似肿瘤细胞的酸性环境中时，所带电荷为正电，说明改性后的PEI具有电荷反转的功能；
S6、肿瘤靶向纳米载体的合成：
如图7所示，为球形胶束的肿瘤靶向纳米载体合成路线，其具体的合成步骤为：
取5mg聚合物Ⅲ、1mg抗癌药物喜树碱(CPT)和2mg具有近红外吸收特性的花箐分子(IR780)溶于1mL DMF中，缓慢滴入到剧烈搅拌的去离子水中(转速：1400-1600rpm，1h滴完)，聚合物滴完后，保持高速(转速为1400-1600rpm)搅拌25-35min，之后低速(转速为300-500rpm)搅拌1.8-2.5h，转移到透析袋中用去离子水透析24h(约间隔6h换一次去离子水)，得到球形结构的单分子胶束；再取聚合物Ⅳ2mg溶于5mL去离子水中，将单分子胶束缓慢滴入到剧烈搅拌的上述溶液中(转速：1400-1600rpm，0.5h滴完)，单分子胶束滴完后，保持低速(转速为300-500rpm)搅拌3h，得到球形胶束结构的纳米载体，即以拟细胞穿膜肽功能的螺旋高分子为基础组装而成的具有“集束炸弹”结构的肿瘤靶向尺寸可切换的纳米载体。
经制备的肿瘤靶向纳米载体，其外围的叶酸部分可通过受体介导的内吞作用被肿瘤细胞有效内化；在肿瘤细胞酸性的微环境中，其改性后的PEI中的酰胺键具有pH响应性以实现电荷反转，释放出由两亲性嵌段共聚物组装并包裹CPT及IR780的单分子胶束。
本发明合成的纳米载体中包裹了具有近红外光吸收特性的花箐分子，当纳米载体富集在肿瘤细胞后，在近红外光的辐射下，肿瘤细胞的局部温度会明显上升，不仅起到了光热治疗的效果，也会进一步促进药物分子的释放，从而起到了化学治疗的效果，实现了化学-光热协同治疗的特性。因此使用该纳米载体负载药物具有明显的化学-光热协同治疗的特征。
如图8a所示为本发明组装而成的具有“集束炸弹”结构的肿瘤靶向尺寸可切换的纳米载体在不同pH值溶液中的Zeta电位图；如图8b所示为本发明的纳米载体在生理条件和弱酸性条件下的DLS图；如图8c所示为本发明的纳米载体在不同浓度下的光热转换图；如图8d所示为本发明的纳米载体在有无光照条件下的药物释放对比图；由图a可知，当纳米载体处于生理环境或碱性环境时，外部的PEI链带负电荷，当处于类似肿瘤细胞的酸性环境中时，外部的PEI链带正电荷，可以与内部包裹的单分子胶束电荷相互排斥以释放大量的单分子胶束，图b中在不同PH值下纳米载体的粒径变化很好的证明了单分子胶束的释放；图c说明在近红外光的辐射下，纳米载体可以升高温度，实现光热治疗的效果；图9验证了当使用近红外光辐射6分钟后，纳米载体所包裹的抗癌药物能够得到更高的释放，以更好实现化疗的效果。
如图9所示为本发明的纳米载体在808nm激光辐射200秒的过程中的体外光热图；由图可以看到当808nm的近红外光辐射150秒之后，温度已经超过50℃，表明具有很好的光热治疗的效果。
如图10所示，为本发明的纳米载体的体外光声成像图；本发明合成的纳米载体可以被认为是潜在功能的外源光声造影剂。由图可知，当使用由波长为800nm的激光激发的光声仪器研究相应纳米聚集体的体外光声效应，随着样品浓度的增加，可以明显的得到清晰的光声图像，因此该纳米载体可以在光声成像领域有很好的应用。
上述结合附图对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非实质改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，将超支化聚酯H30通过开环聚合ε-己内酯，再对其末端-OH进行修饰以得到含有Pd(Ⅱ)的催化剂，并以此聚合L-型亲水苯异腈单体和叠氮化物官能化的苯异腈单体，然后将末端炔基修饰的胍基与叠氮基团通过click反应连接上，形成两亲性嵌段共聚物，并通过自组装以获得带正电的单分子胶束；最后，二甲基马来酸酐和叶酸共同改性的PEI与上述得到的单分子胶束共组装，从而得到拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体。
2.根据权利要求1所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物的结构式为：
Figure FDA0003162474750000011
其中R1为左手螺旋型。
3.根据权利要求1所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述PEI的改性反应过程为：
Figure FDA0003162474750000021
4.根据权利要求1所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述的单分子胶束呈球形结构，疏水部分为聚ε-己内酯，亲水部分为聚L-型亲水苯异腈且具有左手螺旋，并加入少量叠氮化物官能化的苯异腈以方便连接上胍基；所述的纳米载体呈球形胶束结构，是通过带有正电荷的单分子胶束和带有负电荷的改性的PEI链共组装得到。
5.根据权利要求1所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、L-型亲水苯异腈单体的合成：
a、将cbz-L-丙氨酸与五乙二醇单甲醚反应，分离、洗涤并干燥后得到产物Ⅰ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000022
b、将产物Ⅰ与氢气反应，分离、洗涤并干燥后得到产物Ⅱ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000031
c、将产物Ⅱ与五氟苯异腈 活性酯单体反应，分离、洗涤并干燥后得到L-型亲水苯异腈单体Ⅰ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000032
所述五氟苯异腈 活性酯单体的结构式为：
Figure FDA0003162474750000033
S2、叠氮化物官能化的苯异腈单体的合成：
a、将2-溴-2-甲基丙酰溴与乙二醇反应，分离、洗涤并干燥后得到产物Ⅲ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000034
b、产物Ⅲ与叠氮化钠反应，分离、洗涤并干燥后得到产物Ⅳ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000035
c、产物Ⅳ与五氟苯异腈 活性酯单体反应，分离、洗涤并干燥后得到叠氮化物官能化的苯异腈单体Ⅱ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000041
S3、末端带有Pd(Ⅱ)的聚ε-己内酯大分子催化剂的合成：
a、在聚合瓶中加入超支化聚酯H30、辛酸亚锡催化剂和ε-己内酯，即在辛酸亚锡的催化下，H30的端羟基引发ε-己内酯的开环聚合，得到聚合物Ⅰ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000042
b、聚合物Ⅰ与4-氧代-4-(丙-2-炔-1-基氧基)丁酸反应，分离、洗涤并干燥后得到中间体Ⅰ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000043
c、中间体Ⅰ与三乙基膦二氯化钯反应，分离、洗涤并干燥后得到末端带有Pd(Ⅱ)的中间体Ⅱ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000044
S4、两亲性嵌段共聚物的合成：
a、在聚合瓶中加入中间体Ⅱ、单体Ⅰ和单体Ⅱ，即钯引发剂引发L-型亲水苯异腈单体和叠氮化物官能化的苯异腈单体进行无规共聚，分离、洗涤并干燥后得到聚合物Ⅱ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000051
其中R1为左手螺旋型；
b、聚合物Ⅱ与末端炔基修饰的胍基反应，分离、洗涤并干燥后得到聚合物Ⅲ，其结构式为：
Figure FDA0003162474750000052
其中R1为左手螺旋型；
S5、二甲基马来酸酐和叶酸共同改性的具有pH响应性和可通过受体介导内吞作用的PEI链的合成：
在反应瓶中加入PEI和叶酸，待叶酸反应完全后再加入二甲基马来酸酐进行反应，分离、洗涤并干燥后得到改性的PEI聚合物Ⅳ，PEI 的改性反应过程为：
Figure FDA0003162474750000061
S6、肿瘤靶向纳米载体的合成：
将聚合物Ⅲ、抗癌药物喜树碱(CPT)和具有近红外吸收特性的花箐分子IR780溶于少量DMF中，将去离子水缓慢滴入到快速搅拌的DMF溶液中，滴完后，透析得到外部带有正电荷的单分子胶束；再将上述得到的单分子胶束滴加到快速搅拌的改性后的PEI聚合物Ⅳ的去离子水溶液中，从而得到以拟细胞穿膜肽功能的螺旋高分子为基础组装而成的具有“集束炸弹”结构的肿瘤靶向尺寸可切换的纳米载体。
6.根据权利要求5所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，经制备的肿瘤靶向纳米载体，其外围的叶酸部分可通过受体介导的内吞作用被肿瘤细胞有效内化；在肿瘤细胞酸性的微环境中，其改性后的PEI中的酰胺键具有pH响应性以实现电荷反转，释放出由两亲性嵌段共聚物组装并包裹CPT及IR780的单分子胶束。
7.根据权利要求5所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述S1-a步骤中，产物Ⅰ的合成原料包括：cbz-L-丙氨酸、五乙二醇单甲醚、EDCI、DMAP，其摩尔比为1：1：1.1：0.2。
8.根据权利要求5所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述S3-b步骤中，中间体Ⅰ的合成原料包括：聚合物Ⅰ、4-氧代-4-(丙-2-炔-1-基氧基)丁酸、EDCI、DMAP,其摩尔比1：10：10：5。
9.根据权利要求5所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述S3-c步骤中，中间体Ⅱ的合成原料包括：中间体Ⅰ、三乙基膦二氯化钯、氯化亚铜、二乙胺，其摩尔比为1：2：0.05：2。
10.根据权利要求5所述的一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述S4-b步骤中，聚合物Ⅲ的合成原料包括：聚合物Ⅱ、(丙-2-炔-1-基)胍、碘化亚铜、DBU，其摩尔比1：1.5：0.1：0.1。
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