CN108741085A - 果胶在制备具有减肥效果的功能性食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了果胶在制备具有减肥效果的功能性食品中的应用，所述果胶的甲基化度为25‑40％。不同甲基化程度的果胶通过调节肠道微生物和代谢产物能够降低体重，特别是甲基化度为35％且酰胺化度为15％的果胶在减肥方面有较好效果。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，更具体而言，本发明涉及果胶在制备具有减肥效果的功能性食品中的应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高和膳食结构的改变，我国肥胖症患者数量逐年增长，尤其以大中城市患病率为高。根据国家统计局和国家卫计委的数据显示，我国肥胖患者大概将近9000万，其中女性肥胖患者约超过4500万，男性肥胖患者则超过4300万，总人数高居世界第一，肥胖成为了我国无法避免的一个健康问题。
肥胖作为能量不均衡的慢性疾病，其主要原因为长期摄入与有限的能量消耗相比过量的能量，使得过量的能量以白色脂肪组织的形式存储于体内。从发病原理上讲，肥胖可分为以下两类：单纯性肥胖和继发性肥胖，其中，单纯性肥胖是指无明显病因的肥胖，患者数量约占95％以上的总肥胖数目，是各种肥胖中最常见的一种，全身脂肪分布比较均匀，没有内分泌紊乱的现象，也无代谢障碍性疾病；而继发性肥胖则是由于明确疾病引起的肥胖，这类患者除了体内脂肪沉积过多的特征，还会出现其他各种各样的临床表现，如甲状腺功能减退等。
与正常体质者相比，肥胖不仅对生活质量和心理健康有不良影响，还会导致各种严重的并发症，如高血压、脑卒中、糖尿病、心血管疾病、脂代谢异常、部分癌症、胆囊炎、胆石症、糖耐量异常、肺功能不全等等，并且还能削弱机体抵抗力以致免疫功能下降。故而，肥胖的预防和治疗也就成为了医药学界的重要研究课题之一。
目前，预防和治疗肥胖的方法主要有节食、锻炼、药物治疗和手术治疗这四种，其中，节食和锻炼对普通大众而言一般很难成功，且需要长期坚持；手术治疗能达到立竿见影的效果，但存在手术风险、花费昂贵等限制；而药物治疗是目前临床治疗肥胖及其肥胖相关疾病的最常见且有效的方法。理想的减肥药物应能减少能量摄取，增加能量消耗，并改善肥胖相关的心血管疾病危险因子。迄今为止，减肥药物按作用机制主要可分为三类：抑制食欲的药物(苯丙醇(phenylpropanolamine)、氟西汀(fluoxetine,Prozac))等；影响营养物吸收的药物(奥司利他(orlistat))等；增加能量消耗的药物(西布曲明)等。然而这些药物均被报导有严重的不良反应，如西布曲明的副作用主要有口渴、便秘、头晕和失眠。因此，寻找新的安全有效的控制肥胖的方法已成为研究热点。
近年来研究证明肥胖与肠道菌群有密切关系：与正常人相比，肥胖者肠道内放线菌门比例升高，拟杆菌门比例降低；且肥胖个体肠道厚壁菌门比例更高，而当肥胖个体体重减轻时，其肠道微生物中厚壁菌门比例则与正常个体变得较为相似。肥胖人群肠道微生物发酵宿主无法消化的膳食多糖，引起肠道细胞吸收单糖和短链脂肪酸能力提高，随后进入肝脏转化为更复杂的脂质；同时宿主能量的代谢基因肠道受微生物调控，诱发脂肪过度积累。膳食纤维具有调节肠道菌群的作用，且由肠道菌群利用膳食纤维等发酵产生的短链脂肪酸具有提供能量，减少有害菌繁殖，防止肠道功能紊乱等功能。因此研究膳食纤维对肠道菌群及其代谢产物的影响，对进一步阐明膳食纤维的减肥机制有显著意义。
在目前常用的3大类膳食纤维即纤维素、果胶和木质素中，果胶类纤维具有较好溶解性和黏性，其在胃中酸性环境下较稳定，进入小肠后可有效吸附胆汁酸，且肠道微生物分泌的酶能够降解发酵果胶产生具有提供能量、减少有害菌繁殖等功能的短链脂肪酸。另外，有研究发现不同程度甲基化的果胶具有不同的生物活性。文献调研发现，迄今为止并没有系统地对甲基化果胶的肠道微生物调节活性进行系统的报道，故其在治疗肥胖是否有显著作用尚不清楚。
发明内容
鉴于上述问题，本发明发明人经大量实验发现，甲基化果胶能够调节肠道微生物和代谢产物，从而实现减肥的目的。
为了实现上述目的，本发明提供果胶在制备具有减肥效果的功能性食品中的应用，所述果胶的甲基化度为25-40％。
经大量实验证明，不同程度的甲基化果胶能够影响体重的增减，在甲基化度为25-40％范围内的甲基化果胶在降低体重方面即减肥方面效果显著。
优选地，在上述应用中，所述果胶的甲基化度为30-40％，更优选35-37％，最优选35％。
优选地，在上述应用中，所述果胶的酰胺化度为10-25％，优选15-20％,更优选为15％。
研究过程中发现，甲基化度为35％且酰胺化度为15％的果胶降低体重效果最为显著。而当甲基化度大于55时，果胶反而能够升高体重。
在本发明中，所述术语“甲基化”是指将果胶中半乳糖醛酸上的羧酸转变成其甲酯，“酰胺化”是指将果胶中半乳糖醛酸上的羧酸与相应的胺或铵盐发生缩合反应形成其酰胺。
优选地，在上述应用中，所述果胶进行甲基化时采用的甲基活性供体是甲醇、碘甲烷、硫酸二甲酯、重氮甲烷等，且进行酰胺化时采用的活性反应物质是氨气、氨水、碳酸铵、醋酸铵等铵盐。
优选地，在上述应用中，所述果胶可每日餐前或餐后食用，也可两餐中间作为零食食用，也可作为代餐食物食用，食用次数并没有严格限制。所述食用次数和食用量取决于多种因素，如食用者的性别、年龄、肥胖程度、达到减肥目的的时间等等。本发明果胶的实际食用量应能有效针对具体食用者和食用方式得到所要的效果，这需要根据果胶的性质、肥胖程度、食用者的身体状况等各种因素来选定，而本领域的通常做法是从低于得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加量，直到得到所需的效果。
在上述应用中，如果需要，可以将果胶与一种或多种食品上可接受的辅料结合，制成可作为应用对象适宜用的食用形式。所述术语“食品上可接受的”是指生理学上可接受并且食用时，通常不引起如胃肠功能紊乱、头晕等的过敏反应或与此类似的反应的组合物。
优选地，所述辅料包括赋形剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、着色剂等。
优选地，所述果胶可以呈现多种食用形态如固体形态、半固体形态、凝胶形态等本发明所属技术领域中通常使用的任何形态以进行食用，但不限定于此。更优选地，所述食用形态为固体形态如代餐粉等，及液态形态如茶类等。
优选地，在上述应用中，所述减肥是指降低应用对象体内的白色脂肪积累。换言之，即本发明中的果胶可减少由白色脂肪积累引起的肥胖，且在本发明中中，肥胖被定义为身体质量指数BMI大于30，其中身体质量指数BMI是指重量(单位为kg)除以身高(单位为m)的平方所得的比值。
优选地，在上述应用中，所述应用的对象为哺乳动物，且不局限于人，也可为宠物，如猫或狗。随着生活水平的提高，不仅仅人包括儿童也受到影响和/或已经有在以后生命中变得超重或肥胖的风险，在动物特别是在作为宠物动物饲养的动物中也越来越普遍，因此防止宠物变胖也变得日益普遍。
优选地，在上述应用中，如果应用对象是人，则当所述人为成人时，所述果胶足以减轻应用对象的体重的量即有效剂量是约每kg为0.2-1.0g，更优选0.3-0.6g最优选0.4g的果胶的日剂量，而当所述人为儿童时有效剂量是约每kg为0.3-1.5g，更优选0.45-0.9g最优选0.6g的果胶的日剂量，其中kg为应用对象的体重单位。在本发明中，成人是指年龄在18周岁以上的人，儿童则是指在年龄在18周岁以下且在6周岁以上的人。
优选地，在上述应用中，所述果胶也可用作功能性食品组分。本发明对果胶制作而成的食品形态没有特别要求，其可为固体形式、半固体形式、凝胶形式等本发明所属技术领域中通常使用的任何形态。
此外，本发明还提供果胶用于制备预防和/或治疗肥胖的药物中的应用。
优选地，在上述应用中，所述果胶可每日单次施用，也可每日两次或多次的的剂量施用。所述果胶的有效剂量也可由主治医师在可靠的医学判断范围内作出决定。
在上述应用中，如果需要，可以将果胶与一种或多种药学上可接受的辅料结合，制成可作为应用对象适宜用的给药形式。
在本发明中所述肥胖为单纯性肥胖，即无明显病因导致的肥胖。
本发明实施例对不同甲基化果胶减少高脂饮食小鼠肥胖风险的生理活性进行探讨，通过观察不同甲基化果胶对高脂饮食小鼠体重，摄食量及脂肪重量的影响并利用试剂盒检测不同甲基化果胶对高脂饮食小鼠血清指标的影响；同时利用肝脏石蜡切片来评价不同甲基化果胶对高脂饮食小鼠肝脏脂肪变性的影响，且冷冻切片油红染色技术评价不同甲基化果胶对高脂饮食小鼠肝脏及附睾脂肪脂滴大小的影响、16s测序技术探讨不同甲基化对高脂饮食小鼠肠道微生物的影响及气相色谱法测定不同甲基化果胶对高脂小鼠肠道内容物及粪便短链脂肪酸含量的测定，发现了不同甲基化果胶通过调节肠道微生物和代谢产物能够预防和治疗肥胖，特别是甲基化度为35％且酰胺化度为15％的果胶在预防肥胖的作用上有较好效果。
附图说明
图1为各组小鼠在干预期体重和摄食能量变化及处死时附睾脂肪、皮下脂肪、肾周脂肪、棕色脂肪的重量，其中图A为干预期体重变化；图B为干预期摄食量变化情况；图C为处死时体重；图D为处死时摄食总能量；图E为处死时附睾脂肪重量；图F为处死时皮下脂肪重量；图G为处死时肾周脂肪重量；图H为处死时棕色脂肪重量，与Control组相比*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，与HFD组相比#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001。
图2为各组小鼠干预期血清相关指数，其中图A为甘油三酯；图B为总胆固醇；图C为低密度脂蛋白胆固醇；图D为高密度脂蛋白胆固醇；图E为葡萄糖；图F为胰岛素；图G为胆碱酯酶；图H为白介素4；图I为白介素6，与Control组相比*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，与HFD组相比#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001。
图3为各组小鼠附睾脂肪组织冰冻切片油红染色情况。
图4为各组小鼠粪便及肠道内容物微生物菌门组成情况，其中，Cw1为第一周对照组粪便；Cw6为第六周对照组粪便；Cw12为第十二周对照组粪便；HW1为第一周高脂组粪便；Hw6为第六周高脂组粪便；Hw12为第十二周高脂组粪便；P1w1为第一周P1组粪便；P1w6为第六周P1组粪便；P1w12为第十二周P1组粪便；P2w1为第一周P2组粪便；P2w6为第六周P2组粪便；P2w12为第十二周P2组粪便；P3w1为第一周P3组粪便；P3w6为第六周P3组粪便；P3w12为第十二周P3组粪便；P4w1为第一周P4组粪便；P4w6为第六周P4组粪便；P4w12为第十二周P4组粪便；Cc为对照组盲肠内容物；Hc为高脂组盲肠内容物；P1c为P1组盲肠内容物；P2c为P2组盲肠内容物；P3c为P3组盲肠内容物；P4c为P4组盲肠内容物；Cz为对照组结肠内容物；Hz为高脂组结肠内容物；P1z为P1组结肠内容物；P2z为P2组结肠内容物；P3z为P3组结肠内容物；P4z为P4组结肠内容物。
图5为各组小鼠粪便及肠道内容物微生物菌属组成情况，其中，Cw1为第一周对照组粪便；Cw6为第六周对照组粪便；Cw12为第十二周对照组粪便；HW1为第一周高脂组粪便；Hw6为第六周高脂组粪便；Hw12为第十二周高脂组粪便；P1w1为第一周P1组粪便；P1w6为第六周P1组粪便；P1w12为第十二周P1组粪便；P2w1为第一周P2组粪便；P2w6为第六周P2组粪便；P2w12为第十二周P2组粪便；P3w1为第一周P3组粪便；P3w6为第六周P3组粪便；P3w12为第十二周P3组粪便；P4w1为第一周P4组粪便；P4w6为第六周P4组粪便；P4w12为第十二周P4组粪便；Cc为对照组盲肠内容物；Hc为高脂组盲肠内容物；P1c为P1组盲肠内容物；P2c为P2组盲肠内容物；P3c为P3组盲肠内容物；P4c为P4组盲肠内容物；Cz为对照组结肠内容物；Hz为高脂组结肠内容物；P1z为P1组结肠内容物；P2z为P2组结肠内容物；P3z为P3组结肠内容物；P4z为P4组结肠内容物。
图6为各组小鼠粪便及肠道拟杆菌属(Bacteroides)与嗜黏蛋白阿克曼氏菌属(Akkermansia)情况，其中，图A为不同时间粪便拟杆菌属含量；图B为盲肠拟杆菌属含量；图C为结肠拟杆菌属含量；图D为不同时间粪便嗜黏蛋白阿克曼氏菌属含量；图E为盲肠嗜黏蛋白阿克曼氏菌属含量；图F为结肠嗜黏蛋白阿克曼氏菌属含量；Cc为对照组盲肠内容物；Hc为高脂组盲肠内容物；P1c为P1组盲肠内容物；P2c为P2组盲肠内容物；P3c为P3组盲肠内容物；P4c为P4组盲肠内容物；Cz为对照组结肠内容物；Hz为高脂组结肠内容物；P1z为P1组结肠内容物；P2z为P2组结肠内容物；P3z为P3组结肠内容物；P4z为P4组结肠内容物，(粪便)(肠道内容物)与Control组相比*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，与HFD组相比#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001。
图7为小鼠盲肠短链脂肪酸含量A：乙酸；B：丙酸；C：丁酸；D：异丁酸；E：戊酸；F：异戊酸。(x±s，n＝8)与Control组相比*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，与HFD组相比#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加简洁明了，本发明将用以下具体实施例进行阐明，但本发明绝非仅限于这些实施例。以下实施例仅为本发明较优选的实施例，且仅用于阐述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的实质和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
实施例
1.材料和方法
1.1实验动物
6周龄C57BL/6J小鼠，雄性，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，共计48只，体重在16–20g范围内。
1.2受试品
本发明实施例采用不同甲基化和酰胺化程度的果胶，具体型号和甲基化及酰胺化程度见下表1。
表1不同甲基化和酰胺化程度的果胶种类
| 果胶种类 | 甲基化度(％) | 酰胺化度(％) |
| LM-101 AS | 35 | 15 |
| LM-104 AS | 27 | 20 |
| LM-05 CS | 8 | 0 |
| 121 SLOW SET | 58 | 0 |
1.3饲料配方
本发明在喂养小鼠过程中采用D12450H普通饲料和D12451高脂饲料，均购自江苏美迪森生物医药有限公司，其中D12450H普通饲料和D12451高脂饲料的成分见下表2和表3。果胶组是将D12451高脂饲料中的50g纤维素替换为35g果胶，即得到果胶含量为4％(w/w)的饲料即可。
表2 D12450H普通饲料的成分表
表3 D12451高脂饲料的成分表
| Product#D12451 | 重量百分比(％) | 能量百分比(％) |
| 蛋白 | 24 | 20 |
| 碳水化合物 | 41 | 35 |
| 脂肪 | 24 | 45 |
| 合计 | 100 | |
| 千卡/克 | 4.73 | |
| 原料 | 重量(克) | 能量(kcal) |
| 酪蛋白,30目 | 200 | 800 |
| L-胱氨酸 | 3 | 12 |
| 玉米淀粉 | 72.8 | 291 |
| 麦芽糖糊精 | 100 | 400 |
| 蔗糖 | 172.8 | 691.2 |
| 纤维素 | 50 | 0 |
| 大豆油 | 25 | 225 |
| 猪油 | 177.5 | 1598 |
| 混合矿物质 | 10 | 0 |
| 磷酸氢钙 | 13 | 0 |
| 碳酸钙 | 5.5 | 0 |
| 柠檬酸钾 | 16.5 | 0 |
| 混合维生素 | 10 | 40 |
| 酒石酸胆碱 | 2 | 0 |
| FD&C红色40号 | 0.05 | 0 |
| 合计 | 858.15 | 4057 |
1.4实验仪器
本发明实施例所采用的主要仪器见下表4。
表4实验过程中采用的仪器信息
| 仪器名称 | 仪器公司 |
| RE-52旋转蒸发器 | 广州市艾安得仪器有限公司 |
| 电子分析天平 | 德国Satorius公司 |
| 三用紫外分析仪 | Agilent公司 |
| 酶标仪 | Bio Tek |
| 气相色谱仪 | 岛津公司 |
| Mili—QB超纯水器 | MiliPore公司 |
| 低速离心机 | 金坛市富华仪器 |
| 超低温冰箱 | 日本SANYO |
| 超净工作台 | 苏州净化设备公司 |
| 烘箱 | 精宏仪器公司 |
| 倒置显微镜 | 日本，Olympus Corporation |
| 涡旋震荡器 | 美国SI Vortex-Genie |
| Shake | 上海思伯明 |
1.5实验试剂
本发明实施例所采用的主要试剂见下表5。
表5实验过程中采用的试剂信息
1.6所用的主要溶液的配制
0.1M HCL溶液：量取盐酸溶液4.23mL，加超纯水定容至500mL。
内标液配置：将0.1g 2-ethylbutyric acid溶于0.1M HCL溶液，定容至100mL。
标准溶液配置：取5mL0.1M HCL溶液于10mL离心管中，将离心管立于微量天平上，称取乙酸≈100mg、丙酸≈80mg、丁酸≈80mg、异丁酸≈20mg、戊酸≈40mg、异戊酸≈20mg、己酸≈40mg，容量瓶定容至50mL，该溶液为母液。分别取适量母液稀释1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍。
戊巴比妥溶液：精密称取1g戊巴比妥溶于50mL生理盐水。
油红O溶液配置：油红O染液的配制：油红O粉末1g溶于100ml异丙醇，使用时以油红O饱和液一份加蒸馏水两份，过滤后使用。
2.实验过程
2.1具体实验过程
所有小鼠统一条件喂养D12450H普通饲料7日，期间自由饮食饮水。随后将小鼠随机分为6组，分别为：
(1)正常对照组：饲喂D12450H普通饲料，计作control；
(2)高脂饮食组：饲喂高脂D12451饲料，计作HFD；
(3)LM-101AS果胶组：饲喂高脂D12451+4％LM-101AS果胶饲料，计作P1；
(4)LM-104AS果胶组：饲喂高脂D12451+4％LM-104AS果胶饲料,计作P2；
(5)LM-05CS果胶组：饲喂高脂D12451+4％LM-05CS果胶饲料，计作P3；
(6)121slow set果胶：组饲喂高脂D12451+4％121slow set果胶饲料，计作P4。
所有小鼠置于室温25℃和相对湿度60％条件下喂养，每日光照12h，各组自由进食饮水，干预十二周后禁食不禁水12h，恢复饮食3h处理小鼠，具体处理为：小鼠称重；量体长；摘眼球取血，离心分离血清；剖取肝脏，肾脏，脾脏，皮下脂肪，附睾脂肪，肾周脂肪和棕色脂肪并分别称重；将肝脏和附睾脂肪切分成两份，一份放入4％多聚甲醛固定进行石蜡切片，一份放入包埋剂速冻进行冰冻切片，其余组织负80度保存；同时剖取小肠，盲肠，结肠，取盲肠内容物，结肠内容物-80℃条件下保存，小肠和结肠组织放入4％多聚甲醛固定进行石蜡切片。
2.2数据获取过程及采取的指标
所有数据均采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，均数±标准差表示，P<0.05为具有统计学差异。
2.2.1体重、脂肪重量、摄食情况及Lee’指数测定
实验过程中每周记录两次动物体重，纪录一周摄食量。实验终点称量小鼠体重，测量体长(鼻尖至肛门外沿的距离)，计算肥胖指数(即Lee’s指数，Lee’s指数＝[体重(g)*10/体长(cm)])。并在实验终点精确分离(皮下、双侧附睾、双侧肾周围，棕色)脂肪组织，称湿重。
2.2.2粪便样品收集
收集每周各组小鼠当天粪便，每组0.5g，随后置于1.5ml试管中并在－80℃条件下保存。
2.2.3肝脏及脂肪组织冰冻切片
通过冰冻切片观察脂肪组织细胞大小并通过油红O染色观察肝脏脂滴大小，具体过程为：取新鲜肝脏及脂肪组织，送至中国农业大学进行冰冻切片及油红染色，然后使用BDS400倒置显微镜系统且每组小鼠10倍物镜拍摄照片，分析脂肪组织切片细胞大小情况。
2.2.4血脂测定
按照试剂盒说明书操作，测定血清中总胆固醇、甘油三酯、胰岛素、胆碱基酶、葡萄糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、白介素-4和白介素-6的含量。
2.2.5肠道微生物测序
收集小鼠第一周、第六周和第十二周粪便及十二周盲肠内容物和结肠内容物，并于干冰条件下送往广州基迪奥生物有限公司进行16SrDNA测序。
从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区，其中引物序列为：341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT。然后PCR扩增产物切胶回收并，用QuantiFluorTM荧光计进行定量。随后将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，并Hiseq2500PE250上机测序。
2.2.6短链脂肪酸测定
采用气相色谱测定盲肠内容物及结肠内容物的短链脂肪酸含量。具体过程为：
称取150mg小鼠肠道内容物或粪便于2mL离心管中，并分别放入2粒玻璃珠，且加入0.4mL0.1M HCl和0.2mL内标液(1.0mg/mL的2-乙基丁酸的0.1M HCl溶液)，在混匀震荡后加入1mL甲基叔丁基醚，再次震荡后低温离心。随后用注射器吸取0.5mL过滤后置于进样小瓶内置管内。之后加入标准溶液0.4mL和0.2mL内标液，并于混匀震荡后加入1mL甲基叔丁基醚，再次震荡后低温离心。随后用注射器吸取0.5mL过滤后置于进样小瓶内置管内。
1.空白试验：吸取1ml甲基叔丁基醚于气相色谱瓶，加盖，进样测定。
2.精密度试验：吸取标准溶液1X 0.4mL和0.2mL内标液，混匀震荡后加入1mL甲基叔丁基醚，再次震荡后低温离心。随后用注射器吸取0.5mL过滤后置于进样小瓶内置管内，气相色谱进样测定。重复3次，计算3次平均值，相对标准偏差。
3.线性范围：吸取标准溶液0.4mL和0.2mL内标液，混匀震荡后加入1mL甲基叔丁基醚，再次震荡后低温离心。随后用注射器吸取0.5mL过滤后置于进样小瓶内置管内。气相色谱进样测定。按照进样浓度和出峰面积，作线性回归，得出标准溶液工作曲线。计算相关系数。
4.定量限：标准溶液逐级稀释，作色谱分析，按照色谱峰的信噪比1:10时的浓度作为样品的定量限。
5.准确度：精密称取一定量三个不同浓度标准品溶液溶于0.1M HCl溶液中，混匀震荡后加入1mL甲基叔丁基醚，再次震荡后低温离心。用注射器吸取0.5mL过滤后置于进样小瓶内置管内，并用气相色谱进样测定。外标法测出短链脂肪酸含量，计算回收率。
6.中间精密度：对同一样品三次平行测定，连续三天(三天均用同一个标准品)，有不同人测定。
3、实验结果
3.1各组脏器重量及其体重分数
各组小鼠肝，肾，脾的重量及占体重的百分数示于下表6。观察到空白对照组各脏器重量较HFD组降低明显。从体重分数观察空白对照组与HFD组肝脏差异显著，其余各组脏器系数均没有发生显著差异。
表4各组小鼠肝，肾，脾的重量及其体重分数与Control组相比*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001
3.2各组体重、摄食能量、各部位脂肪重量
各组小鼠体重、摄食能量及附睾脂肪、皮下脂肪、肾周脂肪、棕色脂肪的重量示于下表7。参见图1和表7，在摄食量一致的情况下Control组皮下脂肪，附睾脂肪，肾周脂肪较HFD组减少，产生显著性差异(P<0.001)。control组棕色脂肪较HFD组减少，产生显著性差异(P<0.05)。P1果胶组皮下脂肪，附睾脂肪，肾周脂肪较HFD组减少，其中附睾脂肪及皮下脂肪产生显著性差异(P<0.05)。P2果胶组皮下脂肪，附睾脂肪，肾周脂肪较HFD组减少，其中皮下脂肪产生显著性差异(P<0.01)。P3果胶组皮下脂肪，附睾脂肪，肾周脂肪较HFD组减少。P4果胶组皮下脂肪，较HFD组减少，附睾脂肪，肾周脂肪较HFD组增加。Control组肩胛部棕色脂肪较HFD组减少产生显著差异(P<0.05)。果胶各组肩胛部棕色脂肪较HFD组增加。HFD组体重和脂肪重量方面均较control组增加，结果说明不同甲基化果胶能影响高脂饮食干预小鼠的体重及脂肪重量，并且不同程度甲基化果胶对小鼠的体重和脂肪重量影响各不相同。果胶干预组能有效降低高脂诱导的体重和脂肪重量。P1及P2组果胶效果更明显，P1果胶在降低体重及脂肪重量方面效果最为显著。
表7各组小鼠体重、摄食能量及附睾脂肪、皮下脂肪、肾周脂肪、棕色脂肪的重量，与Control组相比*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，与HFD组相比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001
3.3各组小鼠不同部位脂肪的体重分数及Lee’s指数
各组小鼠不同部位脂肪即附睾脂肪、皮下脂肪、肾周脂肪、棕色脂肪的体重分数和Lee’s指数示于下表8。Control组脂肪分数较HFD组减少产生显著差异(P<0.001)。HFD组Lee’s指数较Control组高产生显著差异(P<0.001)，P1，P2，P3果胶组Lee’s指数较HFD组降低，P4果胶组较HFD组高。Lee’s指数是判断肥胖的重要标准之一，褐色脂肪组织因其产热能力和增加能量消耗，它被认为是潜在的抗肥胖治疗靶点。这一结果说明不同甲基化果胶能影响高脂饮食小鼠各部位脂肪湿重且作用各不相同。P1果胶组和P2果胶组减少白色脂肪重量较为显著，同时增加了棕色脂肪重量进而增加能量消耗。而P4果胶组增加白色脂肪和棕色脂肪重量。
表8各组小鼠不同部位脂肪组织的体重分数及Lee’s指数与Control组相比*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，与HFD组相比#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001
3.4各组小鼠血清相关指数
表9各组小鼠血清相关指数与Control组相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，与HFD组相比#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001
各组小鼠血清相关指数结果示于上表9中。结合图2和表9分析可知：不同甲基化果胶影响高脂饮食小鼠血清中甘油三酯含量。各组间血清低密度脂蛋白胆固醇含量基本一致。HFD组血清葡萄糖浓度较control组，P1，P2，P3果胶组高。P4果胶组较HFD组血清葡萄糖浓度高。P1果胶组较HFD组产生显著差异(P<0.05),P2果胶组较HFD组产生显著差异(P<0.01)。HFD组血清胆碱酯酶活性较control组升高产生显著性差异(P<0.05)。P4果胶组较HFD组升高产生显著差异(P<0.001)。HFD组血清胰岛素含量较control组升高产生显著性差异(P<0.001)。P4果胶组较HFD组升高产生显著差异(P<0.05)。Control组和P1果胶组血清IL-4含量较HFD高，P3，P4果胶组较HFD组降低。P2，P3，P4果胶组血清IL-6含量较HFD组升高，P3果胶组产生显著差异。
3.5各组小鼠肝脏即脂肪组织冰冻切片(油红染色)
由图3可知，HFD组附睾脂肪细胞面积比Control组大，提示高脂饮食提高了附睾脂肪细胞的大小。P1果胶组附睾脂肪细胞面积较HFD组减少，表明P1果胶能降低高脂饮食导致的附睾脂肪细胞大小。
3.6各组小鼠肠道微生物状况
3.6.1各组粪便及肠道内容物微生物丰度及多样性
表10各组小鼠粪便，盲肠内容物，结肠内容物物种丰度及多样性，与HFD组相比*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，与HFD组相比#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001
经分析可知，粪便微生物丰度及多样性与HFD组和control组对比并无产生差异，在结肠内容物中P1果胶物种丰度较HFD组降低并产生显著差异(P<0.05)，表明P1果胶组减少了高脂饮食小鼠结肠内容物微生物丰度。
3.6.2各组小鼠微生物菌门及菌属组成
结合图4和5，经过分析发现，各组小鼠粪便及肠道微生物组成在不同菌门及菌属中均存在差异。各组小鼠微生物在菌门上差异较小，在菌属上差异较大。,对比发现小鼠各周粪便微生物，第一周P1，P4组拟杆菌含量明显较HFD组提高，HFD组拟杆菌含量较Control组降低。可见，膳食干预微生物出现变化的幅度最大的是干预刚开始期间，随着时间推移，逐渐形成较稳定菌群组成，其中高脂饮食降低了拟杆菌含量，经过果胶干预提高了高脂饮食小鼠粪便及肠道微生物拟杆菌的含量。
3.6.3各组小鼠粪便及肠道拟杆菌属(Bacteroides)与嗜黏蛋白阿克曼氏菌属(Akkermansia)含量
由图6可知，在粪便及盲肠内容物中拟杆菌属含量P1果胶组较其余各组高，其余各组含量相近。在粪便，盲肠及结肠内容物中，Control组及P1、P2、P3组嗜黏蛋白阿克曼氏菌属均较HFD组有所提高。这些结果表明果胶能提高与降低肥胖风险的相关菌属含量，不同果胶效果不同。
3.8各组小鼠短链脂肪酸状况
由图7可知，盲肠内容物中P2果胶组乙酸，丁酸，戊酸含量较其余各组高，而盲肠中其余短链脂肪酸在各组间含量相近。证明P2果胶在盲肠中发酵产生较高含量的乙酸，丁酸，戊酸。推测P2果胶的结构在盲肠中能较有效地被微生物利用产生含量更高的短链脂肪酸，从而更利于在盲肠中发挥短链脂肪酸的生理作用。
4.实验结论
不同甲基化和酰胺化程度果胶对高脂饮食小鼠的体重和脂肪重量产生不同的影响，P1，P2果胶能有效降低高脂饮食小鼠体重及脂肪重量，P4果胶能升高高脂饮食小鼠的体重及脂肪重量。同时对高脂饮食小鼠血清指标也产生不同影响：P1果胶能有效降低血清总胆固醇，血清高密度脂蛋白胆固醇及血清葡萄糖；P2果胶有效降低血清总胆固醇，血清葡萄糖，有效升高血清白介素-6；P3果胶有效降低血清总胆固醇；P4果胶有效降低血清总胆固醇，升高血清胆碱基酶，血清胰岛素。另外，不同甲基化和酰胺化程度果胶能影响高脂饮食小鼠附睾脂肪细胞的大小，其中P1果胶能降低高脂饮食小鼠附睾脂肪细胞的大小。另外其对高脂饮食小鼠肠道微生物组成及种类也有所影响，其中P1果胶在微生物组成上与HFD组产生较大的差异，同时增加了高脂饮食小鼠粪便及肠道内容物拟杆菌属及嗜黏蛋白阿克曼氏菌属的含量；还发现P1果胶能提高高脂饮食小鼠粪便中短链脂肪酸的含量。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (9)
1.果胶在制备具有减肥效果的功能性食品中的应用，其特征在于，所述果胶的甲基化度为25-40％。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述果胶的甲基化度为30-40％，更优选35-37％，最优选35％。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述果胶的酰胺化度为10-25％，优选15-20％,更优选为15％。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的对象为哺乳动物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，如果应用对象是人，则当所述人为成人时，所述果胶足以减轻应用对象的体重的量即有效剂量是约每kg为0.2-1.0g，更优选0.3-0.6g，最优选0.4g的果胶的日剂量，而当所述人为儿童时有效剂量是约每kg为0.3-1.5g，更优选0.45-0.9g，最优选0.6g的果胶的日剂量，其中kg为应用对象的体重单位。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肥胖为单纯性肥胖。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述减肥是指降低应用对象体内的白色脂肪积累。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述果胶可以呈现多种食用形态以进行摄入。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述果胶进行甲基化时采用的甲基活性供体是甲醇、碘甲烷、硫酸二甲酯、重氮甲烷等，且进行酰胺化时采用的活性反应物质是氨气、氨水、碳酸铵、醋酸铵等铵盐。
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