CN108732260A - 一种植物油中黄曲霉毒素b1的提取净化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物油中毒素前处理方法，公开一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，植物油样经乙腈溶解，冷冻过夜，取上清液冷冻离心完成净化过程，净化液经衍生处理后上液相色谱仪—荧光检测器进行测定。本发明利用植物油在低温状态会结块这一物理特性，采用低温冰箱冷冻处理提取试样，使植物油和乙腈提取液分离，同时利用密度差异，采用冷冻离心进一步脱除提取液中残留的植物油悬浮颗粒，再次净化提取液。本发明处理技术简单可行，无需要用到国标方法的免疫亲和柱，降低前处理费用，为生产企业减少质量安全控制成本，并达到理想的净化效果。方法重现性良好，低、中、高浓度黄曲霉毒素B1加标回收率均在90％以上。

Description

一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法
技术领域
本发明涉及植物油中毒素前处理方法，尤其涉及一种植物油中黄曲霉毒素 B1的提取净化方法。
背景技术
植物油是人们日常生活中不可或缺的重要食材，有花生油、油茶籽油、玉 米油、大豆油等，其产品质量安全越来越受消费者关注，特别是近年来涉油的 食品安全事件频发，有关部门已高度重视，并制定相应卫生标准，其中黄曲霉 毒素B1便是其重要的卫生指标。
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1简写为AFTB1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍 生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。黄曲霉毒素B1存在于 土壤、各种坚果，特别是花生和核桃中。在食用油、大豆、稻谷、玉米、通心 粉、调味品、牛奶、奶制品等产品中也经常发现黄曲霉毒素。一般以热带和亚 热带等南方高温、高湿地区受污染最为严重，食品中AFTB1的检出率比较高。 AFTB1是已知的化学物质中致癌性最强的一种，对包括人和若干动物具有强烈 的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害，因此必须严格限制其在食品中的含量。中国食品卫生标准(GB 2761-2017)中规定了几种主要易受污染的食物中 AFTB1的允许量标准，玉米、花生、花生油中黄曲霉毒素B1允许量为≤20μ g/kg，其他植物油中限量为10μg/kg。而欧盟等国于2002年对粮食，花生及其 产品中的AFTB1含量进行的修订规定，人类直接使用的花生中AFTB1含量需 ≤2μg/kg，作为食品原料进口的花生AFTB1含量需≤8μg/kg。可见严格控制 质量，及时了解、掌握植物油中AFTB1含量尤为必要。
除油是植物油中AFTB1含量测定的关键点和难点。植物油样品中的脂肪酸、 蛋白质含量极高，但衍生处理前需将提取液中这类物质彻底清除，否则衍生将 无法进行或不彻底导致检测结果偏低。而AFTB1、植物油和极性较强的有机试 剂互溶，以致常规的液液提取难以达到良好的提取效果。目前，植物油中AFTB1 含量测定主要采用的是国际通用的免疫亲和柱净化、液相色谱—荧光检测器检 测法，该法中规定使用的前处理净化方法耗材较为昂贵，一般实验室较难承受， 这给不少科研工作者和生产企业带来困扰。为此，本研究团队发明了一种低成 本、高准确度测定植物油中AFTB1含量的前处理净化方法。
发明内容
本发明针对现有技术中除油需要过柱成本较高的缺点，提供一种植物油中 黄曲霉毒素B1的提取净化方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，包括以下步骤：
A.将植物油样品混合均匀，称取植物油样品加入比色管中；
B.在装有植物油样品的比色管中加入乙腈定容，盖上塞子涡旋混匀 1～5min；
C.将定容后的比色管放入低温冰箱中冷冻，具塞端向上、竖向放置比色管， 冷冻时间为5h～16h；冷冻提取液可以去除其中绝大部分的蛋白质、脂肪，利用 植物油在低温状态会结块这一物理特性，采用低温冰箱冷冻处理提取试样，已 达到植物油和乙腈提取液分离效果。
D.冷冻后取出比色管，得到下层固体与上层冷冻净化提取液，吸取冷冻净 化提取液加入离心管中；
E.将步骤D装有冷冻净化提取液的离心管置于冷冻离心机中冷冻离心后得 到的上清液为沉淀净化提取液；上清液进一步冷冻离心，以去除乙腈提取液中 残留的蛋白质、脂肪，完成净化过程，利用密度差异，采用冷冻离心进一步脱 除提取液中残留的植物油悬浮颗粒，再次净化提取液。
F.取出离心管，吸取2～5ml沉淀净化提取液加入衍生瓶中，氮吹干；
G.在步骤F氮吹干的衍生瓶中加入衍生液，涡旋混匀；
H.将涡旋混匀后的衍生瓶置于35～45℃水浴锅中衍生15～30min后取出氮 吹干；
I.在步骤H氮吹干的衍生瓶中加入乙腈水溶液后涡旋溶解得到进样溶液；
J.进样溶液过微孔滤膜后进入进样瓶中，通过液相色谱检测。
作为优选，步骤A中称取的植物油样品为0.8～1.2gg。
作为优选，步骤B中的比色管中加入乙腈定容至10ml。
作为优选，步骤C中的低温冰箱温度为-40℃～-18℃。
作为优选，步骤E中冷冻离心的转速为4000～6000r/min，离心时间为 10～15min。
作为优选，步骤G中的衍生液包括0.2～1ml正己烷和0.1～0.5ml三氟乙酸， 正己烷的体积为三氟乙酸的体积的2倍。
作为优选，步骤I中乙腈水溶液中乙腈的体积百分比为15％，乙腈水溶液体 积为0.5～1ml。
作为优选，步骤J中微孔滤膜的孔径为0.25～0.45μm。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：本发明利用植物 油在低温状态会结块这一物理特性，采用低温冰箱冷冻处理提取试样，已达到 植物油和乙腈提取液分离效果。同时利用密度差异，采用冷冻离心进一步脱除 提取液中残留的植物油悬浮颗粒，再次净化提取液。本发明处理技术简单可行， 无需要用到国标GB 2761-2017规定的免疫亲和柱，可切实降低实验室运行费用， 为生产企业减少质量安全控制成本，并达到理想的净化效果。方法重现性良好， 低、中、高浓度黄曲霉毒素B1加标回收率均在90％以上。
附图说明
图1为实施例1中油茶籽油中黄曲霉毒素B1检测色谱图。
图2为实施例2中菜籽油中黄曲霉毒素B1检测色谱图。
图3为标样色谱图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种油茶籽油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，包括以下步骤：
A.将油茶籽油样品混合均匀，称取1g油茶籽油样品加入比色管中；
B.在装有油茶籽油样品的比色管中加入乙腈定容至10ml，盖上塞子涡旋混 匀2min；
C.将定容后的比色管放入低温冰箱中-30℃冷冻，具塞端向上、竖向放置比 色管，冷冻时间为10h；
D.冷冻后取出比色管，得到下层固体与上层冷冻净化提取液，吸取冷冻净 化提取液加入离心管中；E.将步骤D装有冷冻净化提取液的离心管置于冷冻离 心机中冷冻离心后得到的上清液为沉淀净化提取液，冷冻离心的转速为 4000r/min，离心时间为10min；
F.取出离心管，吸取2ml沉淀净化提取液加入衍生瓶中，氮吹干；
G.在步骤F氮吹干的衍生瓶中加入0.2ml正己烷和0.1ml三氟乙酸，涡旋 混匀；
H.将涡旋混匀后的衍生瓶置于40℃水浴锅中衍生15min后取出氮吹干；
I.在步骤H氮吹干的衍生瓶中加入体积百分比为15％的乙腈水溶液1ml， 涡旋溶解得到进样溶液；
J.进样溶液过孔径为0.45μm微孔滤膜后进入进样瓶中，通过液相色谱检 测。
实施例2
一种花生油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，包括以下步骤：
A.将花生油样品混合均匀，称取1g花生油样品加入比色管中；
B.在装有花生油样品的比色管中加入乙腈定容至10ml，盖上塞子涡旋混匀 2min；
C.将定容后的比色管放入低温冰箱中-30℃冷冻，具塞端向上、竖向放置比 色管，冷冻时间为10h；
D.冷冻后取出比色管，得到下层固体与上层冷冻净化提取液，吸取冷冻净 化提取液加入离心管中；
E.将步骤D装有冷冻净化提取液的离心管置于冷冻离心机中冷冻离心后得 到的上清液为沉淀净化提取液，冷冻离心的转速为4000r/min，离心时间为 10min；
F.取出离心管，吸取2ml沉淀净化提取液加入衍生瓶中，氮吹干；
G.在步骤F氮吹干的衍生瓶中加入0.2ml正己烷和0.1ml三氟乙酸，涡旋 混匀；
H.将涡旋混匀后的衍生瓶置于40℃水浴锅中衍生15min后取出氮吹干；
I.在步骤H氮吹干的衍生瓶中加入体积百分比为15％的乙腈水溶液1ml， 涡旋溶解得到进样溶液；
J.进样溶液过孔径为0.45μm微孔滤膜后进入进样瓶中，通过液相色谱检 测。
实施例3
一种油茶籽油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，包括以下步骤：
A.将油茶籽油样品混合均匀，称取1.2g油茶籽油样品加入比色管中；
B.在装有油茶籽油样品的比色管中加入乙腈定容至10ml，盖上塞子涡旋混 匀1min；
C.将定容后的比色管放入低温冰箱中-40℃冷冻，具塞端向上、竖向放置比 色管，冷冻时间为5h；
D.冷冻后取出比色管，得到下层固体与上层冷冻净化提取液，吸取冷冻净 化提取液加入离心管中；
E.将步骤D装有冷冻净化提取液的离心管置于冷冻离心机中冷冻离心后得 到的上清液为沉淀净化提取液，冷冻离心的转速为6000r/min，离心时间为 15min；
F.取出离心管，吸取5ml沉淀净化提取液加入衍生瓶中，氮吹干；
G.在步骤F氮吹干的衍生瓶中加入1ml正己烷和0.5ml三氟乙酸，涡旋混 匀；
H.将涡旋混匀后的衍生瓶置于35℃水浴锅中衍生15min后取出氮吹干；
I.在步骤H氮吹干的衍生瓶中加入体积百分比为15％的乙腈水溶液0.5ml， 涡旋溶解得到进样溶液；
J.进样溶液过孔径为0.25μm微孔滤膜后进入进样瓶中，通过液相色谱检 测。
实施例4
一种油茶籽油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，包括以下步骤：
A.将油茶籽油样品混合均匀，称取0.8g油茶籽油样品加入比色管中；
B.在装有油茶籽油样品的比色管中加入乙腈定容至10ml，盖上塞子涡旋混 匀3min；
C.将定容后的比色管放入低温冰箱中-40℃冷冻，具塞端向上、竖向放置比 色管，冷冻时间为5h；
D.冷冻后取出比色管，得到下层固体与上层冷冻净化提取液，吸取冷冻净 化提取液加入离心管中；
E.将步骤D装有冷冻净化提取液的离心管置于冷冻离心机中冷冻离心后得 到的上清液为沉淀净化提取液，冷冻离心的转速为5000r/min，离心时间为 13min；
F.取出离心管，吸取4ml沉淀净化提取液加入衍生瓶中，氮吹干；
G.在步骤F氮吹干的衍生瓶中加入0.6ml正己烷和0.3ml三氟乙酸，涡旋 混匀；
H.将涡旋混匀后的衍生瓶置于45℃水浴锅中衍生30min后取出氮吹干；
I.在步骤H氮吹干的衍生瓶中加入体积百分比为15％的乙腈水溶液1ml， 涡旋溶解得到进样溶液；
J.进样溶液过孔径为0.45μm微孔滤膜后进入进样瓶中，通过液相色谱检 测。
实施例5
将各个实施例得到的进样瓶中的溶液通过液相色谱仪—荧光检测器检测， 液相色谱仪—荧光检测器色谱条件：
A)流动相：A相：水，B相：乙腈；
B)梯度洗脱：0～6.00min，15％～30％B；6min～9min，30％～35％B；9min～14min，35％B；14min～16min，35％～30％B；16min～18min，30％～15％B；
C)色谱柱：C18柱(150cm×4.6mm，5.0μm)；
D)流速：1.0mL/min；
E)柱温：40℃；
F)进样体积：20μL
G)检测波长：激发波长360nm，发射波长440nm；
实施例1色谱图参照图1，标样图参照图3。
经检测，实施例1样品中黄曲霉毒素B1含量为5.7mg/kg。
实施例2色谱图参照图2，标样图参照图3。
经检测，实施例2样品中黄曲霉毒素B1含量为2.6mg/kg。
实施例3、实施例4色谱图结果与图1相似，标样图参照图3，样品中黄曲 霉毒素B1含量与实施例1相近。
经过反复的检测发现，本发明使用的前处理方法重现性良好，相对标准偏 差在3％以内，低、中、高浓度黄曲霉毒素B1加标回收率均在90％以上。 总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均 等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (8)

1.一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将植物油样品混合均匀，称取植物油样品加入比色管中；
B.在装有植物油样品的比色管中加入乙腈定容，盖上塞子涡旋混匀1～5min；
C.将定容后的比色管放入低温冰箱中冷冻，具塞端向上、竖向放置比色管，冷冻时间为5h～16h；
D.冷冻后取出比色管，得到下层固体与上层冷冻净化提取液，吸取冷冻净化提取液加入离心管中；
E.将步骤D装有冷冻净化提取液的离心管置于冷冻离心机中冷冻离心后得到的上清液为沉淀净化提取液；
F.取出离心管，吸取2～5ml沉淀净化提取液加入衍生瓶中，氮吹干；
G.在步骤F氮吹干的衍生瓶中加入衍生液，涡旋混匀；
H.将涡旋混匀后的衍生瓶置于35～45℃水浴锅中衍生15～30min后取出氮吹干；
I.在步骤H氮吹干的衍生瓶中加入乙腈水溶液后涡旋溶解得到进样溶液；
J.进样溶液过微孔滤膜后进入进样瓶中，通过液相色谱检测。
2.根据权利要求1所述的一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，其特征在于：步骤A中称取的植物油样品为0.8～1.2g。
3.根据权利要求1所述的一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，其特征在于：步骤B中的比色管中加入乙腈定容至10ml。
4.根据权利要求1所述的一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，其特征在于：步骤C中的低温冰箱温度为-40℃～-18℃。
5.根据权利要求1所述的一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，其特征在于：步骤E中冷冻离心的转速为4000～6000r/min，离心时间为10～15min。
6.根据权利要求1所述的一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，其特征在于：步骤G中的衍生液包括0.2～1ml正己烷和0.1～0.5ml三氟乙酸，正己烷的体积为三氟乙酸的体积的2倍。
7.根据权利要求1所述的一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，其特征在于：步骤I中乙腈水溶液中乙腈的体积百分比为15％，乙腈水溶液体积为0.5～1ml。
8.根据权利要求1所述的一种植物油中黄曲霉毒素B1的提取净化方法，其特征在于：步骤J中微孔滤膜的孔径为0.25～0.45μm。
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