CN108728435A - 一种毛干样本裂解和dna提取纯化方法及系统 - Google Patents
一种毛干样本裂解和dna提取纯化方法及系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108728435A CN108728435A CN201810923911.XA CN201810923911A CN108728435A CN 108728435 A CN108728435 A CN 108728435A CN 201810923911 A CN201810923911 A CN 201810923911A CN 108728435 A CN108728435 A CN 108728435A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hair shaft
- reaction chamber
- shaft sample
- sample
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004919 hair shaft Anatomy 0.000 title claims abstract description 99
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000005336 cracking Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 130
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 71
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 44
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 30
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 13
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 45
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 16
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 13
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 9
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 claims description 7
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 claims description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 6
- RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 claims description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 claims 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 13
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 5
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 3
- 238000005213 imbibition Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- YTBSYETUWUMLBZ-QWWZWVQMSA-N D-threose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)C=O YTBSYETUWUMLBZ-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003116 impacting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- -1 salt ion Chemical class 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种毛干样本裂解和DNA提取纯化方法及系统。所述方法包括：使毛干样品于液氮环境中静置，之后加入裂解液对其进行裂解处理，获得毛干样品裂解液，之后将其与异硫氰酸胍溶液混合均匀，并使混合液进入密闭的反应腔室中，在负压作用下，使所述反应腔室中的液体被抽吸除去，之后在密封状态下，使冲洗液进入反应腔室进行冲洗，并使冲洗液被抽吸除去；以及，使洗脱液进入反应腔室进行洗脱，并使洗脱液被抽吸并收集，获得毛干样本的DNA分子。本发明的方法操作简单高效，在毛干样本裂解过程中在1小时内便可快速完全消化毛干样本，缩短毛干样本裂解消化和DNA提取纯化时间，且可避免杂质对实验结果的影响，提高实验结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取纯化DNA的方法，特别涉及一种快速便捷高效的毛干样本快速裂解和DNA提取纯化方法，以及相应的系统，属于DNA提取技术领域。
背景技术
随着法医检测技术的不断进步，犯罪现场的DNA生物物证已经成为案件侦破的利器，但近几年犯罪嫌疑人的反侦察意识逐步提高，一些常见的生物物证如血液、血斑、唾液等常常被犯罪嫌人清理消除，而一些微量生物物证如毛干样本，由于其易遗留、体积小、不易被发现等特点往往被犯罪嫌疑人忽略而遗留在犯罪现场，如果能成功从毛干样本中提取到DNA并加以分析利用，就能为案件的侦破提供关键线索。但毛干样本中的DNA属于极微量生物物证，对于这类生物物证检验的难点主要在于两方面，一方面样本在化学试剂中反应时间过长极易导致DNA的降解；另一方面在实验操作过程中样本极易被外源性DNA污染或发生样本间的交叉污染，因此这就要求实验员在实验过程必须尽量缩短样本在化学试剂中的反应时间，同时操作时必须仔细谨慎防止污染。毛干样本用于法医DNA分型主要分为四个步骤：1.毛干样本的裂解；2.DNA的提取纯化；3.DNA的扩增；4.STR分型分析。在第一个步骤毛干样本的裂解过程中，由于毛干的结构组成不同于常规生物材料，含有大量的角蛋白，因此毛干样本的裂解消化主要是对角蛋白的降解。现有的裂解消化方式主要为化学方法：加入缓冲液和消化液在蛋白酶K和二硫苏糖醇溶液环境中进行消化反应，需要在56℃条件下消化8小时以上甚至消化过夜，由于蛋白酶K和二硫苏糖醇溶液在反应过程中随着时间推移反应效率会大大降低，因此实验人员在反应过程中需定时观察反应进程多次补加蛋白酶K及二硫苏糖醇溶液(每次各加入20ul)，这种消化方式一方面造成了试剂和时间的大量浪费，增加了实验成本，且多次开盖补加试剂极易导致外源性DNA的污染和样本间的交叉污染；另一方面长时间消化反应极易导致DNA被裂解消化所用的化学试剂降解，同时这种消化方式在反应完成后大大降低了样本DNA在反应体系中的浓度，且在试管底部会遗留有大量固体颗粒杂质沉淀，严重影响实验的进一步操作，对实验结果的准确性产生不利影响。在第二个步骤DNA提取纯化过程中，主要原理是在高浓度盐离子存在条件下，DNA分子吸附在硅膜上，之后用冲洗液将盐离子去除后，DNA分子从硅膜上脱落进入洗脱液中从而便于收集。现有的手动操作方式过程繁琐，实验员将样本加入试管后需手动对每个试管多次进行开盖、吸液、加液、闭盖等操作，一方面这种操作方式极易导致样本被外源性DNA污染或发生样本间的交叉污染，且耗费大量的人力和时间，在操作熟练的情况下处理一份样本需30min左右；另一方面实验过程中用到的冲洗液和洗脱液反复长期暴露于空气中易被外源性DNA污染或发生pH值的改变从而影响实验结果。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种毛干样本裂解和DNA提取纯化方法，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供前述方法所使用的毛干样本裂解和DNA提取纯化系统。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种毛干样本裂解和DNA提取纯化方法，其包括：
提供毛干样品；
使所述毛干样品于液氮环境中静置，之后加入裂解液对所述毛干样本进行裂解处理，获得毛干样品裂解液；其中，所述裂解液包含：缓冲液、十二烷基硫酸钠、蛋白酶K和二硫苏糖醇溶液，所述裂解处理的温度为50～60℃，时间在60min以下；
将所述毛干样品裂解液与异硫氰酸胍溶液混合均匀，形成混合液，使所述混合液进入至少一密闭的反应腔室中，并在负压作用下，使所述反应腔室中的液体从反应腔室中被抽吸除去，之后在密封状态下，使冲洗液进入所述反应腔室进行冲洗，之后使冲洗液从反应腔室中被抽吸除去；以及，
在密封状态下，使洗脱液进入所述反应腔室进行洗脱，之后使洗脱液从反应腔室中被抽吸并收集，获得毛干样本的DNA分子。
本发明实施例还提供了一种毛干样本裂解和DNA提取纯化系统，其应用于前述方法中，其包括毛干样本裂解机构和DNA提取纯化机构，其中，所述DNA提取纯化机构包括：
一个以上的反应单元，每个所述反应单元包括一反应腔室，所述反应腔室内设置有能够吸附DNA分子的吸附机构；
一个以上的冲洗液供给单元，其与每个所述反应单元相互连通且密封设置，至少用以提供冲洗液；
一个以上的洗脱液供给单元，其与每个所述反应单元相互连通且密封设置，至少用以提供洗脱液；
负压提供单元，其与每个所述反应单元的底端相互连通且密封设置，至少用以使所述反应单元的反应腔室内处于负压状态。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供的毛干样本裂解和DNA提取纯化方法同时使用物理和化学方式，在毛干样本整个消化过程中只需一次性加入少量试剂就可在40分钟至1小时内完全消化毛干样本，并在消化完成后试管底部没有杂质残留，不仅缩短了毛干样本裂解消化和DNA提取纯化时间，有效防止DNA降解，且防止冲洗液和洗脱液被污染和变质，避免了杂质对实验结果的影响，提高了实验结果的准确性，提高实验效率，减少了人力、时间和试剂的消耗，大大降低了实验成本；
2)本发明可提高反应完成后样本DNA在体系中的浓度，避免长时间消化反应导致DNA降解及固体颗粒杂质沉淀对实验结果的影响，同时避免外源性DNA污染及样本间交叉污染，防止反应试剂变质；
3)本发明提供的毛干样本裂解和DNA提取纯化方法在DNA提取纯化过程中一次性可同时处理多份样本，初学者也可30min内完成12份样本的提取纯化，且实验员在加入样本后无需进行开盖、吸液、加液、闭盖等繁琐的手动操作，可有效避免样本被外源性DNA污染和发生样本间的交叉污染，且操作快速简便高效，大大减少了提取过程所需时间，同时该方法配备的冲洗液和洗脱液始终处于密封状态，可有效避免试剂被外源性DNA污染和发生变质，从而保证实验结果的准确性。
附图说明
图1是本发明一典型实施例中一种毛干样本裂解和DNA提取纯化系统中DNA提取纯化机构的结构示意图。
图2-图3分别是本发明一典型实施例中对待检测的毛干样本进行裂解处理的过程示意图。
附图标记说明：100-反应单元，11-反应腔室，12-加样入口，13-硅胶膜，14-反应室通道，15-底端管口，200-冲洗液供给单元，21-冲洗液通道，22、23-第一阀门，300-洗脱液供给单元，31-第二阀门。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术存在的诸多缺陷，为了缩短毛干样本裂解和DNA提取纯化时间，避免样本被外源性DNA污染和发生样本间的交叉污染，防止冲洗液和洗脱液被污染和变质，节省人力和时间，提高实验效率，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，发明了一种快速便捷高效的毛干样本裂解和DNA提取纯化方法。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供了一种毛干样本裂解和DNA提取纯化方法，其包括：
提供毛干样品；
使所述毛干样品于液氮环境中静置，之后加入裂解液对所述毛干样本进行裂解处理，获得毛干样品裂解液；其中，所述裂解液包含：缓冲液、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K和二硫苏糖醇溶液，所述裂解处理的温度为50～60℃，时间在60min以下；
将所述毛干样品裂解液与异硫氰酸胍溶液混合均匀，形成混合液，使所述混合液进入至少一密闭的反应腔室中，并在负压作用下，使所述反应腔室中的液体从反应腔室中被抽吸除去，之后在密封状态下，使冲洗液进入所述反应腔室进行冲洗，之后使冲洗液从反应腔室中被抽吸除去；以及，
在密封状态下，使洗脱液进入所述反应腔室进行洗脱，之后使洗脱液从反应腔室中被抽吸并收集，获得毛干样本的DNA分子。
进一步地，本发明液氮环境的低温可以使毛干样本易于断裂破碎。
在一些实施方案中，所述的方法还包括：对所述毛干样品进行预处理。
进一步地，所述预处理包括：将所述毛干样品洗净，并剪成长度为1～10cm的毛干样本片段。
在一些实施方案中，所述方法具体包括：将所述毛干样品加入液氮中静置5～10min，之后加入裂解液，并置于超声波震荡仪或细胞破碎匀质仪中震荡20～40s，之后，再置于震荡金属浴上加热至50～60℃，使所述毛干样本完全消化。
进一步地，所述裂解液中蛋白酶K的浓度为10～20mg/mL。
进一步地，所述裂解液中二硫苏糖醇溶液的浓度为0.5～2mol/L。
进一步地，所述缓冲液包括pH值为7.0～9.0的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)。
在一些实施方案中，所述反应腔室内设置有能够吸附DNA分子的吸附机构，例如，所述吸附机构可以是硅胶膜，但不限于此。
进一步地，本发明的异硫氰酸胍溶液可以使核酸吸附在硅胶膜等吸附机构上。
进一步地，容置所述冲洗液的腔体和/或容置所述洗脱液的腔体与所述反应腔室相互连通，且密封设置。
其中，在一些更为具体的实施案例之中，所述毛干样本裂解和DNA提取纯化方法可以包括以下步骤：
1.毛干样本裂解：将毛干样本放入1.5mL离心管或其他容器中，在常压下加入液氮(LN2)没过毛干样本，静置5～10min，根据毛干程度的不同，在离心管中加入60μL pH值为7.0～9.0的Tris-HCl、15μL SDS、10μL蛋白酶K(10～20mg/mL)和10μL二硫苏糖醇溶液(0.5～2mol/L)，置于超声波震荡仪或细胞破碎匀质仪中震荡20～40s，待试管内无肉眼明显可见的毛干片段后将试管置于震荡金属浴上50～60℃加热至样本完全消化(60min内可完全消化)。
2.DNA的提取纯化：
消化完成后在同一试管中加入2倍体积的异硫氰酸胍溶液混匀，打开加样孔孔盖，从加样入口中将混合液全部加入反应室，室温静置10min后在底端管口处负压抽吸，至反应腔室中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体。打开第一阀门，使冲洗液充满各反应腔室，关闭第一阀门，室温静置1min，在底端管口处负压抽吸，至反应腔室中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体。打开第一阀门，使冲洗液充满各反应腔室，关闭前一第一阀门，室温静置30s，在底端管口处负压抽吸，至反应腔室中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体。将装置置于室温中静置5min，在底端管口处负压抽吸，至各反应腔室通道内残留液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体。打开第二阀门，将洗脱液加入反应腔室内，室温静置10min，在底端管口处负压抽吸，至反应腔室中液体完全吸出，关闭负压抽吸，收集液体，于4℃保存备用(若需长时间保存应置于-20℃条件下)。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种毛干样本裂解和DNA提取纯化系统，其应用于前述方法中，其包括毛干样本裂解机构和DNA提取纯化机构，其中，所述DNA提取纯化机构包括：
一个以上的反应单元，每个所述反应单元包括一反应腔室，所述反应腔室内设置有能够吸附DNA分子的吸附机构；
一个以上的冲洗液供给单元，其与每个所述反应单元相互连通且密封设置，至少用以提供冲洗液；
一个以上的洗脱液供给单元，其与每个所述反应单元相互连通且密封设置，至少用以提供洗脱液；
负压提供单元，其与每个所述反应单元的底端相互连通且密封设置，至少用以使所述反应单元的反应腔室内处于负压状态。
在一些实施方案中，所述反应腔室具有一加样入口，其至少用以使毛干样品裂解液与异硫氰酸胍溶液形成的混合液进入反应腔室。
进一步地，所述加样入口外部设置有盖体。
进一步地，所述吸附机构可以是硅胶膜等能够吸附DNA分子的物质，但不限于此。
更进一步地，所述吸附机构设置于所述反应腔室的底端。
在一些实施方案中，每个所述反应单元的底端都设置有一与所述反应腔室连通的反应室通道，所述反应室通道末端开设有底端管口。
进一步地，所述底端管口与所述负压提供单元连通。
在一些实施方案中，所述冲洗液供给单元与所述反应单元的反应腔室之间设置有冲洗液通道。
进一步地，所述冲洗液通道上设置有第一阀门。
在一些实施方案中，所述洗脱液供给单元与所述反应单元的反应腔室之间设置有洗脱液通道。
进一步地，所述洗脱液通道上设置有第二阀门。
在一些实施方案中，所述系统还包括收集单元，至少用以收集每个所述反应单元的洗脱液，进而收集DNA分子。
进一步地，所述反应腔室内还设置有一些用于固定所述吸附机构的固定装置。
进一步地，所述反应腔室内还设置有防溢机构，至少用于防止反应腔室内的液体溢出，导致样品的损失或浪费，避免对实验的准确性造成影响。
进一步地，所述负压提供单元末端还连接有保护装置。
藉由上述技术方案，本发明提供的毛干样本裂解和DNA提取纯化方法同时使用物理和化学方式，在毛干样本整个消化过程中只需一次性加入少量试剂就可在40分钟至1小时内完全消化毛干样本，并在消化完成后试管底部没有杂质残留，不仅缩短了毛干样本裂解消化和DNA提取纯化时间，有效防止DNA降解，且防止冲洗液和洗脱液被污染和变质，避免了杂质对实验结果的影响，提高了实验结果的准确性，提高实验效率，减少了人力、时间和试剂的消耗，大大降低了实验成本。
并且，本发明提供的毛干样本裂解和DNA提取纯化方法在DNA提取纯化过程中一次性可同时处理多份样本，初学者也可30min内完成12份样本的提取纯化，且实验员在加入样本后无需进行开盖、吸液、加液、闭盖等繁琐的手动操作，可有效避免样本被外源性DNA污染和发生样本间的交叉污染，且操作快速简便高效，大大减少了提取过程所需时间，同时该方法配备的冲洗液和洗脱液始终处于密封状态，可有效避免试剂被外源性DNA污染和发生变质，从而保证实验结果的准确性。
下面将结合附图及典型案例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。
本实施例中的一种毛干样本裂解和DNA提取纯化系统包括毛干样本裂解机构和DNA提取纯化机构，其中，所述DNA提取纯化机构的结构示意图请参阅图1所示。
所述DNA提取纯化机构包括一个以上的反应单元100、一个以上的冲洗液供给单元200(本实施例中设置两个)、一个以上的洗脱液供给单元300，以及负压提供单元(图中未标识出)。
每个所述反应单元100包括一反应腔室11，所述反应腔室内设置有能够吸附DNA分子的吸附机构，本实施例中采用硅胶膜13，但不限于此，其设置于所述反应腔室的底端，并且，优选在所述反应腔室内还设置用于固定所述吸附装置的固定装置。
每个所述反应单元100的底端都设置有一与所述反应腔室连通的反应室通道14，所述反应室通道14末端开设有底端管口15。
负压提供单元与每个所述反应单元的底端管口15相互连通且密封设置，至少用以使所述反应单元的反应腔室11内处于负压状态。进一步地，所述负压提供单元末端还连接有保护装置。
如图1所示，所述冲洗液供给单元200与每个所述反应单元100相互连通且密封设置，至少用以提供冲洗液。所述冲洗液供给单元200与所述反应单元100的反应腔室11之间设置有冲洗液通道21。其中，所述冲洗液通道21上设置有第一阀门22和23。
所述洗脱液供给单元300与每个所述反应单元100相互连通且密封设置，至少用以提供洗脱液。所述洗脱液供给单元300与所述反应单元100的反应腔室11之间设置有洗脱液通道。其中，所述洗脱液通道上设置有第二阀门31。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
实施例1
本实施例采用毛干样本裂解和DNA提取纯化系统对待检测的毛干样品进行裂解和DNA提取纯化方法的具体步骤包括：
一、毛干样本裂解
1.将洗净的毛干样本放入1.5ML离心管中，在常压下加入液氮(LN2)没过毛干样本，静置8min后在离心管中加入60μL pH8.0的Tris-HCl、15μL SDS、10μL蛋白酶K(15mg/mL)和10μL二硫苏糖醇溶液(1mol/L)，置于超声波震荡仪中震荡30s后置于震荡金属浴上56℃消化，如图2所示。
2.置于震荡金属浴上56℃震荡消化45min后试管内已无固体可见物，消化过程完成，如图3所示。
二、DNA提取纯化
(1)消化完成后在同一试管中加入2倍体积的异硫氰酸胍溶液混匀，得到反应混合液，打开加样入口12(亦可称为加样孔)孔盖，将反应混合液加入反应腔室11；
(2)室温静置10min；
(3)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(4)打开第一阀门22，使冲洗液供给单元(亦可称为试剂瓶1)中的冲洗液充满各反应腔室11；
(5)关闭第一阀门22，室温静置1min；
(6)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(7)打开第一阀门23，使冲洗液供给单元(亦可称为试剂瓶2)中的冲洗液充满各反应腔室11；
(8)关闭第一阀门23，室温静置30s；
(9)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(10)室温静置5min，在底端管口15处负压抽吸，至反应室通道14内残留液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(11)打开洗脱液供给单元300(亦可称为试剂管)的第二阀门31，将洗脱液加入反应腔室11；
(12)室温静置10min；
(13)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，收集液体于4℃保存备用(若需长时间保存应置于-20℃条件下)。
实施例2
本实施例采用毛干样本裂解和DNA提取纯化系统对待检测的毛干样品进行裂解和DNA提取纯化方法的具体步骤包括：
一、毛干样本裂解
1.将洗净的毛干样本放入1.5ML离心管中，在常压下加入液氮(LN2)没过毛干样本，静置5min后在离心管中加入80μL pH9.0的Tris-HCl、20μL SDS、13μL蛋白酶K(20mg/mL)和13μL二硫苏糖醇溶液(0.5mol/L)，置于超声波震荡仪中震荡40s后置于震荡金属浴上60℃消化，如图2所示。
2.置于震荡金属浴上60℃震荡消化30min后试管内已无固体可见物，消化过程完成，如图3所示。
二、DNA提取纯化
(1)消化完成后在同一试管中加入2倍体积的异硫氰酸胍溶液混匀，得到反应混合液，打开加样入口12(亦可称为加样孔)孔盖，将反应混合液加入反应腔室11；
(2)室温静置10min；
(3)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(4)打开第一阀门22，使冲洗液供给单元(亦可称为试剂瓶1)中的冲洗液充满各反应腔室11；
(5)关闭第一阀门22，室温静置1min；
(6)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(7)打开第一阀门23，使冲洗液供给单元(亦可称为试剂瓶2)中的冲洗液充满各反应腔室11；
(8)关闭第一阀门23，室温静置30s；
(9)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(10)室温静置5min，在底端管口15处负压抽吸，至反应室通道14内残留液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(11)打开洗脱液供给单元300(亦可称为试剂管)的第二阀门31，将洗脱液加入反应腔室11；
(12)室温静置10min；
(13)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，收集液体于4℃保存备用(若需长时间保存应置于-20℃条件下)。
实施例3
本实施例采用毛干样本裂解和DNA提取纯化系统对待检测的毛干样品进行裂解和DNA提取纯化方法的具体步骤包括：
一、毛干样本裂解
1.将洗净的毛干样本放入1.5ML离心管中，在常压下加入液氮(LN2)没过毛干样本，静置10min后在离心管中加入40μL pH7.0的Tris-HCl、10μL SDS、6μL蛋白酶K(10mg/mL)和6μL二硫苏糖醇溶液(2mol/L)，置于超声波震荡仪中震荡20s后置于震荡金属浴上50℃消化，如图2所示。
2.置于震荡金属浴上50℃震荡消化60min后试管内已无固体可见物，消化过程完成，如图3所示。
二、DNA提取纯化
(1)消化完成后在同一试管中加入2倍体积的异硫氰酸胍溶液混匀，得到反应混合液，打开加样入口12(亦可称为加样孔)孔盖，将反应混合液加入反应腔室11；
(2)室温静置10min；
(3)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(4)打开第一阀门22，使冲洗液供给单元(亦可称为试剂瓶1)中的冲洗液充满各反应腔室11；
(5)关闭第一阀门22，室温静置1min；
(6)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(7)打开第一阀门23，使冲洗液供给单元(亦可称为试剂瓶2)中的冲洗液充满各反应腔室11；
(8)关闭第一阀门23，室温静置30s；
(9)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(10)室温静置5min，在底端管口15处负压抽吸，至反应室通道14内残留液体完全吸出，关闭负压抽吸，弃掉液体；
(11)打开洗脱液供给单元300(亦可称为试剂管)的第二阀门31，将洗脱液加入反应腔室11；
(12)室温静置10min；
(13)在底端管口15处负压抽吸，至反应腔室11中液体完全吸出，关闭负压抽吸，收集液体于4℃保存备用(若需长时间保存应置于-20℃条件下)。
藉由上述技术方案，本发明的方法操作简单高效，在毛干样本裂解过程中在1小时内便可快速完全消化毛干样本，缩短毛干样本裂解消化和DNA提取纯化时间，且可避免杂质对实验结果的影响，提高实验结果的准确性。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种毛干样本裂解和DNA提取纯化方法，其特征在于包括：
提供毛干样品；
使所述毛干样品于液氮环境中静置，之后加入裂解液对所述毛干样本进行裂解处理，获得毛干样品裂解液；其中，所述裂解液包含：缓冲液、十二烷基硫酸钠、蛋白酶K和二硫苏糖醇溶液，所述裂解处理的温度为50～60℃，时间在60min以下；
将所述毛干样品裂解液与异硫氰酸胍溶液混合均匀，形成混合液，使所述混合液进入至少一密闭的反应腔室中，并在负压作用下，使所述反应腔室中的液体从反应腔室中被抽吸除去，之后在密封状态下，使冲洗液进入所述反应腔室进行冲洗，之后使冲洗液从反应腔室中被抽吸除去；以及，
在密封状态下，使洗脱液进入所述反应腔室进行洗脱，之后使洗脱液从反应腔室中被抽吸并收集，获得毛干样本的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括：对所述毛干样品进行预处理；优选的，所述预处理包括：将所述毛干样品洗净，并剪成长度为1～10cm的毛干样本片段。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体包括：将所述毛干样品加入液氮中静置5～10min，之后加入裂解液，并置于超声波震荡仪或细胞破碎匀质仪中震荡20～40s，之后，再置于震荡金属浴上加热至50～60℃，使所述毛干样本完全消化；
和/或，所述裂解液中蛋白酶K的浓度为10～20mg/mL；
和/或，所述裂解液中二硫苏糖醇溶液的浓度为0.5～2mol/L；
和/或，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷；优选的，所述缓冲液的pH值为7.0～9.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应腔室内设置有能够吸附DNA分子的吸附机构；优选的，所述吸附机构包括硅胶膜。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：容置所述冲洗液的腔体和/或容置所述洗脱液的腔体与所述反应腔室相互连通，且密封设置。
6.一种毛干样本裂解和DNA提取纯化系统，其应用于权利要求1-5中任一项所述方法中，其特征在于包括毛干样本裂解机构和DNA提取纯化机构，其中，所述DNA提取纯化机构包括：
一个以上的反应单元，每个所述反应单元包括一反应腔室，所述反应腔室内设置有能够吸附DNA分子的吸附机构；
一个以上的冲洗液供给单元，其与每个所述反应单元相互连通且密封设置，至少用以提供冲洗液；
一个以上的洗脱液供给单元，其与每个所述反应单元相互连通且密封设置，至少用以提供洗脱液；
负压提供单元，其与每个所述反应单元的底端相互连通且密封设置，至少用以使所述反应单元的反应腔室内处于负压状态。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于：所述反应腔室具有一加样入口，其至少用以使毛干样品裂解液与异硫氰酸胍溶液形成的混合液进入反应腔室。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于：所述吸附机构包括硅胶膜；优选的，所述吸附机构设置于所述反应腔室的底端。
9.根据权利要求6所述的系统，其特征在于：每个所述反应单元的底端都设置有一与所述反应腔室连通的反应室通道，所述反应室通道末端开设有底端管口；优选的，所述底端管口与所述负压提供单元连通。
10.根据权利要求6所述的系统，其特征在于：所述冲洗液供给单元与所述反应单元的反应腔室之间设置有冲洗液通道；优选的，所述冲洗液通道上设置有第一阀门；
和/或，所述洗脱液供给单元与所述反应单元的反应腔室之间设置有洗脱液通道；优选的，所述洗脱液通道上设置有第二阀门；
和/或，所述系统还包括收集单元，至少用以收集每个所述反应单元的洗脱液，进而收集DNA分子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810923911.XA CN108728435A (zh) | 2018-08-14 | 2018-08-14 | 一种毛干样本裂解和dna提取纯化方法及系统 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810923911.XA CN108728435A (zh) | 2018-08-14 | 2018-08-14 | 一种毛干样本裂解和dna提取纯化方法及系统 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108728435A true CN108728435A (zh) | 2018-11-02 |
Family
ID=63942867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810923911.XA Pending CN108728435A (zh) | 2018-08-14 | 2018-08-14 | 一种毛干样本裂解和dna提取纯化方法及系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108728435A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990002179A1 (en) * | 1988-08-31 | 1990-03-08 | Lifecodes Corporation | Method for the isolation of dna |
| US20080214793A1 (en) * | 2007-03-01 | 2008-09-04 | Takuro Yamamoto | Method for extracting a biosubstance from hair and hair sampling device useful in the method |
| CN101492486A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-07-29 | 中南大学 | 从福尔马林固定的毛发干内抽提dna的方法 |
| CN101508716A (zh) * | 2009-03-24 | 2009-08-19 | 中南大学 | 一种毛发干裂解液 |
| US20100285578A1 (en) * | 2009-02-03 | 2010-11-11 | Network Biosystems, Inc. | Nucleic Acid Purification |
| WO2017069563A1 (ko) * | 2015-10-22 | 2017-04-27 | 울산과학기술원 | 핵산 정제 장치 및 핵산 정제 방법 |
| CN208933389U (zh) * | 2018-08-14 | 2019-06-04 | 苏州博睿义达生物科技有限公司 | 一种毛干样本裂解和dna提取纯化系统 |
-
2018
- 2018-08-14 CN CN201810923911.XA patent/CN108728435A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990002179A1 (en) * | 1988-08-31 | 1990-03-08 | Lifecodes Corporation | Method for the isolation of dna |
| US20080214793A1 (en) * | 2007-03-01 | 2008-09-04 | Takuro Yamamoto | Method for extracting a biosubstance from hair and hair sampling device useful in the method |
| US20100285578A1 (en) * | 2009-02-03 | 2010-11-11 | Network Biosystems, Inc. | Nucleic Acid Purification |
| CN101492486A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-07-29 | 中南大学 | 从福尔马林固定的毛发干内抽提dna的方法 |
| CN101508716A (zh) * | 2009-03-24 | 2009-08-19 | 中南大学 | 一种毛发干裂解液 |
| WO2017069563A1 (ko) * | 2015-10-22 | 2017-04-27 | 울산과학기술원 | 핵산 정제 장치 및 핵산 정제 방법 |
| CN208933389U (zh) * | 2018-08-14 | 2019-06-04 | 苏州博睿义达生物科技有限公司 | 一种毛干样本裂解和dna提取纯化系统 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7217513B2 (en) | Apparatus and method for isolating a nucleic acid from a sample | |
| RU2654666C2 (ru) | Система и способ сбора образца нуклеиновой кислоты | |
| CN1980738A (zh) | 用于收集、储存和运输生物样本的设备和方法 | |
| CN1950520A (zh) | 用干试剂分离dna的方法和装置 | |
| CN108342463B (zh) | 一种免于核酸纯化的基因检测试剂盒 | |
| CN201476980U (zh) | 样本采集化验的装置 | |
| CN109385418A (zh) | 一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂 | |
| JP2010528643A5 (zh) | ||
| CA2820355A1 (en) | Methods for the isolation, accumulation, characterization and/or identification of microorganisms using a filtration and sample transfer device | |
| US11999936B2 (en) | Extraction system and method for extracting microorganisms contained in a sample | |
| CN112557364B (zh) | 一种智能室内空气质量病毒检测系统及检测方法 | |
| US20180201922A1 (en) | Method for separating nucleic acid from specimen containing nucleic acid and device therefor | |
| JP4792590B2 (ja) | きわめて大量の試料から分析用試料を調製する濾過手段の使用方法 | |
| CN114164084A (zh) | 一种采样检测一体化检测管结构 | |
| NO316686B1 (no) | Fremgangsmate for, og innretning til, binding av et biologisk materiale til en fast fase, samt kombinasjon av et hult formlegeme og en probeholder | |
| CN208933389U (zh) | 一种毛干样本裂解和dna提取纯化系统 | |
| US20080213819A1 (en) | Device for Preparing a Body Fluid for a Bacteriological Analysis | |
| CN112179736A (zh) | 痰液微生物检测生物安全采集处理器及其操作方法 | |
| CN109852610B (zh) | 一步洗涤磁珠法唾液dna提取试剂盒 | |
| CN108728435A (zh) | 一种毛干样本裂解和dna提取纯化方法及系统 | |
| CN113916618A (zh) | 一种在线式病毒监测预警装置 | |
| Pal et al. | Reverse aqua regia: a new method for extraction of diatoms from human tissue | |
| CN116083418A (zh) | 一种磁珠型核酸提取试剂盒及提取核酸的方法 | |
| CN207567223U (zh) | 一种用于非纯微生物样本中微生物分离的装置 | |
| JP2022186879A (ja) | 微生物検査キット、微生物検査方法及び微生物検査装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |