CN108721629A - 一种抗肿瘤药物组合物及其应用包含铁离子的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含(i)包含铁离子的试剂(ii)ROS诱导剂或其药学上可接受的盐的组合的药物组合物及其治疗肿瘤中的应用。本发明所述药物组合物可引起肿瘤细胞焦亡，抑制肿瘤的生长与转移，可以作为治疗肿瘤的候选药物。

Description

一种抗肿瘤药物组合物及其应用包含铁离子的试剂
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤药物组合物，治疗肿瘤的方法，以及铁离子和/或ROS诱导剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术
铁死亡(Ferroptosis)是2012年Dixo等[Dixon S J,Lemberg K M,Lamprecht MR,et al.Ferroptosis:aniron-dependent form of nonapoptotic cell death.Cell,2012,149(5):1060-1072]新提出的一种由铁依赖的氧化损伤引起的细胞死亡模式，在形态学、生物化学和遗传学等方面与凋亡、坏死和自噬有较大区别。凋亡典型的特征包括细胞皱缩、核浓缩、染色质边集、DNA降解、膜起泡、核和胞浆断裂成凋亡小体，后被邻近的细胞吞噬和降解。坏死的形态学特征是细胞和细胞器肿胀、膜破裂、核染色体溶解而不是固缩，线粒体受损，随后细胞溶解。自噬典型的特征为细胞内出现大量泡状结构，即双层膜结构的自吞噬泡，吞噬泡内为胞质及细胞器，高尔基器、核糖体、内质网等均先于核的改变而被降解，但细胞骨架成分却大部分保存。而铁死亡的特征为线粒体嵴消失及膜密度增加，同时表现为细胞质以及脂质活性氧自由基增多。
铁死亡主要是由铁依赖的氧化损伤引起，涉及一系列复杂的生化反应、基因表达和信号传导。Dixon等最早发现这种细胞死亡模式与小分子诱导的RAS肿瘤细胞死亡有关。铁死亡已被证实存在于多种肿瘤细胞中并调控着其生长、侵袭和化疗耐药，如肺癌细胞、宫颈癌细胞、纤维肉瘤细胞、骨肉瘤细胞、前列腺癌细胞、淋巴瘤细胞、肾癌细胞等。铁死亡诱导剂Sorafenib(多吉美)也被应用于治疗晚期肾细胞癌和晚期肝细胞癌的临床用药中。而铁死亡诱导剂的发现对深入研究铁死亡通路的生化机制，探讨其在不同疾病模型中的作用，对相关疾病治疗靶点的确证以及治疗药物的研究具有重要意义。
活性氧(reactive oxy gen species,ROS)是体内一类氧的单电子还原产物,，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2％的氧生成的，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2原产物、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(原产物羟以及一氧化氮等。体内的活性氧并不总是有害的，它对机体也有有利的一面。例如，机体内吞噬细胞在细胞膜受到刺激时，通过呼吸暴发机制，产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS是吞噬细胞发挥吞噬和杀伤作用的主要介质。但是在病理条件下，由于活性氧的产生和清除失去了正常平衡，常常会造成活性氧对人体的损伤。许多化学药物如抗癌剂、抗生素、杀虫剂、麻醉剂、芳香烃类等都可以诱导产生活性氧。高压氧也可以诱导活性氧的产生。
细胞焦亡又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡是由Gasdermin家族蛋白介导的细胞程序性坏死。
细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于半胱天冬酶-1(Caspase-1)，并伴有大量促炎症因子的释放。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。研究表明，细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病、动脉粥样硬化性疾病、癌症等的发生发展，并发挥重要作用，对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用，为临床防治提供新思路。
黑色素瘤(melanoma)是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的以高侵袭和高转移为显著特征的恶性肿瘤。皮肤黑素瘤表现为色素性皮损在数月或数年中发生明显改变。虽其发病率较低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高。近年来，黑色素瘤已经渐渐成为威胁人类健康的一种常见恶性肿瘤，特别是在西方国家。早期的黑色素瘤一般可以通过手术切除的方式得以治愈，但晚期黑色素瘤恶性程度极高，会发生淋巴道及血液转移，治疗预后效果差，致死率高，俗称为“癌中之王”。50-80％的黑色素瘤由于癌基因B-RAF或N-RAS突变获得持续性激活而具有很强的增殖和转移能力。此外，由于凋亡相关基因基因组水平和表达水平的改变导致黑色素瘤对放化疗引起的细胞凋亡极不敏感。
达卡巴嗪(Dacarbazine，DTIC)是美国FDA批准的为数不多可用于治疗晚期黑色素瘤的细胞毒药物，但其有效率仅为7.5％-12.2％，无进展生存期(PFS)不到2个月。2011年又有2种治疗黑色素瘤的药物被美国FDA批准用于临床。一是专门针对黑色素瘤B-RAF V600E突变的抑制剂Vemurafenib，它较传统的达卡巴嗪标准化疗的有效率提高了近10倍，但对非B-RAF V600E突变的黑色素瘤(占黑色素瘤患者的50％)治疗效果不佳。另一种是靶向免疫治疗的药物Ipilimumab，虽具有广谱的适用范围，但较达卡巴嗪标准化疗的有效率仅提高2倍。还有当前备受瞩目的新一类PD-1抗癌免疫疗法，它利用人体自身的免疫系统抵御癌症，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路诱导癌细胞死亡。根据美国相关研究数据显示，PD-1带来的临床抗癌效果显著，它可以控制50％的恶性黑色素瘤病人的疾病进展，但广谱性有一定限制。虽然恶性黑色素瘤的治疗取得了一定的进展，但由于其高死亡率，新研制的药物还存在治疗范围不具广谱性及治疗效果仍不理想等问题，因而，继续寻找和筛选具有更广谱、更高效、且具有特异性的治疗黑色素瘤的候选药物尤其重要。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类新的治疗肿瘤的候选药物，其具有良好的治疗效果。本发明的发明人经过创造性劳动发现，铁离子与ROS诱导剂的组合可以特异性诱导肿瘤细胞的死亡，并且该死亡方式不同于传统的铁死亡机制，也不同于传统的细胞凋亡或者坏死机制，而是一种细胞焦亡的模式，本发明进一步研究发现本发明的组合可以通过Gasdermin家族蛋白GSDME介导的细胞死亡机制来诱导细胞焦亡。
在一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含(i)铁离子和(i i)ROS诱导剂，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，任选地，所述铁离子可以是二价或者三价离子。
根据前述任一方面，所述组合物诱导肿瘤细胞焦亡。
根据前述任一方面，所述药物组合物抑制肿瘤细胞生长。
根据前述任一方面，所述组合物抑制肿瘤的生长。
根据前述任一方面，所述组合物抑制肿瘤的转移。
根据前述任一方面，所述组合物还可以与其他肿瘤抑制剂联合使用。
在一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括(i)包含铁离子的试剂，(ii)包含ROS诱导剂的试剂。
根据前述任一方面，本发明提供一种诱导肿瘤细胞焦亡的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的本发明组合物接触。
根据前述任一方面，本发明提供一种诱导肿瘤细胞焦亡的方法，所述方法包括使细胞与(i)包含有效量的铁离子的试剂和(ii)包含有效量的ROS诱导剂的试剂接触，所述试剂可以是同时或者序贯地与所述细胞接触。
根据前述任一方面，本发明提供一种预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的本发明的药物组合物，所述试剂可以是同时或序贯地施用(i)包含有效量的铁离子的试剂和(ii)包含有效量的ROS诱导剂的试剂，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述的肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
根据前述任一方面，本发明提供一种抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括细胞同时或序贯地与(i)包含有效量的铁离子的试剂和(i i)包含有效量的ROS诱导剂的试剂接触，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
根据前述任一方面，本发明提供了包含铁离子的试剂在制备用于诱导肿瘤细胞焦亡的药物中的用途，其特征在于，该药物诱导肿瘤细胞焦亡的作用不被铁死亡抑制剂所抑制，任选地，所述药物被Caspase广泛抑制剂抑制。根据前述任一方面，本发明提供了包含铁离子的试剂用于制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途，其特征在于，该药物抑制肿瘤细胞生长的作用不被铁死亡抑制剂所抑制，任选地，所述药物被Caspase广泛抑制剂抑制。
根据前述任一方面，本发明还提供了包含铁离子的试剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，所述药物包含铁离子和ROS诱导剂，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
根据前述任一方面，本发明提供了包含铁离子的试剂在制备用于抑制肿瘤细胞转移的药物中的用途，所述药物包含铁离子和ROS诱导剂，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
根据前述任一方面，本发明提供了包含ROS诱导剂的试剂在制备用于诱导肿瘤细胞焦亡的药物中的用途，其特征在于，该药物诱导肿瘤细胞焦亡的作用不被铁死亡抑制剂所抑制。
根据前述任一方面，本发明提供了包含ROS诱导剂的试剂用于制备能够抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途，其特征在于，该药物抑制肿瘤细胞生长的作用不被铁死亡抑制剂所抑制，任选地，所述药物被Caspase广泛抑制剂抑制。
根据前述任一方面，本发明提供了包含ROS诱导剂的试剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，所述药物还包含铁离子，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
根据前述任一方面，发明提供了包含ROS诱导剂的试剂在制备用于抑制肿瘤细胞转移的药物中的用途，所述药物还包含铁离子，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
根据前述任一方面，所述铁离子可以是以含有铁离子的药学上可接受的盐的形式，所述含有铁离子的药学上可接受的盐选自葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、富马酸亚铁、乳酸亚铁、焦磷酸铁、琥珀酸亚铁、硫酸亚铁、氯化高铁血红素、电解铁、铁卟啉、还原铁、枸橼酸铁铵、右旋糖酐铁、山梨醇铁和蔗糖铁。
根据前述任一方面，所述ROS诱导剂选自羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide3-chlorophenylhydrazone，CCCP)、柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)，丁硫氨酸亚砜亚胺(Buthionine-sulfoximine，BSO)、利尿酸(Ethacrynic acid，EA)、BAY-87-2243、Ezatiostat(TLK199)、苯基乙基异硫代氰酸酯(Phenylethyl isothiocyanate，PEITC)、伊美克、拉帕醌、2-Methoxyestradiol、三氧化二砷、伊利司莫、衣霉素、NOV-002、Motexafingadolinium、ATN-224在内的ROS诱导剂或其药学上可接受的盐中的至少一种。
根据前述任一方面，所述药物组合物，其包含(i)包含铁离子的试剂，所述包含铁离子的试剂选自硫酸亚铁(FeSO4)、琥珀酸亚铁(Ferrous Succinate)、右旋糖酐铁(IronDextran)、柠檬酸铁铵(Ammonium ferric citrate)及其他药学上可接受的包含铁离子的试剂中的至少一种和(ii)ROS诱导剂，所述ROS诱导剂选自羰基氰化物间氯苯腙(Carbonylcyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)、柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)、丁硫氨酸亚砜亚胺(Buthionine-sulfoximine，BSO)、利尿酸(Ethacrynic acid，EA)、BAY-87-2243、Ezatiostat(TLK199)、苯基乙基异硫代氰酸酯(Phenylethyl isothiocyanate，PEITC)、伊美克、拉帕醌、2-Methoxyestradiol、三氧化二砷、伊利司莫、衣霉素、NOV-002、Motexafingadolinium、ATN-224或其药学上可接受的盐中的至少一种。
根据前述任一方面，所述药物组合物或试剂包含FeSO4与CCCP，或FeSO4与SSZ，或FeSO4与BSO，或FeSO4与EA，或FeSO4与BAY，或FeSO4与TLK199，或FeSO4与PEITC，或右旋糖酐铁与柳氮磺吡啶。
附图说明
图1本发明所述的药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonylcyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物诱导人源恶性黑色素瘤细胞发生肿胀，细胞膜破裂，发生细胞焦亡。
图2本发明所述的药物组合物FeSO4与CCCP组合物处理人黑色素瘤A375细胞后，GSDME蛋白发生切割，诱导细胞焦亡的发生。
图3本发明所述的药物组合物FeSO4与CCCP组合物诱导细胞内乳酸脱氢酶的释放。
图4Caspase阻滞剂Z-VAD可以显著地抑制FeSO4与CCCP组合物可诱导的人黑色素瘤细胞的死亡。
图5铁死亡抑制剂不能抑制FeSO4与CCCP组合物诱导的人黑色素瘤细胞的死亡。
图6本发明药物组合物诱导人源恶性黑色素瘤细胞发生肿胀，细胞膜破裂，发生细胞焦亡。
图7本发明药物组合物处理人黑色素瘤A375细胞后，Gasdermin家族蛋白的GSDME蛋白发生切割，诱导细胞焦亡的发生。
图8本发明药物组合物诱导细胞内乳酸脱氢酶的释放，引起细胞死亡，显著地抑制人黑色素瘤细胞的生长。
图9裸鼠移植瘤实验中本发明组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。左图显示对照组移植瘤和实验组移植瘤的生长曲线。右图显示对照组和实验组的平均肿瘤重量(tumorweight，g)。
图10本发明组合物对体内黑色素瘤转移的抑制作用。
图11本发明组合物不影响小鼠体重。
图12本发明组合物不影响小鼠脾重量。
图13本发明组合物不影响小鼠结肠长度和小肠上皮结构。
具体实施方式
在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含(i)铁离子和(ii)ROS诱导剂，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，任选地，所述铁离子可以是二价或者三价离子。
任选地，所述组合物诱导肿瘤细胞焦亡。
任选地，所述药物组合物抑制肿瘤细胞生长。
任选地，所述组合物抑制肿瘤的生长。
任选地，所述组合物抑制肿瘤的转移。
任选地，所述组合物还可以与其他肿瘤抑制剂联合使用。
在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括(i)包含铁离子的试剂，(ii)包含ROS诱导剂的试剂。
在一个实施方案中，本发明提供一种诱导肿瘤细胞焦亡的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的本发明组合物接触。
在一个实施方案中，本发明提供一种诱导肿瘤细胞焦亡的方法，所述方法包括使细胞与(i)包含有效量的铁离子的试剂和(ii)包含有效量的ROS诱导剂的试剂接触，所述试剂可以是同时或者序贯地与所述细胞接触。
在一个实施方案中，本发明提供一种预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的本发明的药物组合物，所述试剂可以是同时或序贯地施用(i)包含有效量的铁离子的试剂和(ii)包含有效量的ROS诱导剂的试剂，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述的肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括细胞同时或序贯地与(i)包含有效量的铁离子的试剂和(ii)包含有效量的ROS诱导剂的试剂接触，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含铁离子的试剂在制备用于诱导肿瘤细胞焦亡的药物中的用途，其特征在于，该药物诱导肿瘤细胞焦亡的作用不被铁死亡抑制剂所抑制，任选地，所述药物被Caspase广泛抑制剂抑制。
在一个实施方案中，本发明提供了包含铁离子的试剂用于制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途，其特征在于，该药物抑制肿瘤细胞生长的作用不被铁死亡抑制剂所抑制，任选地，所述药物被Caspase广泛抑制剂抑制。
在一个实施方案中，本发明还提供了包含铁离子的试剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，所述药物包含铁离子和ROS诱导剂，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含铁离子的试剂在制备用于抑制肿瘤细胞转移的药物中的用途，所述药物包含铁离子和ROS诱导剂，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含ROS诱导剂的试剂在制备用于诱导肿瘤细胞焦亡的药物中的用途，其特征在于，该药物诱导肿瘤细胞焦亡的作用不被铁死亡抑制剂所抑制。
在一个实施方案中，本发明提供了包含ROS诱导剂的试剂用于制备能够抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途，其特征在于，该药物抑制肿瘤细胞生长的作用不被铁死亡抑制剂所抑制，任选地，所述药物被Caspase广泛抑制剂抑制。
在一个实施方案中，本发明提供了包含ROS诱导剂的试剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，所述药物还包含铁离子，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含ROS诱导剂的试剂在制备用于抑制肿瘤细胞转移的药物中的用途，所述药物还包含铁离子，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
在一个实施方案中，所述铁离子可以是以含有铁离子的药学上可接受的盐的形式，所述含有铁离子的药学上可接受的盐选自葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、富马酸亚铁、乳酸亚铁、焦磷酸铁、琥珀酸亚铁、硫酸亚铁、氯化高铁血红素、电解铁、铁卟啉、还原铁、枸橼酸铁铵、右旋糖酐铁、山梨醇铁和蔗糖铁。
在一个实施方案中，所述ROS诱导剂选自羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide3-chlorophenylhydrazone，CCCP)、柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)，丁硫氨酸亚砜亚胺(Buthionine-sulfoximine，BSO)、利尿酸(Ethacrynic acid，EA)、BAY-87-2243、Ezatiostat(TLK199)、苯基乙基异硫代氰酸酯(Phenylethyl isothiocyanate，PEITC)在内的ROS诱导剂或其药学上可接受的盐中的至少一种。
在一个实施方案中，所述药物组合物，其包含(i)包含铁离子的试剂，所述包含铁离子的试剂选自硫酸亚铁(FeSO4)、琥珀酸亚铁(Ferrous Succinate)、右旋糖酐铁(IronDextran)、柠檬酸铁铵(Ammonium ferric citrate)及其他药学上可接受的包含铁离子的试剂中的至少一种和(ii)ROS诱导剂，所述ROS诱导剂选自羰基氰化物间氯苯腙(Carbonylcyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)、柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)，丁硫氨酸亚砜亚胺(Buthionine-sulfoximine，BSO)、利尿酸(Ethacrynic acid，EA)、BAY-87-2243、Ezatiostat(TLK199)、苯基乙基异硫代氰酸酯(Phenylethyl isothiocyanate，PEITC)在内的ROS诱导剂或其药学上可接受的盐中的至少一种。
在一个实施方案中，本发明所涉及的药物组合还可按本领域已知方法配成肠道或非肠道给药的其它剂型，如片剂、胶囊、粒剂、注射液等。
术语“有效量”是指产生本发明诱导细胞焦亡或抑制肿瘤等技术效果或在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的本发明化合物的量。这样的量通常依若干因素变化，而所述变化是在已知本文提供的描述的普通技术人员能够确定和计算的范围内。这些因素包括，但不限于：特定的个体及其年龄、体重、身高、一般身体状况和医疗经历，所使用的特定化合物，化合物配制于其中的载体，所选择的化合物的施用途径，以及被治疗的病症的性质和严重性。
术语“药物组合物”意指包含式(I)化合物以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或赋形剂，例如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。悬浮剂的实例包括乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶、或这些物质的混合物。通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等，能够确保预防微生物的作用。最好包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，能够使注射剂型延长吸收。适宜的载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、乙醇、多元醇、它们的适宜的混合物、植物油(例如橄榄油)、和注射有机酯例如油酸乙酯。赋形剂的实例包括乳糖、枸橼酸钠、碳酸钙、磷酸二钙。崩解剂的实例包括淀粉、藻酸和一些复合硅酸盐。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石以及高分子量聚乙二醇。
术语“药学上可接受”意指在合理的医疗判断范围内，适用于与人和低等动物细胞接触而没有过度的毒性、刺激性、变应性反应等，且与合理的益处/风险比相应。
术语“药学上可接受的剂型”意指本发明化合物的剂型，包括例如片剂、糖锭剂、散剂、酏剂、糖浆剂、液体制剂(包括混悬剂、喷雾剂、吸入片剂、锭剂、乳剂、溶液剂、颗粒剂、胶囊剂和栓剂)以及用于注射的液体制剂，包括脂质体制剂。一般可在Remington’sPharmaceutical Science，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版中发现配制技术和制剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适载体描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中，这是本领域的标准参考书目，其以引用方式并入本文。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与抗体不相容之外，设想其在组合物中的用途。
如本文所使用，术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
术语“药学上可接受的盐”表示本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐，和碱加成盐。这些盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备。特别是，可以通过独立使纯化的游离碱形式的化合物与适宜的有机或无机酸反应，和将如此形成的盐分离，来制备酸加成盐。由形成药学上可以接受的阴离子的有机酸形成的有机酸加合盐，包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-甘油磷酸盐、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；优选地，所述烷基磺酸盐为甲基磺酸盐或乙基磺酸盐；所述芳基磺酸盐为苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。也可形成合适的无机盐，包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐等。示例性酸加成盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、naphthylate、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐(lactiobionate)、氨基磺酸盐、丙二酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、亚甲基-双-b-羟基萘甲酸盐、龙胆酸盐、异硫代硫酸盐、二对甲苯酰酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐月桂基磺酸盐(quinateslaurylsulphonate)等(参见例如，Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.，66：1-9(1977)和Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，MackPublishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页，据此整体通过引用并入本文)。也可以通过独立进行使纯化的酸形式的化合物与适宜的有机或无机碱反应，和分离如此形成的盐，来制备碱加成盐。碱加成盐包括药学上可接受的金属盐和胺盐。适宜的金属盐包括钠、钾、钙、钡、锌、镁和铝盐。钠和钾盐为优选。适宜的无机碱加成盐是由金属碱制备的，所述金属碱包括氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁和氢氧化锌。适宜的胺碱加成盐是由胺制备的，所述胺具有足够的碱性以形成稳定的盐，并且优选包括由于其药用的低毒性和可接受性而在医药化学中常用的那些胺，所述胺的实例包括氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟基甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵、三乙胺、二苄胺、二苯羟甲胺、脱氢松香胺、N-乙基哌啶、苄胺、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸例如赖氨酸和精氨酸、二环己基胺等。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375焦亡诱导的影响。
实验方法：
采用显微镜拍照技术分析药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonylcyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375焦亡诱导的影响。
实验方法如下：
1.取对数生长期的各种癌细胞株，以4×105细胞/mL密度接种于6孔培养板上；
2.培养过夜后，将培养液更换成含0.5％血清的DMEM，分别用DMSO，CCCP(20μM,溶解在DMSO),FeSO4(100μM,溶解在H2O)，CCCP(20μM)与FeSO4(100μM)组合物处理细胞；
3.24h后，用显微镜观察细胞形态并拍照。照片标尺20微米。
4.细胞发生焦亡的过程中细胞会吸水胀大，之后细胞膜破裂，细胞会呈现一种鼓泡的形态。
试验结果如图1所示：
本发明所述的FeSO4/CCCP组合物相对于DMSO对照组，以及CCCP，FeSO4单独处理组可以明显诱导细胞发生肿胀，细胞膜破裂。表明本发明所述的FeSO4/CCCP组合物能够诱导人源恶性黑色素瘤细胞发生肿胀，细胞膜破裂，发生细胞焦亡。
实施例2
本发明所述的药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375焦亡诱导的影响。
实验方法：
采用免疫印迹分析(Western blotting)方法分析本发明所述物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375焦亡诱导的影响。
实验方法如下：
1.取对数生长期的各种癌细胞株，以4×105细胞/mL密度接种于6孔培养板上；
2.培养过夜后，将培养液更换成含0.5％血清的DMEM，分别用DMSO，CCCP(20μM,溶解在DMSO中),FeSO4(100μM,溶解在H2O中)，CCCP(20μM)与FeSO4(100μM)组合物处理细胞；
3.24h后，进行免疫印迹分析(Western Blot)检测：
1)弃去培养液，以PBS洗一次，经胰酶消化后用含血清的培养液终止。将细胞悬起，吸入离心管中，4℃，1200-1500rpm离心7min，弃上清，细胞团保存于-80℃备用。
2)加入600μL细胞裂解缓冲液A(50mM Tris，pH 7.4，300mM NaCl，1％NP-40，临用前加1mM PMSF和全酶抑制剂Cocktail)，然后用超声波破碎细胞，并于13000rpm，4℃离心30min；
3)将上清吸出，加入等体积的2×Laemmli缓冲液，95℃煮5min，待进行Western-blot检测。
4)蛋白电泳:
取20-40μg蛋白样品，加等体积2×SDS样品缓冲液，95℃煮沸5min，于不连续SDS-PAGE胶中电泳，电压100V，待样品进入分离胶后将电压调为150V。
5)电转移:
电转液于4℃预冷，切好胶后将同样大小的甲醇预处理的PVDF膜以及滤纸浸于电转液中；PVDF膜贴于胶后，两面覆盖滤纸，赶尽气泡，按膜朝正极的顺序装于电转槽中，于-20℃电转(100V，60min)。
6)抗原抗体反应:
①封闭：封闭液室温封闭1h；
②一抗反应：封闭后膜与相应一抗于室温孵育1-3h；
③二抗反应：TBST洗3次，每次5min，之后加入相应的二抗，于室温孵育1-3h。
7)ECL检测:
TBST洗3次，每次10min。ECL的A液和B液以1:1(V/V)混和，于暗室中滴加于膜表面，孵育1min后曝光。
试验结果如图2所示：
本发明所述的FeSO4/CCCP组合物相对于DMSO对照组，以及CCCP，FeSO4单独处理组可以明显诱导Gasdermin家族蛋白GSDME发生切割，释放出其N端具有膜打孔活性的结构域，进而导致细胞胀大直至破裂，诱导细胞焦亡的发生。
实施例3
本发明所述的药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375生长的影响。
实验方法：
采用promega公司细胞毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶的释放分析本发明所述的药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375生长的影响。
实验方法如下：
1.取对数生长期的各种癌细胞株，以4×105细胞/mL密度接种于6孔培养板上；
2.培养过夜后，将培养液更换成含0.5％血清的DMEM，分别用DMSO，CCCP(20μM,溶解在DMSO),FeSO4(100μM,溶解在H2O)，CCCP(20μM)与FeSO4(100μM)组合物处理细胞；
3.24h后，按promega公司细胞毒性检测试剂盒的方法和步骤检测加药处理后细胞外乳酸脱氢酶的含量。
4.细胞凋亡或坏死(包括细胞焦亡)而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。
试验结果如图3所示：
本发明所述的FeSO4/CCCP组合物相对于DMSO对照组，以及CCCP，FeSO4单独处理组可以明显诱导细胞内乳酸脱氢酶的释放，引起细胞死亡。说明本发明所述的几种组合物可以明显诱导人黑色素瘤细胞死亡，抑制其生长。
横坐标代表不同的处理条件，纵坐标代表乳酸脱氢酶释放的比例(LDHrelease,％；该指标代表细胞膜破裂的比例，同时也指示细胞坏死(包括细胞焦亡)的比例)。实验结果表明，本发明所述的FeSO4/CCCP组合物相对于DMSO对照组、FeSO4单独处理组以及CCCP单独处理组，可以明显地诱导细胞内乳酸脱氢酶的释放，引起细胞死亡。说明本发明所述的FeSO4/CCCP组合物可以明显诱导人黑色素瘤细胞死亡。
应用Graphpad prism 6统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验,***表示p<0.001，具差异高度显著性。统计分析表明FeSO4/CCCP组合物可以极为显著地抑制人黑色素瘤细胞的生长(p<0.001)。
实施例4
Caspase阻滞剂Z-VAD对本发明所述的药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物诱导人恶性黑色素瘤细胞株A375乳酸脱氢酶释放的影响。
横坐标代表不同的处理条件，纵坐标代表乳酸脱氢酶释放的比例(LDHrelease,％；该指标代表细胞膜破裂的比例，同时也指示细胞坏死(包括细胞焦亡)的比例)。实验结果表明，Z-VAD可以抑制本发明所述FeSO4/CCCP组合物诱导的人黑色素瘤细胞内乳酸脱氢酶的释放和细胞死亡。说明本发明所述的FeSO4/CCCP组合物诱导人黑色素瘤细胞死亡是依赖于Caspase的。
应用Graphpad prism 6统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验,***表示p<0.001，具差异高度显著性。统计分析表明Caspase阻滞剂Z-VAD可以显著地抑制FeSO4/CCCP组合物可诱导的人黑色素瘤细胞的死亡(p<0.001)。
实验方法：
采用promega公司细胞毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶的释放分析Caspase阻滞剂Z-VAD对本发明所述的药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物诱导人恶性黑色素瘤细胞株A375乳酸脱氢酶释放的影响。
实验方法如下：
1.取对数生长期的各种癌细胞株，以4×105细胞/mL密度接种于6孔培养板上；
2.培养过夜后，将培养液更换成含0.5％血清的DMEM，分别用DMSO，CCCP(20μM,溶于DMSO)与FeSO4(100μM，溶于H2O)组合物，FeSO4/CCCP组合物与Z-VAD(20μM，溶于DMSO)处理细胞；
3.24h后，按promega公司细胞毒性检测试剂盒的方法和步骤检测加药处理后细胞外乳酸脱氢酶的含量。
4.细胞凋亡或坏死(包括细胞焦亡)而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。
试验结果如图4所示：
Caspase阻滞剂Z-VAD可以显著地抑制本发明所述的FeSO4/CCCP组合物诱导的人黑色素瘤细胞内乳酸脱氢酶的释放和细胞死亡。
实施例5
铁死亡抑制剂Fer-1(Ferrostatin-1)、U0126、AZD6244、AZD8330、PD98059对本发明所述的药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物诱导人恶性黑色素瘤细胞株A375乳酸脱氢酶释放的影响。
横坐标代表不同的处理条件，纵坐标代表乳酸脱氢酶释放的比例(LDHrelease,％；该指标代表细胞膜破裂的比例，同时也指示细胞坏死(包括细胞焦亡)的比例)。实验结果表明，上述铁死亡抑制剂不能抑制本发明所述FeSO4/CCCP组合物诱导的人黑色素瘤细胞内乳酸脱氢酶的释放和细胞死亡。说明本发明所述的FeSO4/CCCP组合物诱导人黑色素瘤细胞死亡的方式不是铁死亡。
应用Graphpad prism 6统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验,ns表示p>0.05，没有显著差异。统计分析表明铁死亡抑制剂不能抑制FeSO4/CCCP组合物诱导的人黑色素瘤细胞的死亡(p>0.05)
实验方法：
采用promega公司细胞毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶的释放分析系列铁死亡抑制剂Fer-1、U0126、AZD6244、AZD8330、PD98059对本发明所述的药物组合物FeSO4与羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)组合物诱导人恶性黑色素瘤细胞株A375乳酸脱氢酶释放的影响。
实验方法如下：
1.取对数生长期的各种癌细胞株，以4×105细胞/mL密度接种于6孔培养板上；
2.培养过夜后，将培养液更换成含0.5％血清的DMEM，分别用DMSO，FeSO4(100μM)与CCCP(20μM)组合物，FeSO4/CCCP组合物与铁死亡抑制剂Fer-1(0.5μM,溶于DMSO)或与U0126(20μM,溶于DMSO)或与AZD6244(5μM,溶于DMSO)或与AZD8330(2.5μM,溶于DMSO)或与PD98059(5μM,溶于DMSO)处理细胞；
3.24h后，按promega公司细胞毒性检测试剂盒的方法和步骤检测加药处理后细胞外乳酸脱氢酶的含量。
4.细胞凋亡或坏死(包括细胞焦亡)而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。
试验结果如图5所示：
铁死亡抑制剂Fer-1、U0126、AZD6244、AZD8330、PD98059都不能抑制本发明所述的FeSO4/CCCP组合物诱导的人黑色素瘤细胞内乳酸脱氢酶的释放和细胞死亡。
实施例6
采用显微镜拍照技术分析本发明所述的6种药物组合物FeSO4与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物、FeSO4与丁硫氨酸亚砜亚胺(Buthionine-sulfoximine，BSO)组合物、FeSO4与利尿酸(Ethacrynic acid，EA)组合物、FeSO4与BAY-87-2243(BAY)组合物、FeSO4与Ezatiostat(TLK199)组合物和FeSO4与苯基乙基异硫代氰酸酯(Phenylethylisothiocyanate，PEITC)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375焦亡诱导的影响。
实验方法如下：
1.取对数生长期的各种癌细胞株，以4×105细胞/mL密度接种于6孔培养板上；
2.培养过夜后，将培养液更换成含0.5％血清的DMEM，分别用SSZ(125μM，溶解在DMSO中)、BSO(250μM，溶解在H2O中)、EA(50μM，溶解在DMSO中)、BAY(2.5nM,溶解在DMSO中)、TLK199(20μM，溶解在DMSO中)、PEITC(5μM，溶解在DMSO中)以及FeSO4(100μM，溶解在H2O中)与SSZ(125μM)组合物、FeSO4与BSO(250μM)组合物、FeSO4与EA(50μM)组合物、FeSO4与BAY(2.5nM)组合物、FeSO4与TLK199(20μM)组合物、FeSO4与PEITC(5μM)组合物处理细胞；
3. 24h后(FeSO4与BAY组合物处理36h)，用显微镜观察细胞形态并拍照。照片标尺20微米。
4.细胞发生焦亡的过程中细胞会吸水胀大，之后细胞膜破裂，细胞会呈现一种鼓泡的形态。
试验结果如图6所示：
本发明所述的FeSO4/SSZ、FeSO4/BSO、FeSO4/EA、FeSO4/BAY、FeSO4/TLK199、FeSO4/PEITC组合物相对于SSZ、BSO、EA、BAY、TLK199、PEITC单独处理组可以明显诱导细胞发生肿胀，细胞膜破裂。说明本发明所述的几种组合物可以明显诱导人黑色素瘤细胞发生肿胀，细胞膜破裂，发生细胞焦亡，抑制其生长。
实施例7
采用免疫印迹分析(Western blotting)方法分析本发明所述的6种药物组合物FeSO4与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物、FeSO4与丁硫氨酸亚砜亚胺(Buthionine-sulfoximine，BSO)组合物、FeSO4与利尿酸(Ethacrynic acid，EA)组合物、FeSO4与BAY-87-2243(BAY)组合物、FeSO4与Ezatiostat(TLK199)组合物和FeSO4与苯基乙基异硫代氰酸酯(Phenylethyl isothiocyanate，PEITC)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375焦亡诱导的影响。
实验方法如下：
1.取对数生长期的各种癌细胞株，以4×105细胞/mL密度接种于6孔培养板上；
2.培养过夜后，将培养液更换成含0.5％血清的DMEM，分别用SSZ(125μM，溶解在DMSO)、BSO(250μM，溶解在H2O中)、EA(50μM，溶解在DMSO)、BAY(2.5nM,溶解在DMSO)、TLK199(20μM，溶解在DMSO)、PEITC(5μM，溶解在DMSO)以及FeSO4(100μM,溶解在H2O)与SSZ(125μM)组合物、FeSO4与BSO(250μM)组合物、FeSO4与EA(50μM)组合物、FeSO4与BAY(2.5nM)组合物、FeSO4与TLK199(20μM)组合物、FeSO4与PEITC(5μM)组合物处理细胞；
3.24h后(FeSO4与BAY组合物处理36h)，进行免疫印迹分析(Western Blot)检测：
1)弃去培养液，以PBS洗一次，经胰酶消化后用含血清的培养液终止。将细胞悬起，吸入离心管中，4℃，1200-1500rpm离心7min，弃上清，细胞团保存于-80℃备用。
2)加入600μL细胞裂解液Buffer A(50mM Tris，pH 7.4，300mM NaCl，1％NP-40，临用前加1mM PMSF和全酶抑制剂Cocktail)，然后用超声波破碎细胞，并于13000rpm，4℃离心30min；
3)将上清吸出，加入等体积的2×Laemmli缓冲液，95℃煮5min，待进行Western-blot检测。
4)蛋白电泳:
取20-40μg蛋白样品，加等体积2×SDS样品缓冲液，95℃煮沸5min，于不连续SDS-PAGE胶中电泳，电压100V，待样品进入分离胶后将电压调为150V。
5)电转移:
电转液于4℃预冷，切好胶后将同样大小的甲醇预处理的PVDF膜以及滤纸浸于电转液中；PVDF膜贴于胶后，两面覆盖滤纸，赶尽气泡，按膜朝正极的顺序装于电转槽中，于-20℃电转(100V，60min)。
6)抗原抗体反应:
①封闭：封闭液室温封闭1h；
②一抗反应：封闭后膜与相应一抗于室温孵育1-3h；
③二抗反应：TBST洗3次，每次5min，之后加入相应的二抗，于室温孵育1-3h。
7)ECL检测:
TBST洗3次，每次10min。ECL的A液和B液以1:1(V/V)混和，于暗室中滴加于膜表面，孵育1min后曝光。
试验结果如图7所示：
本发明所述的FeSO4/SSZ、FeSO4/BSO、FeSO4/EA、FeSO4/BAY、FeSO4/TLK199,、FeSO4/PEITC组合物相对于DMSO对照组，以及SSZ、BSO、EA、BAY、TLK199、PEITC单独处理组可以明显诱导Gasdermin家族蛋白GSDME发生切割，释放出其N端具有膜打孔活性的结构域，进而导致细胞胀大直至破裂，诱导细胞焦亡的发生。
实施例8
采用promega公司细胞毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶的释放分析本发明所述的6种药物组合物FeSO4与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物、FeSO4与丁硫氨酸亚砜亚胺(Buthionine-sulfoximine，BSO)组合物、FeSO4与利尿酸(Ethacrynic acid，EA)组合物、FeSO4与BAY-87-2243(BAY)组合物、FeSO4与Ezatiostat(TLK199)组合物和FeSO4与苯基乙基异硫代氰酸酯(Phenylethyl isothiocyanate，PEITC)组合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375生长的影响。
实验方法如下：
1.取对数生长期的各种癌细胞株，以4×105细胞/mL密度接种于6孔培养板上；
2.培养过夜后，将培养液更换成含0.5％血清的DMEM，分别用SSZ(125μM，溶解在DMSO)、BSO(250μM，溶解在H2O中)、EA(50μM，溶解在DMSO)、BAY(2.5nM,溶解在DMSO)、TLK199(20μM，溶解在DMSO)、PEITC(5μM，溶解在DMSO)以及FeSO4(100μM,溶解在H2O)与SSZ(125μM)组合物、FeSO4与BSO(250μM)组合物、FeSO4与EA(50μM)组合物、FeSO4与BAY(2.5nM)组合物、FeSO4与TLK199(20μM)组合物、FeSO4与PEITC(5μM)组合物处理细胞；
3.24h后(FeSO4与BAY组合物处理36h)，按promega公司细胞毒性检测试剂盒的方法和步骤检测加药处理后细胞外乳酸脱氢酶的含量。
4.细胞凋亡或坏死(包括细胞焦亡)而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。。
试验结果如图8所示：
应用Graphpad prism 6统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验,***表示p<0.001，具差异高度显著性。统计分析表明FeSO4/SSZ、FeSO4/BSO、FeSO4/EA、FeSO4/BAY、FeSO4/TLK199、FeSO4/PEITC组合物可以极为显著地抑制人黑色素瘤细胞的生长(p<0.001)。本发明所述的FeSO4/SSZ、FeSO4/BSO、FeSO4/EA、FeSO4/BAY、FeSO4/TLK199,、FeSO4/PEITC组合物相对于DMSO对照组，以及SSZ、BSO、EA、BAY、TLK199、PEITC单独处理组可以明显诱导细胞内乳酸脱氢酶的释放，引起细胞死亡。
实施例9
采用裸鼠移植瘤实验检测右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物对移植瘤生长的抑制作用。
试验方法如下：
将人源黑色素瘤细胞A375重悬于无血清DMEM中，皮下注射裸鼠右侧背部(每只注射0.1mL,约2×106个细胞)。待小鼠形成可触摸的移植瘤后，将其随机分为四组，分别腹腔注射PBS缓冲液(对照组),SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1N NaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(10mg/kg体重/只，稀释于PBS中，简称ID10),SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1N NaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(2mg/kg体重/只，稀释于PBS中，简称ID2)和SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1N NaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(0.2mg/kg体重/只，稀释于PBS中)(实验组)。隔天注射一次。量取移植瘤的大小。2周后断颈处死小鼠，剥离移植瘤，称重。
试验结果如图9所示：
如图9所示，注射SSZ/ID组合物的实验组移植瘤明显小于注射PBS对照组的移植瘤。其中SSZ(50mg/kg体重/只)/ID(2mg/kg体重/只)对移植瘤的抑制效果更为明显。应用Graphpad prism 6软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验，*表示p<0.05，具差异显著性；**表示p<0.01，具差异高度显著性；***表示p<0.001，具差异极其显著性。试验结果表明，SSZ/ID组合物可以抑制裸鼠黑色素移植瘤的生长。
实施例10
采用黑色素瘤细胞转移实验检测右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物对体内黑色素瘤转移的抑制效果。
试验方法如下：
采用裸鼠，待其8周龄、体重18-20g后进行体内肿瘤转移实验。人源黑色素瘤细胞A375(该细胞可以表达绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luciferase))重悬于PBS中，尾静脉注射小鼠(每只注射0.2mL,约1.5×106个细胞)。待细胞注射4天后，将其随机分为三组，分别腹腔注射PBS(对照组)，SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1N NaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(10mg/kg体重/只，稀释于PBS中)和SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1NNaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(2mg/kg体重/只，稀释于PBS中)。每隔一天注射一次。50天后，小鼠腹腔注射3mg的D-luciferin(15mg/mL稀释于PBS)，反应10min后用IVIS@Lumina II system仪(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)检测荧光强度。之后腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，解剖小鼠，对小鼠肺部进行灌注，取小鼠肺进行拍照，肿瘤切片用4％多聚甲醛固定之后做苏木精-伊红染色。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。
试验结果如下：
如图10所示，尾静脉注射的人源黑色素瘤细胞A375能够通过血液循环转移到肺，形成黑色素瘤。相比于对照组，实验组的黑色素瘤明显减少。荧光强度统计实验组明显小于对照组(p<0.01)；肺部的照片和苏木精-伊红染色法也观察到肺中实验组黑色素瘤数目和大小明显小于对照组。应用Graphpad prism 6软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验，*表示p<0.05，具差异显著性。
试验结果如图10所示，表明，右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物可以抑制体内黑色素瘤细胞的转移数量和大小。
实施例11本发明组合物对小鼠体重的影响。
将16只C57BL/6J小鼠其随机分为三组，每组5-6只。分别腹腔注射PBS缓冲液(阴性对照组)、SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1N NaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(2mg/kg体重/只，稀释于PBS中)每隔一天注射一次，在PBS组和SSZ/ID2组注射的9天后开始注射5-FU(阳性对照组，250mg/kg体重/只，溶于PBS缓冲液)，每天注射一次。在PBS组和SSZ/ID2组开始注射14天即5-FU组注射5天后称体重并统计。结果如图11显示腹腔注射本发明所述右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物相对于注射5-FU(250mg/kg)不影响小鼠体重，副作用小。
应用Graphpad prism 6统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验,***表示p<0.001，具差异高度显著性，ns表示p>0.05，没有显著差异。统计分析表明本发明所述右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物不影响小鼠体重。
实施例12本发明组合物对小鼠脾重量的影响。
将16只C57BL/6J小鼠其随机分为三组，每组5-6只。分别腹腔注射PBS缓冲液(阴性对照组)、SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1N NaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(2mg/kg体重/只，稀释于PBS中)每隔一天注射一次，在PBS组和SSZ/ID2组注射的9天后开始注射5-FU(阳性对照组，250mg/kg体重/只，溶于PBS缓冲液)，每天注射一次。在PBS组和SSZ/ID2组开始注射14天即5-FU组注射5天后断颈处死小鼠，分离切除脾脏，用生理盐水进行冲洗，滤纸吸干，称重。结果如图12显示腹腔注射本发明所述右旋糖酐铁(IronDextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物相对于注射5-FU不影响小鼠脾重量，副作用小。
应用Graphpad prism 6统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验,***表示p<0.001，具差异高度显著性，ns表示p>0.05，没有显著差异。统计分析表明本发明所述右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物不影响小鼠脾重量。
实施例13本发明组合物对小鼠肠道的影响。
将16只C57BL/6J小鼠其随机分为三组，每组5-6只。分别腹腔注射PBS缓冲液(阴性对照组)、SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1N NaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(2mg/kg体重/只，稀释于PBS中)每隔一天注射一次，在PBS组和SSZ/ID2组注射的9天后开始注射5-FU(阳性对照组，250mg/kg体重/只，溶于PBS缓冲液)，每天注射一次。在PBS组和SSZ/ID2组开始注射14天即5-FU组注射5天后断颈处死小鼠，分离切出结肠和小肠，用生理盐水进行冲洗，出去脂肪及肠系膜，滤纸吸干，测量并统计结肠长度。
应用Graphpad prism 6统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数±标准误差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验,***表示p<0.001，具差异高度显著性，ns表示p>0.05，没有显著差异。统计分析表明本发明所述右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物不影响小鼠结肠长度。
取小肠组织，用4％多聚甲醛固定，经包埋、苏木精-伊红染色后，对每个样品进行组织学观察并拍摄，分析比较小肠上皮结构。结果显示腹腔注射本发明所述右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物相对于注射5-FU并不会影响小鼠的小肠上皮结构，不会对小鼠造成肠道损伤，副作用小。
实验方法：
将16只C57BL/6J小鼠其随机分为三组，每组5-6只。分别腹腔注射PBS缓冲液(阴性对照组)、SSZ(50mg/kg体重/只，溶于0.1N NaOH溶液再稀释于PBS缓冲液，调节pH至7.2-7.4)/ID(2mg/kg体重/只，稀释于PBS中)每隔一天注射一次，在PBS组和SSZ/ID2组注射的9天后开始注射5-FU(阳性对照组，250mg/kg体重/只，溶于PBS缓冲液)，每天注射一次。在PBS组和SSZ/ID2组开始注射14天即5-FU组注射5天后断颈处死小鼠，分离切出结肠和小肠，用生理盐水进行冲洗，出去脂肪及肠系膜，滤纸吸干，测量并统计结肠长度。
取小肠组织，用4％多聚甲醛固定，经包埋、苏木精-伊红染色后，对每个样品进行组织学观察并拍摄，分析比较小肠上皮结构。
结果如图13显示腹腔注射本发明所述右旋糖酐铁(Iron Dextran，ID)与柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SSZ)组合物相对于注射5-FU并不会影响小鼠的结肠长度和小肠上皮结构，不会对小鼠造成肠道损伤，副作用小。

Claims (10)

1.药物组合物，其包含(i)铁离子和(ii)ROS诱导剂，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，任选地，所述铁离子可以是二价或者三价离子。
2.试剂盒，所述试剂盒包括(i)包含铁离子的试剂，(ii)包含ROS诱导剂的试剂。
3.包含铁离子的试剂在制备用于诱导肿瘤细胞焦亡的药物中的用途，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
4.包含铁离子的试剂在制备用于抑制肿瘤细胞生长或治疗肿瘤的药物中的用途，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
5.包含铁离子的试剂在制备用于抑制肿瘤细胞转移的药物中的用途，优选所述肿瘤细胞是高表达GSDME的肿瘤细胞，最优选所述肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
6.根据权利要求3-5任一项的用途，其特征在于所述药物还包含ROS诱导剂，或者所述药物治疗过程中还包括同时或序贯地施用包含有效量的ROS诱导剂的试剂。
7.根据权利要求1的组合物或权利要求2的试剂盒或权利要求3-6的用途，所述铁离子以药学上可接受的盐的形式存在，所述药学上可接受的盐选自葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、富马酸亚铁、乳酸亚铁、焦磷酸铁、琥珀酸亚铁、硫酸亚铁、氯化高铁血红素、电解铁、铁卟啉、还原铁、枸橼酸铁铵、右旋糖酐铁、山梨醇铁和蔗糖铁中的至少一种。
8.根据前述权利要求任一项的组合物或试剂盒或用途，所述ROS诱导剂选自羰基氰化物间氯苯腙、柳氮磺吡啶、丁硫氨酸亚砜亚胺、利尿酸、BAY-87-2243、Ezatiostat、苯基乙基异硫代氰酸酯、伊美克、拉帕醌、2-Methoxyestradiol、三氧化二砷、伊利司莫、衣霉素、NOV-002、Motexafin gadolinium、ATN-224或其药学上可接受的盐中的至少一种。
9.根据前述权利要求任一项的组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包含(i)包含铁离子的试剂，所述包含铁离子的试剂选自硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、右旋糖酐铁、柠檬酸铁铵及其他药学上可接受的包含铁离子的试剂中的至少一种，优选地，所述包含铁离子的试剂是硫酸亚铁或右旋糖酐铁；和(ii)ROS诱导剂，所述ROS诱导剂选自羰基氰化物间氯苯腙、柳氮磺吡啶，丁硫氨酸亚砜亚胺、利尿酸、BAY-87-2243、Ezatiostat、苯基乙基异硫代氰酸酯中的至少一种。
10.根据前述权利要求任一项的组合物或试剂盒或用途，其特征在于，所述药物或试剂的作用不被铁死亡抑制剂所抑制，任选地，所述铁死亡抑制剂选自Fer-1、U0126、AZD6244、AZD8330、PD98059；任选地，所述药物被Caspase广泛抑制剂抑制，任选地，所述Caspase广泛抑制剂是Z-VAD。
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