CN108721336A - 凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法及应用 - Google Patents

凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，具体步骤如下：制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液；凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合。本发明的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液喷雾剂，无刺激、无腐蚀、无污染，适合治疗各个年龄，各种皮肤，各种类型的灰指甲和牛皮癣；效果显著、对皮肤无损坏；使用浓度低、稳定性好、并且不复发。

Description

凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体涉及一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液喷雾剂的制备方法及应用。
背景技术
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，属于芽孢杆菌属，细胞呈杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛；其分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为革兰氏阳性兼性厌氧菌，细胞呈杆状，芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏中生，孢囊不膨大或轻微膨大。地衣芽孢杆菌对外界环境有较强的抵抗力，对高温、酸性、胆盐和人工胃液有一定的耐受能力。
甲癣，俗称“灰指甲”，是指皮癣菌侵犯甲板或甲下所引起的疾病。甲真菌病是由皮癣菌、酵母菌及非皮癣菌等真菌引起的甲感染。灰指甲的危害众多：影响美观、限制工作、产生异常心理障碍、并发症多和成为人体传染源等，严重影响人们的日常生活。现有治疗灰指甲的药物，抗菌性能不一，高效抗菌药物有效浓度高，价格也高，稳定性差，有毒性、腐蚀性、刺激性气味，对皮肤有一定的损伤，对环境也有一定的污染。
牛皮癣又称“银屑病”，是一种常见的慢性皮肤病。目前，治疗牛皮癣的药品较多，有西药制剂也有中药制剂，市售的这些药物对牛皮癣有一定的抑制作用，但疗效较慢，而且不易根治。
现有的各种药物和制剂只能治疗灰指甲或牛皮癣的单一疾病，且价格高、疗效慢、不易根治，还具有毒性和腐蚀性。因此，亟需一种对不同皮肤，不同类型的灰指甲和牛皮癣都有特效的混合菌液喷雾剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液喷雾剂，无刺激、无腐蚀、无污染，适合治疗各个年龄，各种皮肤，各种类型的灰指甲和牛皮癣；效果显著、对皮肤无损坏；使用浓度低、稳定性好。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液:
a、菌种培养：将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30-37℃培养24小时，取此斜面菌种转接2个250ml的茄子瓶斜面，于30-37℃培养24小时；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为30％-60％，调节pH至7.6-7.8，开搅拌，121℃灭菌20-30分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.04-0.06MPa，当温度降至36-38℃时，将长好的2个茄子瓶上的菌体用100-200ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30-38℃、罐压0.04-0.06MPa，搅拌速度为120-160转/分，进行深层通气搅拌培养16-24小时；
c、发酵罐培养：当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10亿cfu/ml时，将种子罐中的培养液以5％-10％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持30-38℃、罐压0.04-0.06MPa，搅拌速度120-160转/分，进行深层通气搅拌培养24-30小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同；
(2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合：
将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后，即得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。
优选地，步骤(1)所述固体培养基的配制方法如下：取蛋白胨8-10g，牛肉膏5-7g，氯化钠5-7g，蒸馏水定容至1000ml，调节pH 7.2-7.4，加入18-20g琼脂，加热熔化，装入试管或茄子瓶，121℃灭菌30分钟，冷却，摆成斜面备用。
优选地，步骤(1)所述液体培养基的配方为：蛋白胨8-20g，酵母膏5-15g，磷酸氢二钾0.2-2g，磷酸二氢钾0.2-2g，硫酸镁0.1-2g，葡萄糖8-20g，碳酸钙1-10g，水1000ml。
优选地，所述喷雾剂的规格为100ml/瓶。
进一步，凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液在制备治疗灰指甲和牛皮癣喷雾剂中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液喷雾剂，无刺激、无腐蚀、无污染，适合治疗各个年龄，各种皮肤，各种类型的灰指甲和牛皮癣；效果显著、对皮肤无损坏；使用浓度低、稳定性好、并且不复发。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)编号为GDMCC 1.645的冻干菌种，购自广东省微生物菌种保藏中心。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)编号为GDMCC 1.863的冻干菌种，购自广东省微生物菌种保藏中心。
实施例1
一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液:
a、菌种培养：将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30℃培养24小时，取此斜面菌种转接2个250ml的茄子瓶斜面，于30℃培养24小时；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为30％，调节pH至7.6，开搅拌，121℃灭菌20分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.04MPa，当温度降至36℃时，将长好的2个茄子瓶上的菌体用100ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30℃、罐压0.04MPa，搅拌速度为120转/分，进行深层通气搅拌培养24小时；
c、发酵罐培养：当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10亿cfu/ml时，将种子罐中的培养液以5％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持30℃、罐压0.04MPa，搅拌速度120转/分，进行深层通气搅拌培养30小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同；
(2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合：
将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后，装入100ml喷雾瓶，即得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。
实施例2
一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液:
a、菌种培养：将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于35℃培养24小时，取此斜面菌种转接2个250ml的茄子瓶斜面，于35℃培养24小时；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为40％，调节pH至7.7，开搅拌，121℃灭菌25分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.05MPa，当温度降至37℃时，将长好的2个茄子瓶上的菌体用150ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持35℃、罐压0.05MPa，搅拌速度为140转/分，进行深层通气搅拌培养20小时；
c、发酵罐培养：当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10亿cfu/ml时，将种子罐中的培养液以8％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持35℃、罐压0.05MPa，搅拌速度140转/分，进行深层通气搅拌培养27小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同；
(2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合：
将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后，装入100ml喷雾瓶，即得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。
实施例3
一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液:
a、菌种培养：将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于37℃培养24小时，取此斜面菌种转接2个250ml的茄子瓶斜面，于37℃培养24小时；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，装液量为60％，调节pH至7.8，开搅拌，121℃灭菌30分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.06MPa，当温度降至38℃时，将长好的2个茄子瓶上的菌体用200ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持38℃、罐压0.06MPa，搅拌速度为160转/分，进行深层通气搅拌培养16小时；
c、发酵罐培养：当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10亿cfu/ml时，将种子罐中的培养液以10％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持38℃、罐压0.06MPa，搅拌速度160转/分，进行深层通气搅拌培养24小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同；
(2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合：
将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后，装入100ml喷雾瓶，即得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。
实施例4动物急性毒性试验
取体重基本一致的小白鼠30只，分成3组，将实施例1-3制备的喷雾剂分别经小鼠背部给药，每只小鼠每次喷施3ml，每天3次。观察三天，结果发现，没有一例小鼠死亡，表明本发明的喷雾剂对小鼠无急性毒性。
实施例5一般药理试验
采用Beagle犬、小鼠对本发明的喷雾剂进行一般药理学研究。分别对Beagle犬背部外喷低(5ml)、中(10ml)、高(20ml)三个剂量的实施例1-3制备的喷雾剂和蒸馏水(对照实验)，共4个组，对心血管系统、呼吸系统进行观察。结果发现，实施例1-3制备的喷雾剂对Beagle犬收缩压、舒张压、平均动脉压、心率、心律、呼吸频率、节律和幅度均无明显影响。
小鼠背部外喷低(2ml)、中(4ml)、高(8ml)三个剂量的实施例1-3制备的喷雾剂和蒸馏水(对照实验)，共4个组，对神经系统观察(自发活动计数、爬杆试验及阈下剂量戊巴比妥钠催眠协同试验作用)。结果发现，实施例1-3制备的喷雾剂对小鼠自发活动、爬杆能力无明显影响，对阈下剂量戊巴比妥钠催眠无协同作用。
结果表明，实施例1-3制备的喷雾剂对Beagle犬心血管系统、呼吸系统无明显影响，对小鼠神经系统无明显影响，说明本品具有良好安全性。
实施例6
试验选30例志愿者，为14～45岁的灰指甲患者。患者就诊前一个月内未使用过任何口服及外用药物治疗。志愿者分为3组，每组患者分别将实施例1-3制备的喷雾剂喷施在灰指甲患处，每天2次，3个月后，观察效果。结果发现，患者均无不良反应，且治疗后有显著效果，无复发情况。
试验选15例志愿者，为14～45岁的牛皮癣患者。患者就诊前一个月内未使用过任何口服及外用药物治疗。志愿者分为3组，每组患者分别将实施例1-3制备的喷雾剂喷施在牛皮癣患处，每天2次，3个月后，观察效果。结果发现，患者均无不良反应，且治疗后有显著效果，无复发情况。
注：本发明所述志愿者均符合受试者志愿入选标准。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液:
a、菌种培养：将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30-37℃培养24小时，取此斜面菌种转接茄子瓶斜面，于30-37℃培养24小时；
b、种子罐培养：在种子罐中加入液体培养基，调节pH至7.6-7.8，开搅拌，121℃灭菌20-30分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压为0.04-0.06MPa，当温度降至36-38℃时，将长好的茄子瓶上的菌体用100-200ml无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30-38℃、罐压0.04-0.06MPa，搅拌速度为120-160转/分，进行深层通气搅拌培养16-24小时；
c、发酵罐培养：当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10亿cfu/ml时，将种子罐中的培养液以5％-10％的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中，保持30-38℃、罐压0.04-0.06MPa，搅拌速度120-160转/分，进行深层通气搅拌培养24-30小时；
(2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合：
将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后，即得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。
2.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述固体培养基的配制方法如下：取蛋白胨8-10g，牛肉膏5-7g，氯化钠5-7g，蒸馏水定容至1000ml，调节pH 7.2-7.4，加入18-20g琼脂，加热熔化，装入试管或茄子瓶，121℃灭菌30分钟，冷却，摆成斜面备用。
3.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基的配方为：蛋白胨8-20g，酵母膏5-15g，磷酸氢二钾0.2-2g，磷酸二氢钾0.2-2g，硫酸镁0.1-2g，葡萄糖8-20g，碳酸钙1-10g，水1000ml。
4.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法，其特征在于，所述喷雾剂的规格为100ml/瓶。
5.凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液在制备治疗灰指甲和牛皮癣喷雾剂中的应用。
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