CN108707194B - 猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的猪ω7干扰素以及将其进行单位点突变获得的序列为SEQ ID NO.3所示的抗病毒活性提高的突变体。本发明将该突变体编码基因进行密码子优化得到抗病毒活性明显提升的优化基因。本发明还将SEQ ID NO.3所示突变体分别进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变获得多个抗病毒活性显著提高的猪ω7干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述猪ω7干扰素突变体，所表达产物的抗病毒活性大幅提高。本发明提供的猪ω7干扰素突变体能够用于制备预防或治疗猪病毒性疾病的药物或试剂。

Description

猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及猪ω7干扰素以及抗病毒活性提高的猪ω7干扰素突变体，本发明还涉及一种利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述猪ω7干扰素或其突变体的方法；本发明进一步涉及所述猪ω7干扰素或其突变体在制备预防或治疗猪病毒性疾病的药物或试剂中的应用，属于猪ω7干扰素突变体的制备及应用领域。
背景技术
干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤、刺激免疫应答的蛋白质家族，在人和动物体内起到抵御病毒入侵、杀伤肿瘤细胞、刺激体液免疫及细胞免疫、调节生理平衡等方面的重要作用。IFN蛋白家族根据其编码基因的序列、染色体定位和受体特异性分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素。Ⅰ型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-δ、IFN-ε、IFN-ζ、IFN-τ等。Ⅱ型干扰素只有IFN-γ一个成员，又称为免疫干扰素，主要作用是激活巨噬细胞杀灭微生物。Ⅲ型干扰素是新发现的细胞因子，包括λ1(IL-29)、λ2(IL-28a)和λ3(IL-28b)。
干扰素ω是首先在人类中发现的。在猪的Ⅰ型干扰素中已有报道的有IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-δ等，这些基因均排列在家猪1号染色体上。
猪是常见的大规模养殖家畜之一，猪肉人们日常食用肉类之一。它含有人体所需要的多种营养成分。在500克猪瘦肉中，蛋白质为84.5克，脂肪146克，糖类5克，钙55毫克，磷850毫克，铁12毫克，维生素B12.65毫克，维生素B20.6毫克，尼克酸21毫克。在医疗保健方面，猪肉性平味甘，有润肠胃、生津液、补肾气、解热毒的功效，主治热病伤津、消渴羸瘦、肾虚体弱、产后血虚、燥咳、便秘、补虚、滋阴、润燥、滋肝阴、润肌肤、利小便和止消渴。猪肉煮汤饮下可急补由于津液不足引起的烦燥、干咳、便秘和难产；然而，一些病毒性疾病影响着猪养殖业的生存和发展，也影响着人们的日常生活。
因此，提供具有高病毒活性且制备成本低廉的猪ω干扰素对于防治影响猪养殖业的生存和发展的病毒性疾病等具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种猪ω7干扰素；
本发明的目的之二是提供抗病毒活性有显著提升的猪ω7干扰素突变体；
本发明的目的之三是将猪ω7干扰素突变体的编码基因按照家蚕密码子偏好性对其进行密码子优化得到抗病毒活性提升的优化基因；
本发明的目的之四提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述猪ω7干扰素或猪ω7干扰素突变体的方法；
本发明的目的之五是将所述猪ω7干扰素或猪ω7干扰素突变体应用于预防或治疗猪病毒性疾病。
为实现上述目的，本发明提供了以下解决技术方案：
本发明首先公开了一种猪ω7干扰素，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：
(a)SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或
(b)与SEQ ID No.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；或
(c)与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性。
本发明进一步公开了一种猪ω7干扰素突变体，所述突变体的氨基酸序列为SEQID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；SEQ ID NO.3所示的突变体是将SEQ ID NO.1所示的猪ω7干扰素的第18位氨基酸由丝氨酸(S)突变成脯氨酸(P)所得到的突变体。
本发明进一步将本核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示的基因根据家蚕密码子偏好性对其进行密码子优化，优化后的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，其抗病毒活性相比优化前的序列有显著提升。
本发明进一步在SwIFN-ω7-S突变体(SEQ ID NO.3)的基础上，以密码子优化后的SwIFN-ω7-S-O的基因序列(SEQ ID NO.5)为模板设计多对引物，利用融合PCR法进行氨基酸单位点突变、氨基酸双位点突变、氨基酸多位点突变，获得了多个猪ω7干扰素突变体，包括：
(Ⅰ)将SEQ ID NO.3所述突变体进行单位点突变得到的猪ω7干扰素突变体：
所述猪ω7干扰素突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的猪ω7干扰素突变体进行S27F、I33V、L61F、D67E、H70Q、A74T、I93T、K94E、D101N、I103T、H109C、Q114R、M138V、Q143E、H146R、I161T、E185V、H186D或P190S中任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体；优选为，将氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的猪ω7干扰素突变体进行I33V、L61F、I93T、K94E、I103T或H186D任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体，其氨基酸序列分别为SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；其中，本发明所述氨基酸单位点突变S27F，表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的猪ω7干扰素突变体的第27位氨基酸由丝氨酸(S)突变成苯丙氨酸(F)；I33V表示将第75位氨基酸由异亮氨酸(I)突变成缬氨酸(V)；I33V、L61F、D67E、H70Q、A74T、I93T、K94E、D101N、I103T、H109C、Q114R、M138V、Q143E、H146R、I161T、E185V、H186D以及P190S的突变依此类推。
(Ⅱ)将SEQ ID NO.3所述突变体进行双位点突变得到的猪ω7干扰素突变体：
所述猪ω7干扰素突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的猪ω7干扰素突变体进行I33V-L61F、I33V-I93T、I33V-K94E、I33V-I103T、I33V-H186D、L 61F-I93T、L61F-K94E、L61F-I103T、L61F-H186D、I93T-K94E、I93T-I103T、I93T-H186D、K94E-I103T、K94E-H186D或I103T-H186D任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体；优选为，将氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的猪ω7干扰素突变体进行I33V-L61F、L61F-K94E或L61F-H186D任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQID NO.14所示；其中，本发明所述氨基酸双位点突变I33V-L61F表示将氨基酸序列为SEQ IDNO.3所示的猪ω7干扰素突变体的第33位氨基酸由异亮氨酸(I)突变成缬氨酸(V)，并且将第61位氨基酸由亮氨酸(L)突变成苯丙氨酸(F)；氨基酸双位点突变L61F-K94E表示将第61位氨基酸由亮氨酸(L)突变成苯丙氨酸(F)，并且将第94位氨基酸由赖氨酸(K)突变成谷氨酸(E)；I33V-I93T、I33V-K94E、I33V-I103T、I33V-H186D、L 61F-I93T、L61F-K94E、L61F-I103T、L61F-H186D、I93T-K94E、I93T-I103T、I93T-H186D、K94E-I103T、K94E-H186D或I103T-H186D的突变依此类推。
(Ⅲ)将SEQ ID NO.3所述突变体进行多位点突变得到的猪ω7干扰素突变体：
所述猪ω7干扰素突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的猪ω7干扰素突变体进行I33V-L61F-I93T、I33V-L61F-K94E、I33V-L61F-H186D、I33V-I93T-K94E、L61F-I93T-H186D、L61F-I93T-K94E、L61F-K94E-H186D、或I93T-K94E-H186D中任何一种氨基酸多位点突变获得的突变体；优选为，将氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的猪ω7干扰素突变体进行I33V-L61F-H186D、I33V-I93T-K94E、L61F-I93T-K94E氨基酸多位点突变获得的突变体，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示；其中，本发明所述氨基酸多位点突变I33V-L61F-H186D表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的猪ω7干扰素突变体的第33位氨基酸由异亮氨酸(I)突变成缬氨酸(V)，并且将第61位氨基酸由亮氨酸(L)突变成苯丙氨酸(F)，同时将第186位氨基酸由组氨酸(H)突变成天冬氨酸(D)；I33V-L61F-K94E、I33V-L61F-H186D、I33V-I93T-K94E、L61F-I93T-H186D、L61F-I93T-K94E、L61F-K94E-H186D、或I93T-K94E-H186D的突变内容依此类推。
本发明整体技术方案的详述
本发明首先分析了NCBI上所有猪ω7干扰素氨基酸序列，最终确定以登录号为ACF17568.1的氨基酸序列为猪ω7干扰素原始氨基酸序列(其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)，与其他哺乳动物相关氨基酸序列对比并进行信号肽突变，即将原始氨基酸序列第18位丝氨酸(S)变成脯氨酸(P)，即S18P，获得IFN的猪ω7干扰素信号肽突变体，命名为SwIFN-ω7-S突变体，其氨基酸序列为SEQ IDNO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述猪ω7干扰素及其突变体，抗病毒活性测定结果表明在蚕幼虫体内表达的猪ω7干扰素(SEQ ID NO.1)有较为显著的抗病毒活性，效价达1.26×106U/mL；在蚕幼虫体内表达的SwIFN-ω7-S(SEQ ID NO.3)抗病毒效价为1.78×106U/mL，高于SwIFN-ω7，说明通过突变信号肽只有一个特异性切割位点的方法来提高SwIFN-ω7抗病毒活性是可行和有效的。
本发明进一步将猪ω7干扰素信号肽突变体SwIFN-ω7-S的编码基因(SEQ IDNO.4)根据家蚕密码子偏好性对其基因序列进行密码子优化，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转录效率与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变；为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列AAC，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI、SmaI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，得到新的猪ω7干扰素突变体SwIFN-ω7-S-O突变体，SwIFN-ω7-S-O突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，优化后的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。抗病毒活性测定结果表明，在蚕幼虫体内表达的SwIFN-ω7-S-O有较为显著的抗病毒活性，SwIFN-ω7-S-O效价达2.51×106U/mL。
本发明进一步在SwIFN-ω7-S突变体的基础上，以密码子优化后的SwIFN-ω7-S-O的基因序列为模板设计多对引物，利用融合PCR法进行氨基酸单位点突变、氨基酸双位点突变、氨基酸多位点突变，获得了多个猪ω7干扰素突变体。
其中，在SwIFN-ω7-S突变体的基础上，分别进行I33V、L61F、I93T、K94E、I103T、H109C这6个位点单位点突变后，表达的猪ω7干扰素效价高于信号肽突变的序列表达测得的效价，抗病毒效价达到2.69×106-4.68×106U/mL；而其余位点突变后效价不变甚至降低，说明这6个位点的突变是有效突变，可以达到提高抗病毒活性的目的；其中，进行I33V单位点突变获得的SwIFN-ω7-S-O-M突变体(SEQ ID NO.6)具有最强抗病毒作用。
本发明进一步将抗病毒活性提高的单突变位点I33V、L61F、I93T、K94E、I103T、H186D两两组合，将SwIFN-ω7-S突变体进行双位点突变。抗病毒活性的检测结果表明，I33V-L61F、L61F-K94E、L61F-H186D三组双突变后，表达的猪ω7干扰素效价高于单突变序列表达测得的效价，抗病毒效价达到5.01×106-6.31×106U/mL，而其余几组位点突变后效价不变甚至降低，说明这3个组合位点的突变是有效突变，可以达到提高抗病毒活性的目的。其中，进行I33V-L61F双位点突变获得的SwIFN-ω7-S-O-I33V-L61F(SEQ ID NO.12)突变体具有最强抗病毒作用。
本发明进一步将SwIFN-ω7-S突变体在双位点突变的基础上进行氨基酸多位点突变。突变体抗病毒活性的检测结果表明，I33V-L61F-H186D三位点突变后的突变体(SEQ IDNO.15)表达的猪ω7干扰素效价远高于单突变序列、双突变序列表达测得的效价，为7.94×106U/mL；而其余几组位点突变后效价不变甚至降低。说明此组合位点的突变是有效突变，可以达到提高抗病毒活性的目的。
本发明还公开了含有所述猪ω7干扰素或者猪ω7干扰素突变体的编码基因的重组载体或重组宿主细胞；其中，所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
本发明所构建的转移载体包括：
(1)含有猪ω7干扰素(SwIFN-ω7)基因或含有猪ω7干扰素信号肽突变体(SwIFN-ω7-S突变体)基因的载体pVL-SwIFN-ω7、pVL-SwIFN-ω7-S；
(2)含有SwIFN-ω7-S突变体进行优化后的基因序列的载体pVL-SwIFN-ω7-S-O；
(3)含有SwIFN-ω7-S-O突变体进行氨基酸单位点突变后的突变体(SwIFN-ω7-S-O-M突变体)基因序列的载体pVL-SwIFN-ω7-S-O-M；
(4)含有SwIFN-ω7-S-O突变体进行氨基酸双位点突变后的突变体(SwIFN-ω7-S-O-D突变体)基因序列的载体pVL-SwIFN-ω7-S-O-D；
(5)含有SwIFN-ω7-S-O突变体进行氨基酸多位点突变后的突变体(SwIFN-ω7-S-O-T3突变体)基因序列的载体pVL-SwIFN-ω7-S-O-T。
本发明所获得的重组杆状病毒包括：重组家蚕核型多角体病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7、SwIFN-ω7-S)、rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O、SwIFN-ω7-S-O-M、SwIFN-ω7-S-O-D、SwIFN-ω7-S-O-T)。
本发明还公开了所述的猪ω7干扰素或者猪ω7干扰素突变体在制备预防或治疗猪病毒性疾病的药物或试剂中的用途。
其中，所述猪病毒性疾病包括：非洲猪瘟、猪瘟、猪病毒性腹泻与边区病、猪繁殖呼吸综合征、东部马脑脊髓炎、传染性胃肠炎和猪呼吸道冠状病毒感染、猪流行性腹泻、血凝性脑脊髓炎病毒感染、肠道病毒感染、脑心肌炎病毒、水疱性传染病、猪流感、蓝眼病、轮状病毒、呼肠病毒感染、猪细小病毒感染、猪圆环病毒感染、狂犬病、伪狂犬病、细胞巨化病毒感染、腺病毒感染、猪痘中的一种或多种。
本发明还公开了一种制备所述猪ω7干扰素或者猪ω7干扰素突变体的方法，包括以下步骤：(1)分别将所述猪ω7干扰素或者所述猪ω7干扰素突变体的编码基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；(2)将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；(3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的蛋白，纯化，即得。
其中，所述杆状病毒转移载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF 8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC 3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030或pUAC-5；
所述杆状病毒选自家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid、BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV；
所述昆虫宿主选自家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthiapryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantriadispar)；
优选的，所述杆状病毒转移载体为pVL1393；所述杆状病毒为家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid；所述昆虫宿主为家蚕(Bombyx mori)。
所述感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选为，将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种猪ω7干扰素基因的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹最优为1-2天的早期嫩蛹。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明通过查找NCBI上猪ω7干扰素氨基酸序列，确定以登录号为ACF17568.1的氨基酸序列为主要参考序列，与其他哺乳动物I型干扰素氨基酸序列对比并进行信号肽突变，再进行优化，设计一条序列；并以此序列为模板设计多对引物用融合PCR法进行氨基酸单位点突变、氨基酸双位点突变、氨基酸多位点突变，获得了多个猪ω7干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述猪ω7干扰素突变体，所表达的猪ω7干扰素突变体的抗病毒活性大幅度提高，具有较为明显的抗病毒活性。本发明方法工艺简单，可快速获得大量安全可靠的猪ω7干扰素。本发明所述的猪ω7干扰素突变体能够用于制备预防或治疗猪病毒性疾病的药物或试剂，对畜牧业的发展具有重大意义。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人，(1992)；Rossolini等人，MolCell.Probes8:91-98(1994))。
术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“转染”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
图1为细胞病变比例对应的荧光图；其中，A，“-”：无细胞病变；B，“±”：几个细胞病变；C，“+”：20％～30％细胞病变；D，“++”：50％～60％细胞病变；
图2为重组质粒pVL-SwIFN-ω7的双酶切鉴定；其中，M：DNA分子质量标准；1：重组质粒pVL-SwIFN-ω7双酶切产物；-为阴性对照；
图3为细胞出现荧光的各种比例的情况；其中，A：干扰素抑制VSV病毒显示的荧光；B：VSV病毒感染对照组显示的荧光；C：部分细胞感染VSV病毒显示的荧光。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、试验材料与试剂
转移载体pVL1393，E.coli菌株TOP10，BmN细胞，PK15细胞，VSV-GFP病毒，均由中国农业科学院生物技术研究所保存和提供；试验家蚕品种JY1为江苏科技大学蚕业研究所提供，亲本病毒BmBacmid DNA按照文献(专利号：ZL 201110142492.4，授权日期：2013.01.23)中所公开的方法构建。限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Promega公司，PCR反应所用的LATaq DNA聚合酶及其它相关试剂均购自TakaRa公司，脂质体购自Invitrogen公司，DMEM细胞培养基、胎牛血清为GIBCO公司产品。有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Josephetal.，分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998；David L.Spector，细胞实验指南，2001)；除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
2、实验方法
实验方法中用于定点突变的融合PCR方法，参照邝翡婷等人(一种载体构建的新方法：重组融合PCR法，基因组学与应用生物学，2012年，第31卷，第6期，第634-639页)所描述的方法进行。
实验方法中计算干扰素的效价，利用PK15/VSV*GFP系统，使用Reed-Mueneh方法，具体操作参照刘兴健，等(猫ω-like干扰素在家蚕中的表达和生物活性检测，生物技术进展，2015，5(6)：441-445)以及Summers MD等(A manual of methods for baculovirusvectors and insect cell culture procedures[R].Texas Agricultural ExperimentStation，1987)所描述的方法进行，其中判断细胞病变的标准参照图1。
每一个实施案例中的最佳改良方案均作为下一实施案例改良方案的比较标准。
实施例1猪ω7干扰素及其信号肽突变体基因在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1目的基因合成和重组质粒的构建
本发明分析了NCBI上所有猪ω7干扰素氨基酸序列，进行序列比对及信号肽分析，最终确定以登录号为ACF17568.1的氨基酸序列为原始序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。序列分析过程中发现该序列的信号肽有多个切割峰，鉴于之前信号肽的切割位点影响干扰素的分泌效率的发现，本发明决定对猪ω7干扰素氨基酸序列进行突变。用SignalP4.1在线对猪IFN-ω7氨基酸序列或相关序列进行信号肽预测，结果发现猪IFN-ω7氨基酸或相关序列为双峰，意味着信号肽的分泌和切割效率并不是最佳，参考其他哺乳动物类干扰素氨基酸序列进行信号肽突变设计，比较信号肽对抗病毒活性的影响，获得了猪ω7干扰素信号肽优化的突变体。即将原始氨基酸序列第18位S变成P，获得IFN的猪ω7干扰素信号肽突变体，命名为SwIFN-ω7-S突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.4所示。
用DNAman软件分析限制酶酶切位点，根据酶切位点分析结果以及转移载体pVL1393和pUC57上的多克隆位点，在目的基因两端加入目的基因序列中不存在的限制酶酶切位点。依据分析结果在其5'端加入BamHI酶切位点和Kozak序列，3'端加入EcoRI酶切位点，使用TAA作为终止密码子，确定好的基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并插入pUC57载体，形成质粒pUC57-SwIFN-ω7。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用BamHI和EcoRI对合成的质粒pUC57-SwIFN-ω7进行双酶切处理，玻璃奶法回收目的片段，T4 DNA连接酶连接目的片段和进行双酶切处理并灭活后的杆状病毒转移载体pVL1393，16℃，连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，挑选菌落培养，提质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒测序，测序正确的质粒命名为pVL-SwIFN-ω7。
将测序正确的质粒pVL-SwIFN-ω7用BamHI和EcoRI进行双酶切处理，琼脂糖凝胶电泳后采用玻璃奶法回收目的片段，再应用融合PCR技术设计引物对目的片段进行定点突变，之后用T4 DNA连接酶连接目的片段及进行双酶切处理并灭活后的杆状病毒转移载体pVL1393(16℃，过夜连接)。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，挑选菌落培养，提质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒测序，测序正确的质粒命名为pVL-SwIFN-ω7-S。
由猪ω7干扰素原始核苷酸序列突变成猪ω7干扰素信号肽突变体核苷酸序列所需引物：
(1)两端上下游引物
F:TCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCAACATGGCCTTCATGCT
R:GATCTGCAGCGGCCGCTCCGGAATTCTCAAGGTGACCCCAGGTG
(2)中间上下游引物：
F:TCAGCTACAGCTCTGGGGGATCTCT
R:AGAGATCCCCCAGAGCTGTAGCTGA
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行BmN细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当BmN细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清TC-100培养基洗三次，加1.5mL无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid DNA，2μg重组转移质粒pVL-SwIFN-ω7、pVL-SwIFN-ω7-S和5μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μL，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5mL无血清培养基和300μL FBS。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7)、rBmBacmid(SwIFN-ω7-S)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1mL加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每个平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7)、rBmBacmid(SwIFN-ω7-S)。
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7)、rBmBacmid(SwIFN-ω7-S)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7)、rBmBacmid(SwIFN-ω7-S)。
1.4猪ω7型干扰素及其突变体在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105PFU/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，SwIFN-ω7在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猪ω7型干扰素及其突变体蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测蚕血淋巴中表达的猪ω7型干扰素的抗病毒活性。将状态良好的PK15细胞以3.0×105个/mL的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70mL/L胎牛血清的DMEM培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μL/孔接种于已经铺满PK15细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设12个复孔，同时设不加蚕血淋巴及VSV*GFP的细胞对照组和添加VSV*GFP的病毒对照组，于37℃、5％CO2条件下培养18～24h。将稀释至100TCID50的VSV*GFP病毒，按100μL/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％CO2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pVL-SwIFN-ω7、pVL-SwIFN-ω7-S经BamHI和EcoRI双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段573bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pVL1393片段9607bp大小相符。电泳结果如图2所示。将酶切鉴定正确的质粒测序，用MegaAlign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猪ω7型干扰素及其信号肽突变体基因已成功插入到pVL1393转移载体中BamHI和EcoRI之间。
2.2猪干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫表达的猪ω7型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组猪ω7干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力(图3)。根据猪ω7型干扰素对PK15细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照Reed-Mueneh方法计算干扰素的效价。检测结果列于表1，抗病毒活性测定结果表明，在蚕幼虫体内表达的SwIFN-ω7有较为显著的抗病毒活性，效价达1.26×106U/mL，SwIFN-ω7-S抗病毒效价高于SwIFN-ω7，为1.78×106U/mL，达到了预期的效果，说明通过突变信号肽为只有一个特异性切割位点的方法来提高SwIFN-ω7抗病毒活性是可行和有效的。
表1重组猪ω7干扰素抗病毒活性的检测结果
Figure BDA0001626740630000091
实施例2 SwIFN-ω7-S突变体进行优化后在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1猪ω7型干扰素突变体基因的构建
本发明利用OptimumGeneTM技术对上述猪ω7干扰素突变体进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转录效率与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。
为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列AAC，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI、SmaI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pVL1393中。
所设计的ω7型干扰素突变体基因进行优化后的序列由生物科技公司人工合成，命名为SwIFN-ω7-S-O突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，合成的基因片段插入pUC57载体，形成质粒pUC57-SwIFN，命名为pUC57-SwIFN-ω7-S-O。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用BamHI和EcoRI对合成的质粒pUC57-SwIFN-ω7-S-O进行双酶切处理，玻璃奶法回收目的片段，T4 DNA连接酶连接目的片段和进行双酶切处理并灭活后的杆状病毒转移载体pVL1393，16℃，连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，挑选菌落培养，提质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒测序，测序正确的质粒命名为pVL-SwIFN-ω7-S-O。
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行BmN细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当BmN细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清TC-100培养基洗三次，加1.5mL无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid DNA，2μg重组转移质粒pVL-SwIFN-ω7-S-O和5μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μL，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5mL无血清培养基和300μL FBS。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1mL加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每个平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O)。
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O)。
1.4猪ω7型干扰素突变体在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105PFU/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，SwIFN-ω突变体在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猪ω7型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测蚕血淋巴中表达的猪ω7型干扰素的抗病毒活性。将状态良好的PK15细胞以3.0×105个/mL的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70mL/L胎牛血清的DMEM培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μL/孔接种于已经铺满PK15细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设12个复孔，同时设不加蚕血淋巴及VSV*GFP的细胞对照组和添加VSV*GFP的病毒对照组，于37℃、5％CO2条件下培养18～24h。将稀释至100TCID50的VSV*GFP病毒，按100μL/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％CO2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pVL-SwIFN-ω7-S-O经BamHI和EcoRI双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段573bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pVL1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，用MegaAlign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猪ω7型干扰素突变体基因已成功插入到pVL1393转移载体中BamHI和EcoRI之间。
2.2猪干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫表达的猪ω干扰素突变体抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组猪ω干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据猪ω7型干扰素对PK15细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照Reed-Mueneh方法计算干扰素的效价。检测结果列于表2，抗病毒活性测定结果表明在蚕幼虫体内表达的SwIFN-ω7-S-O有较为显著的抗病毒活性，效价达2.51×106U/mL，达到了预期的效果，说明在猪ω7干扰素信号肽突变体上进行优化的方法来提高SwIFN-ω7抗病毒活性是可行和有效的。
表2猪ω7干扰素优化后抗病毒活性的检测结果
Figure BDA0001626740630000111
实施例3SwIFN-ω7-S突变体优化并进行氨基酸单位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1猪ω7型干扰素突变体基因的构建
基于实施例2的结果，本发明以密码子优化后的SwIFN-ω7-S-O突变体的基因序列为模板，设计多对引物对此序列进行定点突变，定点突变是利用融合PCR的方法进行，融合PCR的方法见前述“2、实验方法”。
突变位点分别为S27F、I33V、L61F、D67E、H70Q、A74T、I93T、K94E、D101N、I103T、H109C、Q114R、M138V、Q143E、H146R、I161T、E185V、H186D和P190S；所得的猪ω7干扰素突变体命名为SwIFN-ω7-S-O-M(1～19)突变体。
SwIFN-ω7-S-O突变体核苷酸序列进行氨基酸单位点、双位点及多位点突变所需引物：
(1)两侧上下游引物：
F:TCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCAACATGGCTTTCATGCTC
R:GATCTGCAGCGGCCGCTCCGGAATTCTTAAGGTGAACCCAAGTGTT
(2)中间上下游引物：
1
F1:GCGACTTGTTCCAAAACCACG
R1:CGTGGTTTTGGAACAAGTCGC
2
F2:ACGTTCACGTTTCCAGAAAAA
R2:TTTTTCTGGAAACGTGAACGT
3
F3:GGATTTCGGATTCCCACAAGA
R3:TCTTGTGGGAATCCGAAATCC
4
F4:AAGAAATGGTGGAAGGCTCTC
R4:GAGAGCCTTCCACCATTTCTT
5
F5:GGATGGCTCTCAACTGCAAAA
R5:TTTTGCAGTTGAGAGCCATCC
6
F6:TGCAAAAGACACAGGCCATA
R6:TATGGCCTGTGTCTTTTGCA
7
F7:CTCTTCCACACAAAAAGAAGC
R7:GCTTCTTTTTGTGTGGAAGAG
8
F8:TTCCACATAGAAAGAAGCTCC
R8:GGAGCTTCTTTCTATGTGGAA
9
F9:GCTGCCTGGAACAGTATCCTGTT
R9:AACAGGATACTGTTCCAGGCAGC
10
F10:CTGGGACAGTACACTGTTGGATAA
R10:TTATCCAACAGTGTACTGTCCCAG
11
F11:GATAAGTTGTGCTCAGGTCTC
R11:GAGACCTGAGCACAACTTATC
12
F12:TCTCCACAGACAGTTGGAAGACC
R12:GGTCTTCCAACTGTCTGTGGAGA
13
F13:TTGGGTATGGCTGTTAAAAGATACT
R13:AGTATCTTTTAACAGCCATACCCAA
14
F14:AAGATACTTCGAAGGAATCCACCTC
R14:GAGGTGGATTCCTTCGAAGTATCTT
15
F15:TTCCAAGGAATCAGACTCTACCTGA
R15:TCAGGTAGAGTCTGATTCCTTGGAA
16
F16:GCTTGGGAAACAGTCAGAGTGGA
R16:TCCACTCTGACTGTTTCCCAAGC
17为E185V突变，其引物是整条链的两端引物
F:TCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCAACATGGCTTTCATGCTC
R:GATCTGCAGCGGCCGCTCCGGAATTCTTAAGGTGAACCCAAGTGAACATCCATAA
18为H186D突变，起引物是整条链两端引物
F:TCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCAACATGGCTTTCATGCTC
R:GATCTGCAGCGGCCGCTCCGGAATTCTTAAGGTGAACCCAAGTCTTCATCCATAA
19为P190S突变,其引物是整条链的两端引物
F:TCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCAACATGGCTTTCATGCTC
R:GATCTGCAGCGGCCGCTCCGGAATTCTTACGATGAACCCAAGTGTT
20
I93T-K94E双突变中间引物
F:TCTTCCACATAAAAAGAAGCTCCG
R:CGGAGCTTCTTTTTATGTGGAAGA
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用重组酶(pEASY-Uni seamless Cloning and Assembly Kit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过BamHI和EcoRI双酶切的灭活杆状病毒转移载体pVL1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，挑选菌落培养，提质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒测序，测序正确的质粒命名为pVL-SwIFN-ω7-S-O-M(1～19)。
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行BmN细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当BmN细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清TC-100培养基洗三次，加1.5mL无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid DNA，2μg重组转移质粒pVL-SwIFN-ω7-S-O-M和5μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μL，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5mL无血清培养基和300μL FBS。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O-M)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1mL加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每个平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(pVL-SwIFN-ω7-S-O-M)。
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-O-M)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O-M)。
1.4猪ω7型干扰素突变体在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105PFU/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，SwIFN-ω7在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猪ω7型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测蚕血淋巴中表达的猪ω7型干扰素突变体的抗病毒活性。将状态良好的PK15细胞以1.0×105个/mL的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70mL/L胎牛血清的DMEM培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μL/孔接种于已经铺满PK15细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设8个复孔，同时设不加蚕血淋巴及VSV*GFP的细胞对照组和添加VSV*GFP的病毒对照组，于37℃、5％CO2条件下培养18～24h。将稀释至100TCID50的VSV*GFP病毒，按100μL/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％CO2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pVL-SwIFN-ω7-S-O-M经BamHI和EcoRI双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段573bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pVL1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒测序，用MegaAlign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猪ω7型干扰素突变体基因已成功插入到pVL1393转移载体中BamHI和EcoRI之间。
2.2猪干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫表达的猪ω7型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组猪ω7干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据猪ω7型干扰素对PK15细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照Reed-Mueneh方法计算干扰素效价，检测结果列于表3，所有猪ω7干扰素突变体测得效价在2.69×105U/mL～4.68×106U/mL，其中M2(I33V)、M3(L61F)、M7(I93T)、M8(K94E)、M10(I103T)、M18(H186D)这6个位点突变后，表达的猪ω7干扰素效价略高于信号肽突变的序列表达测得的效价，而其余位点突变后效价不变甚至降低，说明这6个位点的突变是有效突变，可以达到提高SwIFN-ω7-S-O突变体抗病毒活性的目的。其中，SwIFN-ω7-S-O-M2突变体具有最强抗病毒作用。
表3重组猪ω7干扰素单位点突变抗病毒活性的检测结果
Figure BDA0001626740630000141
Figure BDA0001626740630000151
实施例4 SwIFN-ω7-S-M突变体进行氨基酸双位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1猪ω7型干扰素突变体基因的构建
鉴于实施例3的结果，确定部分位点的突变是有效突变，可以达到提高SwIFN-ω7-S-O突变体的抗病毒活性目的。考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，且实施例3中进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，故尝试进行氨基酸双位点突变。本发明将抗病毒活性提高的单突变位点M2、M3、M7、M8、M10、M18两两组合，进行双位点突变，双位点突变是在实施例3获得的单位点突变序列的基础之上，以其(SwIFN-ω7-S-O-M)作为模板，利用相应的引物(详见实施例3)，通过融合PCR的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段，融合PCR的方法见前述“2、实验方法”。
双突变位点为I33V-L61F、I33V-I93T、I33V-K94E、I33V-I103T、I33V-H186D、L61F-I93T、L61F-K94E、L61F-I103T、L61F-H186D、I93T-K94E、I93T-I103T、I93T-H186D、K94E-I103T、K94E-H186D和I103T-H186D共15种组合，所获得的猪ω7干扰素突变体命名为SwIFN-ω7-S-O-D(1～15)突变体。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用重组酶(pEASY-Uni seamless Cloning and Assembly Kit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过BamHI和EcoRI双酶切的灭活杆状病毒转移载体pVL1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，挑选菌落培养，提质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒测序，测序正确的质粒命名为pVL-SwIFN-ω7-S-O-D(1～15)。
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行BmN细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当BmN细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清TC-100培养基洗三次，加1.5mL无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid DNA，2μg重组转移质粒pVL-SwIFN-ω7-S-O-D和5μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μL，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5mL无血清培养基和300μL FBS。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O-D)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1mL加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每个平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O-D)。
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O-D)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(SwIFN-ω7-S-O-D)。
1.4猪ω7型干扰素突变体在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105PFU/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，SwIFN-ω7在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猪ω7型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测蚕血淋巴中表达的猪ω7型干扰素突变体的抗病毒活性。将状态良好的PK15细胞以1.0×105个/mL的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70mL/L胎牛血清的DMEM培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μL/孔接种于已经铺满PK15细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设8个复孔，同时设不加蚕血淋巴及VSV*GFP的细胞对照组和添加VSV*GFP的病毒对照组，于37℃、5％CO2条件下培养18～24h。将稀释至100TCID50的VSV*GFP病毒，按100μL/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％CO2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pVL-SwIFN-ω7-S-O-D经BamHI和EcoRI双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段573bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pVL1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒进行核苷酸测序，用MegaAlign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猪ω7型干扰素突变体基因已成功插入到pVL1393转移载体中BamHI和EcoRI之间。
2.2猪干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫表达的猪ω7型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组猪ω7干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据猪ω7型干扰素对PK15细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照Reed-Mueneh方法计算干扰素效价，检测结果列于表4，所有猪ω7干扰素突变体测得效价在2.14×105U/mL～6.31×106U/mL，其中D1(I33V-L61F)、D7(L61F-K94E)、D9(L61F-H186D)三组双突变后，表达的猪ω7干扰素效价略高于单突变序列表达测得的效价，而其余几组位点突变后效价不变甚至降低，说明这3个组合位点的突变是有效突变，可以达到提高SwIFN-ω7-S-O-M突变体抗病毒活性的目的。其中，SwIFN-ω7-S-O-D1突变体具有最强抗病毒作用。
表4重组猪ω7干扰素双位点突变抗病毒活性的检测结果
Figure BDA0001626740630000171
实施例5 SwIFN-ω7-S-O-D突变体进行氨基酸多位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1猪ω7型干扰素突变体基因的构建
鉴于实施例4的结果，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置相互靠近彼此关联的，故尝试进行氨基酸多位点突变。本发明将获得的具有高效价的双突变位点组合，确定第三个突变位点，多位点突变是在实施例4获得的双位点突变序列的基础之上，以其(SwIFN-ω7-S-O-D)作为模板，利用相应的引物(详见实施例3)，通过融合PCR的方法进行第三位的定点突变，从而获得多位点突变的目的片段，融合PCR的方法见前述“2、实验方法”。
获得了以下8种组合：I33V-L61F-I93T、I33V-L61F-K94E、I33V-L61F-H186D、I33V-I93T-K94E、L61F-I93T-H186D、L61F-I93T-K94E、L61F-K94E-H186D、I93T-K94E-H186D。所获得的猪ω7干扰素突变体命名为SwIFN-ω7-S-O-T(1～8)突变体。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用重组酶(pEASY-Uni seamless Cloning and Assembly Kit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过BamHI和EcoRI双酶切的灭活杆状病毒转移载体pVL1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，挑选菌落培养，提质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒测序，测序正确的质粒命名为pVL-SwIFN-ω7-S-O-T(1～8)。
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行BmN细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当BmN细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清TC-100培养基洗三次，加1.5mL无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid DNA，2μg重组转移质粒pVL-SwIFN-ω7-S-O-T和5μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μL，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5mL无血清培养基和300μL FBS。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rBm-Bacmid(SwIFN-ω7-S-O-T)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1mL加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每个平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBm-Bacmid(SwIFN-ω7-S-O-T)。
将重组家蚕杆状病毒rBm-Bacmid(SwIFN-ω7-S-O-T)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBm-Bacmid(SwIFN-ω7-S-O-T)。
1.4猪ω7型干扰素突变体在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105PFU/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，SwIFN-ω7在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猪ω7-like型干扰素抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测蚕血淋巴中表达的猪ω7型干扰素突变体的抗病毒活性。将状态良好的PK15细胞以1.0×105个/mL的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70mL/L胎牛血清的DMEM培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μL/孔接种于已经铺满PK15细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设8个复孔，同时设不加蚕血淋巴及VSV*GFP的细胞对照组和添加VSV*GFP的病毒对照组，于37℃、5％CO2条件下培养18～24h。将稀释至100TCID50的VSV*GFP病毒，按100μL/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％CO2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pVL-SwIFN-ω7-S-O-T经BamHI和EcoRI双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段573bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pVL1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，用MegaAlign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猪ω7型干扰素突变体基因已成功插入到pVL1393转移载体中BamHI和EcoRI之间。
2.2猪干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在PK15/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫表达的猪ω7型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组猪ω7干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据猪ω7型干扰素对PK15细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照Reed-Mueneh方法计算干扰素效价，检测结果列于表5，所有猪ω7干扰素突变体测得效价在2.14×105U/mL～7.94×106U/mL，其中SwIFN-ω7-S-O-T3(I33V-L61F-H186D)突变后，表达的猪ω7干扰素效价高于单突变序列、双突变序列表达测得的效价，其效价为7.94×106U/mL。而其余几组位点突变后效价不变甚至降低，说明此组合位点的突变是有效突变，可以达到提高SwIFN-ω7-S-O-D突变体抗病毒活性的目的。
表5重组猪ω7干扰素多位点突变抗病毒活性的检测结果
Figure BDA0001626740630000191
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用
<130> BJ-2002-180401A
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 190
<212> PRT
<213> Pig
<400> 1
Met Ala Phe Met Leu Ser Leu Leu Thr Ala Leu Val Val Phe Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Ser Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val His
20 25 30
Ile Ser Arg Lys Asn Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Phe Cys Leu Lys Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu
50 55 60
Met Val Asp Gly Ser His Leu Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
65 70 75 80
His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Leu Leu Phe His Ile Lys Arg Ser
85 90 95
Ser Ala Ala Trp Asp Ser Ile Leu Leu Asp Lys Leu His Ser Gly Leu
100 105 110
His Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Pro Cys Leu Val Gln Glu Met Gly
115 120 125
Glu Gln Ala Ser Ala Leu Gly Met Ala Met Lys Lys Tyr Phe Gln Gly
130 135 140
Ile His Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu
145 150 155 160
Ile Val Arg Val Glu Ile Met Arg Ala Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu
165 170 175
Gln Glu Arg Leu Arg Ile Met Asp Glu His Leu Gly Ser Pro
180 185 190
<210> 2
<211> 573
<212> DNA
<213> Pig
<400> 2
atggccttca tgctctctct actgacagcc ctggtggtgt tcagctacag ctctggggga 60
tctctaggct gtgacctgtc tcagaaccac gtgcacatca gcaggaagaa cctggtgctt 120
ctgcatcaga tgaggagaat ctctccttct ttctgtctga aggacagaaa agacttcggg 180
ctcccccagg agatggtgga cggcagccac ctgcagaagg cccaagccat ctctgtcctc 240
cacgagatgc tccagcagac cttcctcctc ttccacataa agcgctcctc tgctgcctgg 300
gactccatcc tcctggacaa gctccactct ggactccatc agcagctgga agacctggac 360
ccctgcttgg tgcaggagat gggagagcag gcatctgccc tgggaatggc catgaagaag 420
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Claims (11)

1.猪ω7干扰素的突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述突变体的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
3.猪ω7干扰素的突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11中的任何一种。
4.猪ω7干扰素的突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14中的任何一种。
5.猪ω7干扰素的突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17中的任何一种。
6.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
7.一种制备权利要求1所述猪ω7干扰素突变体或权利要求3-5所述猪ω7干扰素突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别将所述猪ω7干扰素突变体的编码基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；
（2）将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；
（3）将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的蛋白，纯化，即得。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述杆状病毒转移载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac toPac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF 8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP 25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC 3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030或pUAC-5；
所述杆状病毒选自家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid、BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV；
所述昆虫宿主选自家蚕（Bombyx mori）、野蚕（Bombyx mandarina）、蓖麻蚕（Philosamia cynthia ricim）、樟蚕（Dictyoploca japanica）、樗蚕（Philosamia cynthiapryeri）、柞蚕（Antheraea pernyi）、日本柞蚕（Antheraea yamamai）、野天蚕（Antheraeapolyphymus）、苜蓿尺蠖（Atographa califorica）、茶尺蠖（Ectropis obliqua）、甘兰夜蛾（Mamestra brassicae）、斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）、秋粘虫（Spodopterafrugiperda）、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）、行军虫（Thaumetopoea wilkinsoni）、棉铃虫（Heliothis armigera）、美国棉铃虫（Heliothis zea）、烟青虫（Heliothis assulta）、烟草夜蛾（Heliothis virescens）、东方粘虫（Pseudaletia separata）或舞毒蛾（Lymantriadispar）；
所述感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，所述杆状病毒转移载体为pVL1393；所述杆状病毒为家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid；所述昆虫宿主为家蚕（Bombyx mori）。
10.权利要求1所述猪ω7干扰素突变体或权利要求3-5所述猪ω7干扰素突变体在制备预防或治疗猪病毒性疾病的药物或试剂中的用途。
11.按照权利要求10所述的用途，其特征在于，所述猪病毒性疾病包括水疱性传染病。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110317256B (zh) * 2019-06-11 2021-02-19 中国农业科学院生物技术研究所 鸭γ干扰素突变体及其制备方法和应用
CN110256552B (zh) * 2019-06-11 2021-02-19 中国农业科学院生物技术研究所 鸭λ干扰素突变体及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103923209A (zh) * 2014-05-13 2014-07-16 北京凯因科技股份有限公司 一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物
CN104788554A (zh) * 2015-04-23 2015-07-22 中国农业科学院生物技术研究所 猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用
WO2017194783A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103923209A (zh) * 2014-05-13 2014-07-16 北京凯因科技股份有限公司 一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物
CN104788554A (zh) * 2015-04-23 2015-07-22 中国农业科学院生物技术研究所 猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用
WO2017194783A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization and virus-induced expression profiles of the porcine interferon-ω multigene family;Xin Zhao;《Journal of Interferon & Cytokine Research》;20090930;第29卷(第10期);摘要，第689页右栏第2段-第692页左栏第2段 *
Interferon-omega: Current status in clinical applications;Shifang Li等;《International Immunopharmacology》;20171231;第52卷;全文 *
Sus scrofa interferon omega 7 gene, coplete cds;Zhao,X.等;《GenBank:EU797621.1》;20100510;FEATURES和ORIGIN部分 *
Zhao,X.等.Sus scrofa interferon omega 7 gene, coplete cds.《GenBank:EU797621.1》.2010,FEATURES和ORIGIN部分. *
家猪干扰素ω及δ基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究;赵欣;《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20111215;摘要，综述第2章，实验部分第1章 *
猪I型与II型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较;陈雪梅等;《生物工程学报》;20090625;第25卷(第6期);全文 *
猪α干扰素研究进展;舒畅等;《上海畜牧兽医通讯》;20071231(第6期);全文 *

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