CN117187198A - 一种重组鼠痘病毒及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组鼠痘病毒及其构建方法。本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组鼠痘病毒及其构建方法。本发明的重组鼠痘病毒，含有绿色荧光蛋白编码基因，含有EPG基因簇表达盒，EPG基因簇表达盒包含绿色荧光蛋白基因、痘苗病毒早晚期启动子PE/L、启动子P7.5及大肠杆菌gpt基因序列的双链DNA分子和鼠痘病毒非编码序列的上下游同源臂序列，利用无缝克隆技术，将目的基因左右同源臂构建在特定载体中，并通过一定的纯化方式，大大减少了载体构建和纯化的时间，提高了重组成功率，有很高的应用价值，为后续进行正痘病毒基因编辑奠定了很好的物质和技术基础。

Description

一种重组鼠痘病毒及其构建方法

技术领域

本生物发明属于技术领域，具体涉及一种重组鼠痘病毒及其构建方法。

背景技术

鼠痘病毒(Ectromelia virus，ECTV)又名小鼠传染性脱脚病病毒(infectiousectromelia virus)，与天花病毒、猴痘病毒和牛痘病毒等同属于脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxviridae)正痘病毒属(Orthopoxvirus)，为有囊膜、结构复杂的双链DNA(dsDNA)病毒。鼠痘病毒仅感染啮齿类动物，临床上引起小鼠的传染性脱脚病((Ectromelia)，又称鼠痘(Mousepox)，是一种接触性传染病，呈全身性感染，致死率高达95％。鼠痘病毒在某些品系小鼠体内呈潜伏感染，在运输、低温和X射线等应激因素作用下，特别是疫苗制造或肿瘤移植过程中运用小鼠组织连续传代3～5次后，鼠痘病毒易被激活。鼠痘病毒引起的鼠痘在世界各地的实验室鼠群中广泛流行。由于鼠痘病毒与天花病毒、猴痘病毒和牛痘病毒等其它正痘病毒属病毒在基因组序列上高度相似，它们共同编码与RNA和DNA合成、蛋白质加工、病毒粒子组装和结构形成相关的蛋白，是研究人兽共患痘病毒的有效模式病毒。

天花病毒曾导致全球3～5亿人死亡。1980年，世界卫生组织(WHO)宣布天花已被消灭。然而，随着气候变暖，以及天花病毒并未彻底销毁，这意味着潜在的生物恐怖袭击或意外的散毒事件仍有可能发生。因此，研究天花病毒感染与免疫的分子机制以及防控技术变得更加重要。此外，自2022年5月7日英国报道首例猴痘病例以来，已在非洲、欧洲、美洲和亚洲等113个国家流行，并在人际间不断传播。这是继新冠疫情后，世卫组织第二次发布“国际关注的突发公共卫生事件”的最高级别警报。猴痘病毒不仅可感染猴类和人类，而且所有的啮齿类和其他灵长类动物均为该病毒的自然储存和感染宿主。在进行相关活病毒实验活动时，存在巨大的生物安全风险，这很大程度上限制了对其进行感染与免疫机制的研究。由于鼠痘病毒可作为正痘病毒的模式动物病毒，而且啮齿类动物鼠类同时也是猴痘病毒和鼠痘病毒的宿主，鼠痘病毒和啮齿类动物鼠类已成为猴痘病毒病原生物学特性研究的理想的替代模型系统，而构建重组鼠痘病毒是研究其感染与免疫的一个重要手段和方法，具有重要的科学价值和生物安全意义。

同源重组是一种重要的DNA损伤修复方式，同时也是目前广泛应用于实验室构建重组病毒的技术之一。该技术主要通过将外源目的基因靶向整合到病毒基因组中，以达到对靶基因的定向改造。基本原理是在待插入外源基因两侧分别连接亲本病毒目的序列的左、右同源臂(即将一段目的基因序列分成两部分，每部分500bp左右，不足取邻近上下游序列)，将其构建入某个穿梭载体，重组质粒载体转染亲本病毒感染的细胞，通过同源重组，获得带有外源基因的重组病毒。虽然20世纪90年代国外就已经成功构建了同源重组痘病毒，我国也成功创建了带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的鼠痘病毒示踪系统(CN 103333866A)，但现有公开的构建重组痘病毒方法较为复杂，需要构建多个转移载体或多次重组，步骤繁琐，耗时时间长，容易出错等问题。此外，其具体实施方式以及所需主要基因的序列也不明确。

发明内容

本发明所要解决的主要问题是如何在不影响自身复制的情况下，构建新的示踪系统，使鼠痘病毒便于识别，进而可以观察病毒粒子的定位和复制状态。

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组鼠痘病毒。

本发明提供的重组鼠痘病毒含有绿色荧光蛋白基因。

上述重组鼠痘病毒含有DNA分子，所述DNA分子含有鼠痘病毒选取的某非编码序列的上游同源臂序列、EPG基因簇表达盒和鼠痘病毒某非编码序列的下游同源臂序列，所述EPG(EGFP-(PE/L)2-P7.5-gpt，简称EPG)基因簇表达盒包含所述绿色荧光蛋白基因、痘苗病毒早晚期启动子PE/L、启动子P7.5和大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶基因gpt序列，所述绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列为序列3中第17-736位，所述痘苗病毒早晚期启动子PE/L的核苷酸序列为序列3中第744-833位，所述启动子P7.5的核苷酸序列为序列3中第884-1284位，所述大肠杆菌gpt基因的核苷酸序列为序列3中第1283-1741位，所述鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列为序列1，所述鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列为序列2。

本发明提供了一种前文所述的DNA分子。

所述DNA分子中，所述鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列位于绿色荧光蛋白基因表达盒的上游，所述鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列位于所述绿色荧光蛋白基因表达盒的下游。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有前文所述的DNA分子。

所述重组载体含有EPG基因簇表达盒，所述EPG基因簇表达盒为包含绿色荧光蛋白基因EGFP、痘苗病毒早晚期启动子PE/L、启动子P7.5和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)表达所需的双链DNA分子。

其中痘苗病毒启动子(PE/L，P7.5)可以被痘病毒编码的RNA聚合酶识别，进而启动外源基因的表达。但不同的外源基因以及基因序列太长都会影响表达效率。该载体设计含有双向PE/L启动子序列和P7.5启动子序列，其中反向(3’—5’)PE/L启动子用于调控EGFP基因的表达，P7.5用于调控gpt基因的表达。正向(5’—3’)PE/L和P7.5之间为多克隆位点，可通过双酶切插入外源基因，并调控外源基因的表达。

本方法首先将EPG基因簇表达盒利用PCR技术，以pJS5载体质粒为模板进行PCR扩增，获得的产物用于后续构建所述重组载体。所述重组载体还含有鼠痘病毒某非编码序列的左右同源臂序列，所述鼠痘病毒非编码序列的左同源臂序列为序列1，所述鼠痘病毒非编码序列的右同源臂序列为序列2。

上述重组载体中，所述EPG基因簇表达盒的核苷酸序列为序列3。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、狂犬病病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、杆状病毒或痘苗病毒等)，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述核酸分子组合物、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。本发明中采用的载体质粒为pECTV-EPG。

重组质粒pECTV-EPG的结构描述如下：是将pBluescriptⅡSK+质粒的限制性内切酶BamHI和NotⅠ识别位点之间的序列替换为核苷酸序列中序列3的DNA分子的DNA分子，保持质粒pBluescriptⅡSK+质粒的其它核苷酸不变得到的重组质粒。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为如下任一种：

1)含有前文所述重组载体的重组病毒；

2)含有前文所述重组载体的重组微生物；

3)含有前文所述重组载体的重组细胞；

4)含有前文所述重组载体的动物细胞系；

5)含有前文所述重组载体的动物组织；

6)含有前文所述重组载体的动物器官。

上述生物材料中，所述重组病毒是将前文所述的重组载体导入哺乳动物细胞感染野生型病毒后得到的重组病毒。

上述生物材料中，所述重组微生物可为重组大肠杆菌DH5α。

所述重组大肠杆菌DH5α是将前文所述的重组载体导入大肠杆菌DH5α得到的重组微生物。

上述生物材料中，所述哺乳动物细胞为BSR-T7(金黄仓鼠肾细胞)、CV-1(非洲绿猴肾细胞)。

上述生物材料中，所述重组微生物具有产生绿色荧光活性。

本文中，所述重组鼠痘病毒可产生绿色荧光活性。

本发明还提供了构建前文所述的重组鼠痘病毒的方法，包括将前文所述的重组载体导入所述哺乳动物细胞后感染野生型鼠痘病毒，得到重组鼠痘病毒，重组鼠痘病毒表达前文所述的绿色荧光蛋白。

本发明提供一种利用基因同源重组技术，在鼠痘病毒复制非必需区插入EGFP基因序列，以获得利用绿色荧光蛋白标记鼠痘病毒的方法，并提供构建重组鼠痘病毒所需的标记基因(EGFP)、启动子(p7.5和PE/L)和压力筛选基因(gpt)的EPG基因簇序列。

本发明还提供了前文所述的重组载体、所述的生物材料，或所述的方法在下述任一种：

1)制备前文所述鼠痘病毒的产品；

2)制备前文所述鼠痘病毒载体中的应用；

3)制备前文所述激活鼠痘病毒转录的产品；

4)制备筛选前文所述鼠痘病毒药物的产品。

本发明利用基因同源重组技术，将EGFP基因序列插入鼠痘病毒基因组复制非必需区，产生的重组病毒在不影响自身复制的情况下，带有绿色荧光标签，可在荧光显微镜下发光，进而可以观察病毒粒子的定位和复制状态。该方法构建的重组鼠痘病毒是在其非编码区插入目的外源基因，不影响病毒的生长特性和感染能力。该重组病毒为进一步研究鼠痘病毒与宿主相互作用的分子机制，奠定了基础；也为以鼠痘病毒为模式病毒，研究猴痘病毒和天花病毒等严重危害人类健康的正痘病毒属病毒的病原生物学提供了物质和技术基础；利用无缝克隆技术，将目的基因左右同源臂构建在特定载体中，并通过一定的纯化方式，大大减少了载体构建和纯化的时间，提高了重组成功率，有很高的应用价值，为后续进行正痘病毒基因编辑奠定了很好的物质和技术基础。

附图说明

图1为鼠痘病毒左、右同源臂基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中泳道1为DL2000 DNA marker，泳道2为选取的鼠痘病毒非编码区左同源臂PCR扩增产物，泳道3为选取的鼠痘病毒非编码区右同源臂PCR扩增产物。

图2为EPG基因簇表达盒的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中泳道1为DL2000 DNA marker，泳道2为EPG基因簇表达盒的PCR扩增产物。

图3为重组病毒载体构建模式图。其中Flanking left表示鼠痘病毒非编码区左同源臂，EGFP表示绿色荧光蛋白的基因、PE/L表示启动子PE/L、p7.5表示启动子p7.5、gpt表示压力筛选基因gpt，Flanking right表示鼠痘病毒非编码区右同源臂。

图4为重组载体的双酶切鉴定后的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中泳道1为DL2000DNA marker，泳道2为重组载体双酶切后的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图5为重组鼠痘病毒(rECTV-EPG)(F12)感染CV-1细胞48小时后的扩繁结果。其中A为荧光显微镜下的观察结果，B为在明场视野下的观察结果。

图6为重组鼠痘病毒((rECTV-EPG))的PCR鉴定结果。其中泳道1、2、3样品的模板为野生型鼠痘病毒(ECTV-Moscow株)，泳道4、5、6样品的模板为重组鼠痘病毒(rECTV-EPG)。泳道1、4样品的引物为EVM-up-EPG-F和EVM-up-EPG-R，泳道2、5样品的引物为EVM-lo-EPG-F和EVM-lo-EPG-R，泳道3、6样品的引物为EVM-up-EPG-F和EVM-lo-EPG-R的扩增产物。

图7为野生型鼠痘病毒(ECTV-Moscow株)和重组鼠痘病毒(rECTV-EPG)的一步生长曲线。

图8为野生型鼠痘病毒(ECTV-Moscow株)和重组鼠痘病毒(rECTV-EPG)噬斑形成大小对比。A为野生型鼠痘病毒(ECTV-Moscow株)分别在荧光显微镜(左)和明场视野(右)下的噬斑大小；B为重组鼠痘病毒(rECTV-EPG)分别在荧光显微镜(左)和明场视野(右)下的噬斑大小。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。

下述实施例中的野生型鼠痘病毒Moscow株购自ATCC(VR-1374)，由本实验室保存并在CV-1细胞中扩增。

下述实施例中的CV-1细胞、BSR-T7细胞已记载于：Fan Yang,Jinlong Tan,Yongxiang Fang,Guohua Chen,Yongzhi Zhang,Qianqian Hu,Wuweiyi Han,YongshengLiu,Baoquan Fu,Zhizhong Jing,Weike Li.The Multiplicity of Infection ofRecombinant Vaccinia Virus Expressing the T7 RNA Polymerase Determines theRescue Efficiency of Vesicular Stomatitis Virus.Frontiers inMicrobiology.2022；13:846426.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

在DMEM中添加8％胎牛血清(FBS)，再加入1％青霉素/链霉素双抗，用于BSR-T7细胞培养。在RPMI1640培养基中添加10％ FBS，再加入1％青霉素/链霉素双抗，用于CV-1细胞培养。

下述实施例中的FBS、转染试剂Lipofectamine 2000、限制性内切酶均购自Invitrogen公司。GenRec Assembly Master Mix Kit试剂盒购自通用生物。

下述实施例中的pJS5载体质粒由加拿大国家微生物实验室曹景新研究员馈赠，已记载于：Kevin J Dueck,YuanShen(Sandy)Hu,Peter Chen,Yvon Deschambault,JocelynLee,Jessie Varga,Jingxin Cao.Mutational Analysis of Vaccinia Virus E3Protein:the Biological Functions Do Not Correlate with Its BiochemicalCapacity To Bind Double-Stranded RNA.Journal of Virology.2015；89(10):5382-5394.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、鼠痘病毒重组载体的构建

1、引物设计及目的序列扩增

根据鼠痘病毒ECTV-Moscow株在NCBI的基因组序列(GenBank：NC_004105)，以ECTV-Moscow株的基因组DNA为模板，选取一段非编码序列进行PCR扩增其左右同源臂，其中EVM-L-P1/EVM-L-P2(具体序列见表1)用于扩增目的序列左臂片段1(基因序列位于NC_004105的第189543–189897，参见序列表序列1)；EVM-R-P1/EVM-R-P2(具体序列见表1)用于扩增目的序列右臂片段2(基因序列位于NC_004105的第189950–190297，参见序列表中序列2)。PCR扩增产物结果见图1。

PCR反应体系(20μL)：无DNase/RNase水12.2μL，5×PrimeSTAR GXL buffer 4μL，2.5mM dNTP mixture 1.6μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase0.4μL，上、下游引物(10μmol)各0.4μL；DNA模板1μL；PCR扩增条件：95℃5min；98℃10sec，55℃15sec，68℃1min，30个循环；72℃10min。

以pJS5质粒为模板，设计引物EPG-P1/EPG-P2用于扩增一段含EGFP、痘苗病毒早晚期启动子PE/L、启动子P7.5、以及可用于压力筛选的大肠杆菌gpt基因序列的PCR产物，将产物命名为EPG基因簇(图2)。PCR反应体系同上述扩增同源臂体系。获得片段3(参见序列表中序列3)。

表1、引物序列

注：EVM-L-P1和EVM-R-P2中的大写字母的核苷酸序列均为线性化pBluescriptⅡSK+载体的末端序列，EVM-L-P2和EPG-P1中的单下划线序列为同源序列，EPG-P2和EVM-R-P1中的双下划线序列为同源序列；小写字母用于扩增目的基因序列。

2、多片段重组

根据重组病毒载体构建模式图(图3)，将pBluescriptⅡSK+质粒(上海生工生物)用BamHⅠ、NotⅠ进行双酶切，得到线性化pBluescriptⅡSK+载体，然后按照GenRec AssemblyMaster Mix Kit试剂盒说明书要求将载体和扩增的3种PCR产物进行重组。

将重组反应体系(具体如表2所示)充分混匀，使用枪头轻柔吸打，注意不要产生气泡。置PCR仪50℃反应60min。取上述反应液10μL加入DH-5α感受态细胞(Takara，货号9057)进行转化，取菌液均匀涂布在含有氨苄霉素抗生素(50μg/mL)的平板上，于37℃过夜培养。挑取单个菌落至LB培养基中37℃过夜培养，进行菌液PCR实验。再选取阳性菌液提取质粒用BamHⅠ，NotⅠ双酶切鉴定(图4)。取阳性克隆进行测序。将测序正确的阳性菌落扩大培养，去内毒素大提质粒以供后续使用。提取的质粒命名为pECTV-EPG。

表2、多段PCR产物重组体系

反应组分	用量
		左臂片段1	20ng
右臂片段2	20ng
		EPG片段3	120ng
线性化载体	100ng
		Master Mix	10μL
ddH2O	补足至20μL

重组质粒pECTV-EPG的结构描述如下：是将pBluescriptⅡSK+质粒的限制性内切酶BamHI和NotⅠ识别位点之间的片段替换为核苷酸序列为序列表中序列1、序列3和序列2依次连接的DNA分子，保持质粒pBluescriptⅡSK+质粒的其它核苷酸不变得到的重组质粒。

重组质粒pECTV-EPG含有如下DNA分子(图3)：含有鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列(Flanking left)、EPG基因簇表达盒(EGFP-PE/L-P7.5-gpt)和鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列(Flanking right)，其中EPG基因簇表达盒为包含所述绿色荧光蛋白基因(EGFP)、痘苗病毒早晚期启动子PE/L、启动子P7.5和大肠杆菌gpt基因表达所需的序列的DNA分子，所述绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列为序列3中第17-736位，所述痘苗病毒启动子PE/L的核苷酸序列为序列3中第744-833位，所述P7.5的核苷酸序列为序列3中第884-1282位，所述大肠杆菌gpt基因表达所需的核苷酸序列为序列3中第1283-1741位，所述鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列为序列1，所述鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列为序列2。

上述DNA分子中，鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列位于EPG基因簇表达盒的上游，鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列位于EPG基因簇表达盒的下游。

实施例2、重组鼠痘病毒(rECTV-EPG)的制备及鉴定

1、重组质粒pECTV-EPG转染

在6孔板中铺BSR-T7细胞，放于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中培养，待细胞融合度达90％时，换为无血清培养基，分别取pECTV-EPG质粒2μg、Lipofectamine2000 5μl加入到200μl Opti-MEM(Gibco，货号：31985070)中，轻弹混匀，室温孵育10min，将混合物逐滴加入到培养细胞中，晃动培养板，轻轻混匀，放入培养箱培养。转染后6小时换液，并用鼠痘病毒Moscow株(MOI：0.1)感染细胞，置5％二氧化碳培养箱，37℃培养至致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)达到80％左右，绿色荧光蛋白表达量最高(约3d)，收获细胞培养物，将细胞培养物反复冻融两次(第一代重组病毒)，保存于-80℃。

2、重组病毒筛选

1)重组病毒粗筛

将CV-1细胞铺6孔板，放于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中培养，待细胞融合度达90％时，换为无血清培养基，将上述收获的BSR-T7细胞裂解物(含重组病毒)超声2min，3000rpm/min离心10min，取上清500μL接入CV-1细胞，于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3-4天，每天观察细胞病变，待病毒噬斑出现合适数量，荧光明亮时，进行重组病毒筛选。将培养基上清弃掉，另取一6孔板，加无血清培养基2mL，直接用细胞铲将绿色荧光的病毒噬斑铲起放入另一无血清培养基的6孔板中，所有噬斑放入一个孔中。反复冻融三次后，取裂解物上清再次接入铺有CV-1细胞的6孔板，如此重复3-4次，待荧光表达稳定明亮，噬斑明显，准备进行后续重组病毒的gpt阳性筛选。

2)重组鼠痘病毒(rECTV-EPG)筛选

配制gpt压力筛选培养基：在RPMI 1640培养基中添加霉酚酸(25μg/mL)、黄嘌呤(250μg/mL)、次黄嘌呤(15μg/mL)及2％FBS。将CV-1细胞铺6孔板，待细胞汇合度达90％时，吸去上清，换为无血清培养基，取上述步骤1)重组病毒粗筛细胞裂解物上清500μL接入，感染2小时后，换为压力筛选培养基。观察细胞的CPE及荧光产生情况。待出现明显CPE，且荧光明亮时，收取细胞培养物，反复冻融两次，保存于-80℃，准备蚀斑纯化。

3)重组鼠痘病毒(rECTV-EPG)蚀斑纯化

将CV-1细胞铺6孔板，待细胞汇合度达90％时，将经过压力筛选的重组病毒产物进行倍比稀释，稀释至10^-5次方，每个孔接种稀释液1mL。接毒两小时后换为RPMI1640压力筛选培养基，在37℃、5％二氧化碳培养箱继续培养3-4天。待出现明显的噬斑，且荧光比较明亮时，准备蚀斑纯化。

提前配制2％低熔点琼脂糖(2g琼脂糖加到100mL超纯水中)，高压灭菌后备用。在煮沸的开水中将配制好的琼脂糖融化，按1:1的比例与2×DMEM均匀混合。弃掉6孔板内的培养基，将混合好的含琼脂糖的培养基均匀铺入6孔板内，每孔2mL，然后放入冰箱冷却15min。之后，于37℃培养箱中继续倒置培养3小时，以便准备挑取单克隆噬斑。取若干1.5mL离心管，每管加入1mL无血清培养基。使用1mL枪头，将枪尖折弯，并调至200μL。在荧光显微镜下吸取稀释度高且发出明亮荧光的单斑。每个单斑放入加有无血清培养基的离心管中，反复冻融3次。然后，准备铺有CV-1细胞的6孔板，待细胞汇合度达到90％时，将挑选的单克隆重组病毒细胞裂解物上清500μL接入6孔板的CV-1细胞。同样的方法继续进行单斑纯化。重复此过程8-10次，直至产生的CPE全部呈现绿色荧光，并且病毒荧光纯度达到100％(图5)。提取病毒基因组进行PCR鉴定，并将鉴定正确的重组病毒命名为重组鼠痘病毒rECTV-EPG。随后在CV-1细胞中进行扩繁。

3、重组鼠痘病毒rECTV-EPG重组病毒的鉴定

分别提取野生型鼠痘病毒ECTV-Moscow株及重组鼠痘病毒rECTV-EPG基因组DNA。用选取的ECTV非编码区的左右同源臂的两端以及EPG序列，设计上下游扩增鉴定引物。EVM-up-EPG用于扩增选取的非编码区上游部分序列及EPG部分上游序列，EVM-lo-EPG用于扩增EPG部分下游序列和选取的非编码区部分下游序列。EVM-up-EPG-F和EVM-lo-EPG-R用于扩增非编码上下游部分序列及中间EPG完整序列。引物序列见表3。

表3重组病毒鉴定引物

引物名称	序列(5’-3’)
		EVM-up-EPG-F	TGGAAGAGAGTCTCACGTAAGAT
EVM-up-EPG-R	CAGAACACCCCCATCGGCGAC
		EVM-lo-EPG-F	CCATGATATAGACGTTGTGGCT
EVM-lo-EPG-R	GTTAGATCGGCTCCTAATTCTA

PCR反应体系(20μL)：无DNase/RNase水12.2μL，5×PrimeSTAR GXL buffer4μL，2.5mM dNTP mixture 1.6μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.4μL，上、下游引物(10μmol)各0.4μL；DNA模板1μL。PCR扩增条件：95℃5min；98℃10sec，55℃15sec，68℃1min/kbp，30个循环；72℃10min。

结果显示：使用野生型鼠痘病毒ECTV-Moscow株基因组作为模板，未扩增出EPG上下游目的条带；以EVM-up-EPG-F和EVM-lo-EPG-R为引物，在750bp附近位置出现PCR产物条带，其大小和预期相符；另一方面，使用筛选出的重组病毒rECTV-EPG基因组作为模板，上游引物在约500bp的位置出现扩增条带，下游引物在约2000bp位置附近出现扩增条带，而使用EVM-up-EPG-F和EVM-lo-EPG-R为引物，成功扩增出超过2000bp大小的目的片段条带(图6)。将扩增产物进行测序，与目的序列完全一致，表明EPG序列成功插入到所选鼠痘病毒ECTV-Moscow的非编码区位置，重组鼠痘病毒rECTV-EPG构建成功。

重组鼠痘病毒rECTV-EPG含有绿色荧光蛋白基因。重组鼠痘病毒rECTV-EPG含有如下DNA分子，该DNA分子含有鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列、EPG基因簇表达盒和鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列，其中EPG基因簇表达盒包含绿色荧光蛋白基因、痘苗病毒启动子PE/L、启动子P7.5、大肠杆菌gpt基因表达所需的序列，所述绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列为序列3中第17-736位，所述痘苗病毒启动子PE/L的核苷酸序列为序列3中第744-833位，所述启动子P7.5的核苷酸序列为序列3中第884-1282位，所述大肠杆菌gpt基因表达所需的核苷酸序列为序列3中第1283-1741位，所述鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列为序列1，所述鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列为序列2。

上述DNA分子中，鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列位于EPG基因簇表达盒的上游，鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列位于EPG基因簇表达盒的下游。

实施例3、重组鼠痘病毒rECTV-EPG的复制动力学测定

1、重组鼠痘病毒rECTV-EPG的一步生长曲线的建立

利用已经培养好的CV-1细胞铺24孔板，待细胞汇合度达到90％时，分别使用制备的重组病毒rECTV-EPG和野生型鼠痘病毒ECTV-Moscow株感染CV-1细胞(MOI＝1)，吸附2小时后，去除病毒液，用无血清培养基洗涤细胞两次，换为含2％FBS的RPMI1640培养基，在感染后2、4、6、8、10、12、18、24、48小时，分别收集病毒液，并进行三次冻融处理。3000rpm/min离心10min，取上清液进行病毒滴度(TCID₅₀)测定，以绘制病毒的一步生长曲线。

将CV-1铺96孔板，待细胞融合度达到90％时，进行病毒感染。取上述的病毒液上清各100μL分别用无血清培养基进行10倍倍比稀释，连续稀释8个数量级。将细胞板中原培养液弃掉，用无血清RPMI1640培养基洗涤2次，吸干净后，各吸取100μL的病毒稀释液接种到培养好的细胞中，每个稀释度设8个重复。感染细胞2h后，将培养上清换成含有2％ FBS的RPMI1640培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养5-7天，每天定时观察并记录细胞病变。根据Reed&Muench法计算细胞中病毒的TCID₅₀。

结果如图7所示，重组鼠痘病毒rECTV-EPG和野生ECTV-WT的一步生长曲线基本一致，说明重组病毒rECTV-EPG与野生型ECTV-WT相比较，对病毒的生长增殖无影响。

2、重组鼠痘病毒rECTV-EPG感染细胞实验

用重组鼠痘病毒rECTV-EPG和野生型鼠痘病毒ECTV-Moscow株分别感染CV-1细胞(MOI 0.1)，感染2h后，吸去病毒液，换为含10％ FBS的羧甲基纤维素，37℃继续培养2-3d后，荧光显微镜下观察细胞病变。

结果显示(图8)：构建的重组病毒rECTV-EPG不影响ECTV病毒的噬斑大小，荧光明亮，噬斑明显，大小与野生型鼠痘病毒ECTV-Moscow株无明显区别。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (9)

1.重组鼠痘病毒，其特征在于，所述重组鼠痘病毒含有绿色荧光蛋白基因。

2.根据权利要求1所述的重组鼠痘病毒，其特征在于，所述重组鼠痘病毒含有DNA分子，所述DNA分子含有鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列、绿色荧光蛋白基因表达盒和鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列，所述绿色荧光蛋白基因表达盒包含所述绿色荧光蛋白基因、痘苗病毒早晚期启动子PE/L、启动子P7.5和大肠杆菌gpt基因序列，所述绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列为序列3中第17-736位，所述痘苗病毒启动子PE/L的核苷酸序列为序列3中第744-833位，所述P7.5的核苷酸序列为序列3中第884-1282位，所述大肠杆菌gpt基因的核苷酸序列为序列3中第1283-1741位，所述鼠痘病毒非编码序列的上游同源臂序列为序列1，所述鼠痘病毒非编码序列的下游同源臂序列为序列2。

3.权利要求2中所述的DNA分子。

4.重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的DNA分子。

5.生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下任一种：

1)含有权利要求4中所述重组载体的重组病毒；

2)含有权利要求4中所述重组载体的重组微生物；

3)含有权利要求4中所述重组载体的重组细胞；

4)含有权利要求4中所述重组载体的动物细胞系；

5)含有权利要求4中所述重组载体的动物组织；

6)含有权利要求4中所述重组载体的动物器官。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述重组病毒将权利要求4中所述的重组载体导入哺乳动物细胞系，然后感染野生型鼠痘病毒得到的重组病毒。

7.根据权利要求5或6所述的生物材料，其特征在于，所述哺乳动物细胞系为金黄仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞。

8.构建权利要求5-7中任一所述的生物材料的重组细胞的方法，包括将权利要求3或4所述的重组载体导入宿主细胞，所述宿主细胞被鼠痘病毒感染后，获得的重组细胞表达权利要求1所述的重组鼠痘病毒。

9.权利要求4所述的重组载体、权利要求5-7任一所述的生物材料，或权利要求8所述的方法在下述任一种中的应用：

1)制备鼠痘病毒的产品；

2)制备鼠痘病毒载体中的应用；

3)制备激活鼠痘病毒转录的产品；

4)制备筛选鼠痘病毒药物的产品。