CN108700583B - 用于检测神经毒素的装置及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测神经毒素或配体的装置，一种用于制造分析装置的方法，以及分析装置检测和量化神经毒素或配体的用途。本发明应用在医学领域和食品领域，特别是海产品的监测领域、淡水水库的监测领域；医学研究领域；以及生物分析和分子表征的领域。

Description

用于检测神经毒素的装置及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测神经毒素的装置，一种用于制造分析装置的方法，以及分析装置在检测和量化神经毒素中的用途。

本发明还涉及一种用于检测毒素和/或靶标离子型通道连接的受体和/或电压门控离子通道的配体的装置以及分析装置在检测和量化所述配体的用途。

本发明应用于医学领域和食品领域，特别是海产品监测的领域，淡水水库的监测领域；医学研究领域；以及生物分析和分子表征的领域。

在下面的描述中，在方括号([])之间的参考文献参见文末给出的参考文献列表。

背景技术

侧流测试是基于亲和抗原-抗体、酶促反应、DNA探针和适配体的使用的即用型低成本即时诊断装置(Chen and Yang(2015)Replacing antibodies with aptamers inlateral flow immunoassay.Biosensors&bioelectronics 71:230-242[1]；Millipore(2013)Rapid lateral flow test strips:Considerations for productdevelopment.In:Lit No TB500EN00MM,Rev C:Merck Millipore[2]；Ngom et al.(2010)Development and application of lateral flow test strip technology fordetection of infectious agents and chemical contaminants:A review.Analyticaland Bioanalytical Chemistry 397:1113-1135[3])。在侧流测试领域中，存在许多用于检测样品中的分子的装置/方法，特别是在医学领域中，例如用于妊娠的自动诊断，血糖的自我监测，传染病的早期诊断，病原体细菌的快速鉴定，食品污染物的检测，药物、重金属和毒素检测(列表并不限于此)(Anfossi et al.(2013)Lateral-flow immunoassays formycotoxins and phycotoxins:A review.Analytical and Bioanalytical Chemistry405:467-480[4]；Buhrer-Sekula et al.(2003)Simple and fast lateral flow testfor classification of leprosy patients and identification of contacts withhigh risk of developing leprosy.Journal of Clinical Microbiology 41:1991-1995.[5])。侧流测试是基于在样品流中游离的检测器粒子和结合膜带的捕获试剂在测试线处形成的络合物。通过颜色沉淀、荧光、化学发光、电化学反应，能可视化络合物探测器靶标(Marks et al.(2014)Electrochemical lateral flow bioassay andbiosensor.WO2014171891[6])。大多数侧流测试是基于免疫层析法，即，使用抗体作为检测器或靶标。本文提出了一种基于生物膜固定化的侧流测试，所述生物膜包括用于检测神经毒素的神经受体和/或离子通道。NeuroTorp侧流测试是基于亲和性毒素受体(TOXIN-RECEPTOR)。

根据最近的欧洲指令，指令2010/63/EU(7)，必须用预验证的功能方法(prevalidated functional method)代替“小鼠测试”这一用于监测海洋毒素的唯一官方测试。特别是在法国，自2010开始，用物理化学方法代替“小鼠测试”进行海产品健康监测(Closure of the Shellfish Farming Conference(10/15/2010).Speech by Bruno LeMaire,minister of food,agriculture and fisheries)(http://agriculture.gouv.fr/cloture-des-assises-de-la)[8]。

当海洋鞭毛藻类被有毒物质支配时，它们的开花形成所谓的有害藻华，对海洋生态系统、商业活动和公共健康构成危害。

这是因为鞭毛藻类的藻毒素能通过软体动物和鱼类积累，并通过矢量运输可到达人类(Fleming et al.(2006)Oceans and human health:Emerging public health risksin the marine environment.Marine Pollution Bulletin 53:545-560[9],Molgóet al.(2007)Cyclic imines:an insight into this emerging group of bioactive marinetoxins.In Phycotoxins:Chemistry and Biochemistry(Botana,L.M.,ed)pp.319-335,Blackwell Publishing Ltd,Iowa[10])。在2005年，法国浮游植物监测网络REPHY通过“小鼠测试”检测到来自阿卡雄盆地的样品中，软体动物受未知的速效神经毒素的污染。因此，法国政府下令禁止消费来自阿卡雄盆地的牡蛎和贝类，并不得不花费250万欧元援助法国阿卡雄地区贝类产业。后来，在阿卡雄盆地的牡蛎和贻贝中检出了螺旋内酯A和13-去甲基螺旋内酯C，这两者是由鞭毛藻亚历山大藻(Alexandrium ostenfeldii)产生的毒素(Amzilet al.(2007)Report on the first detection of pectenotoxin-2,spirolide A andtheir derivatives in French shellfish.Marine Drugs 5:168-179[11])。

环状亚胺毒素在腹膜内或口服给药后几分钟内因呼吸停止而表现出迅速的神经毒性和小鼠致死性。在ANR神经螺环状亚胺项目(由国家研究机构(ANR)资助的研究计划(PCV07-1 9441 7-神经螺环状亚胺))的背景下，建立了螺旋内酯和裸甲藻亚胺亚家族的环状亚胺毒素的作用机制(Bourne et al.(2010)Structural determinants inphycotoxins and AChBP conferring high affinity binding and nicotinic AChRantagonism.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,107:6076-6081[12])。环状亚胺类毒素家族的神经毒素包括螺旋内酯(spirolides)、环亚胺毒素(gymnodimines)、江鳐青毒素(pinnatoxins)、珍珠贝毒素(pteriatoxins)、原甲藻内酯(prorocentrolide)和螺旋原甲藻亚胺(spiroprorocentrimine)，是肌肉和神经元类型的烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的强有力拮抗剂，并且在皮摩尔和纳摩尔范围内具有亲和力(Bourne et al.(2010)[12],Kharrat etal.(2008)The marine phycotoxin gymnodimine targets muscular and neuronalnicotinic acetylcholine receptor subtypes with high affinity.Journal ofNeurochemistry,107,952-963[13],Aráoz et al.(2011)Total synthesis ofpinnatoxins A and G and revision of the mode of action of pinnatoxinA.Journal of the American Chemical Society,133:10499-10511[14])。

目前用于检测贝类产业中毒素(即，海洋藻类毒素)的方法主要是：

由于欧洲法规的改变，必须用不使用动物的测试代替“小鼠测试”。目前在法国，“小鼠测试”只用在监测由贝类毒素生物累积而导致的麻痹性甲壳类中毒的情况([8])。此外，该测试难以执行，并且需要相当大的基础设施(即动物房)来实现。此外，那些从事贝类养殖中工作的人怀疑该测试的有效性，并对获得的结果提出了质疑；

高效液相色谱(HPLC)。该方法昂贵，需要相当多的昂贵却不太灵敏的设备；

HPLC-质谱联用(LC-MS)。该方法昂贵，需要相当多的昂贵的设备和合格的人员来使用所述设备。尽管其具有高灵敏度和特异性，但该方法需要毒素标准物来校准用检测其的设备。此外，LC-MS方法在检测未知毒素方面的用途有限。自2010以来，LC-MS一直是检测或监测在法国受到监管的海洋藻类毒素的官方方法，因此将小鼠测试归入海产品麻痹性甲壳类中毒监测([8])。然而，LC-MS方法不可用于检测新毒素且也不能检测新型毒素；

微孔板受体结合测定法。微孔板受体结合测定法是基于nAChRs的竞争性激动剂/拮抗剂的作用机制来检测淡水和海洋神经毒素如蓝藻类毒素或环状亚胺毒素的靶向功能性方法(Aráoz et al.(2012)Coupling the Torpedo microplate-receptor bindingassay with mass spectrometry to detect cyclic imine neurotoxins.AnalyticalChemistry 84:10445-53[19])。微孔板受体结合测定法是一种用于直接在环境样品(诸如蓝藻丝、淡水或贝类提取物)中快速检测靶向nAChRs的淡水和海洋生物活性化合物的高通量方法，其具有最小的样品处理、减少的基质效应和毒素交叉反应性，可以促进使用基于质谱的方法(Aráoz et al.2012[19])。这种方法很难直接现场应用。

所有这些方法都必须在实验室中进行，因此这意味着需要长时间才能获得在样品中是否存在毒素的结果。这一点很重要，因为在食品，特别是贝类产品中，必须在不确定的时间(贝类生长环境中是否有毒素？)内停止销售并可能导致食品的破坏和/或合法宣传至消费者以停止食用贝类以避免公共卫生问题。

因此，确实需要找到一种简单且便宜的方法和/或装置，例如侧流测试来检测毒素，特别是神经毒素，例如来监测贝类工业中的神经毒性浮游植物或沿着观光海滩浴池的水质，以及来监测受污染的海产品。

特别地，需要找到能够在短时间内直接确定样品中是否有毒素的装置/方法(即，侧流测试)。

同样地，淡水水库中蓝藻的增殖对公共健康构成潜在威胁。这是因为蓝藻物种可以产生神经毒素；例如，其可能是鱼腥藻(Anabaena)或颤藻(Oscillatoria)属或其他产生类毒素-a或同型类毒素-a的有毒物种(Sivonen et al.(1999)Cyanobacterial toxins.InToxic cyanobacteria in water:a guide to their public health consequences,monitoring and management(Chorus I.,ed)pp.41-111,Bartram,J.E.&F.N.Spon,London[16])。诚然，在法国如Loue(2003)和Tarn(2002、2003和2005)等河流中已经发生许多狗喝了含有高含量的产生类毒素-a和同型类毒素-a的蓝藻的水的中毒事件，其中类毒素-a和同型类毒素-a是强有力的nAChR激动剂(Gugger et al.(2005)First report in a river inFrance of the benthic cyanobacterium Phormidium favosum producing anatoxin-aassociated with dog neurotoxicosis.Toxicon 45:919-928[17]；Cadel-Six et al.(2007)Different genotypes of anatoxin-producing cyanobacteria coexist in theTarn River,France.Applied and Environmental Microbiology 73:7605-7614.[18])。

用于检测蓝藻神经毒素的现有方法主要是：

HPLC：该方法昂贵，需要相当多的昂贵却不太灵敏的设备；

HPLC-质谱联用(LC-MS)。该方法昂贵，需要相当多的昂贵的设备和合格的人员来使用该设备。

微孔板受体结合测定法。微孔板受体结合测定法是基于nAChRs的竞争性激动剂/拮抗剂的作用机制来检测淡水和海洋神经毒素如蓝藻类毒素或环状亚胺毒素的靶向功能性方法(Aráoz et al.2012[19])。ABRAXIS已经使微孔板受体结合测定法商业化以用于检测环状亚胺毒素，并对条件进行了优化以用于检测类毒素-a(Rubio et al.(2014)Colorimetric microtiter plate receptor-binding assay for the detection offreshwater and marine neurotoxins targeting the nicotinic acetylcholinereceptors.Toxicon 91:45-56[20])。

现在技术中还存在用于检测溶液中化合物诸如13,19-二去甲基螺旋内酯C、裸甲藻亚胺A、13-去甲基螺旋内酯C(Fonfria et al.(2010)Detection of 13,19-didesmethylspirolide C by fluorescence polarization using Torpedo electrocytemembranes.Analytical Biochemistry,403:102-107[21],

et al.(2009)Detection of gymnodimine-A and 13-desmethyl spirolide C phycotoxins byfluorescence polarization.Analytical Chemistry 81:2708-2714[22])或蓝藻类毒素-a和同型类毒素-a(Aráoz et al.(2008)A non radioactive ligand-binding assay fordetection of cyanobacterial anatoxins using Torpedo electrocytemembranes.Toxicon,52:163-174[23])的方法。然而，这些方法具有低的检测灵敏度，并且检测所述化合物需要使用相当多的设备，如偏振荧光计和化学发光检测器，其昂贵且复杂，因此需要合格的人员来实施并使用。

因此，确实需要找到一种简单且便宜的方法和/或装置(即侧流测试)，例如功能测试来检测毒素，特别是神经毒素，例如来监测用于饮用水加工工业的淡水水库的神经毒性蓝藻和品质用于娱乐活动(皮划艇、钓鱼、水上运动)的淡水水体(湖泊、池塘、河流)或作为宠物和牲畜的饮用水的品质，以及来监测受污染的鱼类。

特别地，需要找到能够在短时间内直接确定样品中是否有毒素的侧流测试的装置/方法。

此外，还需要找到能够直接且在短时间内检测样品中是否存在毒素，特别是无论毒素是什么都能检测是否存在毒素，例如贝类毒素、麻痹毒素、蓝藻神经毒素和/或海洋藻毒素的方法/装置。

发明内容

本发明通过提供一种用于检测毒素，特别是神经毒素的体外装置来解决和克服现有技术的上述障碍和缺点，例如，如图1所示，该装置包括：

用于设置样品的区域(1)；

包括缀合物的区域(2)，所述缀合物包括与分子偶联的酶，所述分子与离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合或者与针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体结合，和/或所述缀合物包括与离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子；

包括以下的可视化区域(3)

测试区域(3a)，所述测试区域包括经片段化和分离的细胞膜，所述细胞膜包括固定在测试表面上的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，以及

对照区域(3b)，所述对照区域包含经片段化和分离的细胞膜，所述细胞膜包括与离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经标记的配体相关的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，所述配体固定在测试表面和/或包括离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的对照区域(3b’)上，所述配体直接固定在测试对照表面上。

换句话说，本发明还提供了一种用于检测样品中神经毒素或离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道配体的体外装置，包括：

用于设置样品的区域(1)；

包括以下的区域(2)

缀合物，包含与结合到离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的分子偶联的酶，或

缀合物，包含与结合到针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体的分子偶联的酶，和/或

缀合物，包含结合到离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的纳米金包被分子，或

缀合物，包含结合到离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的碳黑包被分子，或

缀合物，包含结合到离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的荧光分子；

包括以下的可视化区域(3)

测试区域(3a)，所述测试区域包含经片段化和分离的细胞膜，所述细胞膜包含固定在测试表面上的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，以及

对照区域(3b)，所述对照区域包含经片段化和分离的细胞膜，所述细胞膜包含与离子通道连接的受体的标记配和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，所述离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道被固定在测试表面上，或

对照区域(3b’)，所述对照区域包含离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，所述配体直接固定在测试表面上，

以及，

吸收区域(4)。

在本发明中，“关联”或“结合”例如是指：分子相互作用，诸如氢键、离子键、或范德华相互作用；生物相互作用，例如，特异性三维激素受体模式识别或抗体-抗原相互作用；静电相互作用；离子或分子的浓度梯度；换句话说，是指离子通道连接的受体结合位点或电压门控离子通道结合位点内的任何结构特征，以及毒素和/或配体内驱动毒素/配体与离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的具有高亲和力的结合位点例如通过氢键、范德华相互作用、疏水键、共价键、离子键结合和相互作用的结构特征。

在本发明中，本发明用于检测毒素的体外装置也被称为体外侧流测试装置。例如，其可以是图2A所示的装置。

在本发明中，样品可以是任何样品，例如本领域技术人员已知的可能含由毒素的环境样品。其可以是例如水的样品，例如来自污水处理工厂、海水样品、贝类养殖业的水样品、淡水水库的水样品、饮用水样品。其也可以是生物样品，例如任何生物流体的样品，例如血液样品、奶样品、尿液样品、从活检获得的生物组织样本。样品可以是贝类(例如牡蛎、蛤蜊、贻贝)的提取物，浮游植物(例如鞭毛藻类、硅藻类)提取物，蓝藻提取物，细菌提取物，植物提取物，脊椎动物和无脊椎动物提取物，例如鱼类提取物。

在本发明中，样品可以是任何样品，例如本领域技术人员已知的可能含有毒素、神经毒素和/或离子通道连接的受体的配体和/或电压门控离子通道的配体的环境样品。其可以是例如水的样品，例如来自污水处理工厂、海水样品、贝类养殖业的水样品、淡水水库的水样品、饮用水样品。其也可以是生物样品，例如任何生物流体的样品，例如血液样品、奶样品、尿液样品、从活检获得的生物组织样本。样品可以是贝类(例如牡蛎、蛤蜊、贻贝)的提取物，浮游植物(例如鞭毛藻类、硅藻类)提取物，蓝藻提取物，细菌提取物，植物提取物，脊椎动物和无脊椎动物提取物，例如鱼类提取物。

在本发明中，“提取物”是指从贝类，脊椎动物和/或无脊椎动物，从植物，从高等植物，从海洋植物，从大型藻类，从微藻，从鞭毛藻，从蓝藻，从细菌获得的任何部分/样品。

在本发明中，毒素可以是本领域技术人员已知的任何毒素，并且其可以结合和/或固定到离子通道连接的受体(例如配体门控离子通道连接的受体)和/或电压门控离子通道上。其可以是，例如可选自下组的毒素：该组包括由动物(例如蛇和/或青蛙)、植物、软体动物、微生物(例如鞭毛藻、硅藻、蓝藻)产生的神经毒素。其可以是例如速效的毒素，例如均作用于nAChRs的类毒素-a(例如来自有毒淡水蓝藻细菌)或江鳐青毒素A(例如来自有毒的鞭毛藻类)，或作用于电压门控钠通道的贝类毒素(例如来自淡水蓝藻或海水鞭毛藻)。这些毒素，例如类毒素-a、螺旋内酯、贝类毒素是“速效”毒素，是已知在小鼠腹腔内给药后几分钟内会诱发神经毒性症状的迅速发作和死亡。

根据本发明，神经毒素可能是本领域技术人员已知的任何神经毒素；例如，其可能是例如作用于烟碱乙酰胆碱受体的神经毒素；海洋浮游植物产生的神经毒素，诸如由亚历山大藻属的某些成员(例如，Alexandrium ostenfeldii)产生的螺旋内酯，由凯伦藻属的成员(例如，Karenia selliformis)产生的例如环亚胺毒素，裸甲藻亚胺的家族的藻毒素，例如产生江鳐青毒素的Vulcanodinium rugosum，珍珠贝毒素、原甲藻内酯或螺环原甲藻亚胺，其可以由多种浮游植物种类产生(Molgóet al.2007[10])。其也可能是蓝藻神经毒素，例如类毒素-a或同型类毒素-a，例如，由鱼腥藻属、丝囊藻属、筒孢藻属、微胞藻属、颤藻属、席藻属、浮游藻属和尖头藻属的成员产生，或江鳐青毒素，化学结构非常接近类毒素-a的海洋毒素，和/或能够作用于nAChRs的任何毒素(Aráoz et al.(2009)Neurotoxiccyanobacterial toxins.Toxicon 56:813-828[23],Sivonen et al.1999[16])。

在本发明中，离子通道连接的受体或电压门控离子通道可以是本领域技术人员已知的任何离子通道连接的受体或电压门控离子通道。其可以是选自包括配体门控通道受体的组的离子通道连接的受体，例如烟碱乙酰胆碱受体、甘氨酸受体和/或NMDA受体，或电压门控通道受体，例如电压门控钠通道、电压门控钾通道。优选离子通道连接的受体是烟碱乙酰胆碱受体。

在本发明中，离子通道连接的受体的配体可以是本领域已知的离子通道连接的受体的任何配体。例如，当离子通道连接的受体是烟碱乙酰胆碱受体时，配体可以选自蛇肽(例如，α-银环蛇毒素)，芋螺肽(例如α-芋螺毒素)的组。例如，当离子通道连接的受体是电压门控钠通道时，配体可以选自包含毒液肽(例如μ-芋螺毒素(KIIIA))和/或δ-芋螺毒素的组。例如，当离子通道连接的受体是电压门控钾通道时，配体可以选自包含蜘蛛毒素和/或蝎毒素(例如蜘蛛肽毒素和/或蝎肽毒素)的组。

在本发明中，离子通道连接的受体的配体可以是，例如针对受体离子通道内的神经毒素结合位点的抗体。

考虑其知识和现有技术，本领域技术人员能够选择与离子通道连接的受体或电压门控离子通道有关的配体。

在本发明中，离子通道连接的受体的配体和/或电压门控离子通道的配体可以用本领域技术人员已知的和适合的任何标签进行标记。其可以，例如选自包含生物素、荧光染料(例如rhodopsine、alexa-Fluor)、纳米金包被的配体、碳黑包被的配体、或荧光配体的组。在本发明中，与经标记的配体结合的缀合物分子可以是本领域技术人员已知的任何结合经标记的配体的分子。例如，当标签是生物素时，缀合物分子可以是链霉亲和素。

在本发明中，与结合离子通道连接的受体的经标记的配体结合的分子偶联的酶可以是本领域已知的任何适合的酶。其可以例如选自包含酶过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶的组。优选地，酶是碱性磷酸酶，其可以是例如市场上可得到的碱性磷酸酶，例如Promega或Sigma销售的碱性磷酸酶。

根据本发明，当使用酶时，酶的底物可以是本领域已知的任何底物。其可以是例如选自包含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(也称为膜TMB)、4-氯-1-萘酚/3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(也称为CN/DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(也称为AEC)、3,3-二甲氧基联苯胺-邻联茴香胺(也称为ODN)、5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(也称为BCIP)、硝基蓝四唑氯化物(也称为NBT)和5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(也称为BCIP)的混合物、萘酚As-Mx磷酸盐和4-氯-2-甲基苯重氮盐(也称为快速红色TR盐)的混合物、萘酚As-Mx磷酸盐和4'-氨基-2',5'-二乙氧基苯甲酰苯胺氯化锌的重氮盐(也称为快速蓝色BB盐)的混合物、5-碘-3-吲哚基-β-D-半乳吡喃糖苷(也称为紫-半乳糖)、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(也称为红-半乳糖)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(也称为玫瑰-半乳糖)、5-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(也称为蓝-半乳糖)、N-甲基吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(也称为绿-半乳糖)的组。考虑到其知识和现有技术，本领域技术人员能够选择关于偶联有与离子通道连接的受体的经标记的配体结合的分子的酶的底物。

在本发明中，与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的分子可以是纳米金包被的分子、碳黑包被的分子或荧光配体。

在另一个实例中，当用荧光染料经标记的配体时，不需要缀合物分子。通过荧光直接检测配体-受体复合物。以相同的方式，当用胶体金经标记的配体时，直接通过肉眼检测配体-受体复合物。

在本发明中，可以从本领域技术人员已知的任何细胞来获得包含离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经片段化和分离的细胞膜。其可以是例如从发电细胞细胞膜、天然哺乳动物神经元细胞、基因修饰的哺乳动物神经元细胞获得的经片段化和分离的膜。其可以是例如从分离的发电细胞；哺乳动物神经细胞，例如培养物中的哺乳动物神经元细胞；从培养物中的永生化人细胞，例如用给定的配体门控受体通道或电压门控离子通道转染，例如来自人胚胎肾细胞的HEK和/或来自哺乳动物永生化细胞系(来自中国仓鼠卵巢细胞的CHO)获得的经片段化和分离的膜。其可以是例如来自电鳐的发电细胞，例如电鳐科(Torpedoesidae)家族的物种，例如电鳐(Torpedoes)，或电鳗科(Electrophoridae)的物种，例如电鳗(Electrophorus electricus)的经片段化和分离的细胞膜。其可以是例如来自可以是来自于这样细胞的经片段化和分离的细胞膜：这样的细胞来源于电鳐发电器官，例如电鳐(electric ray)的发电细胞，例如选自电鳐科(Torpedinidae)家族，例如选自包含亚丁湾电鳐(Torpedo adenensis)、埃及电鳐(Torpedo alexandrinsis)或亚历山大电鳐(Alexandrine Torpedo)、安德森电鳐(Torpedo andersoni)或佛罗里达电鳐(FloridaTorpedo)、博乔电鳐(Torpedo bauchotae)、加州电鳐(Torpedo californica)或太平洋电鳐(Pacific electric ray)、纽西兰电鳐(Torpedo fairchildi)、黑斑电鳐(Torpedofuscomaculata)、麦克电鳐(Torpedo mackayana)、麦氏电鳐(Torpedo macneilli)、石纹电鳐(Torpedo marmorata)、或大理石电鳐(marbled electric ray)或大理石电鳐(marbledTorpedo ray)、小盘电鳐(Torpedo microdiscus)、珍电鳐(Torpedo nobiliana)或大西洋电鳐(Atlantic electric ray)、魔电鳐(Torpedo panthera)或豹纹电鳐(PantherTorpedo ray)、秘鲁电鳐(Torpedo peruana)、半海电鳐(Torpedo semipelagica)、云纹电鳐(Torpedo sinuspersici)、休氏电鳐(Torpedo suessii)、东京电鳐(Torpedotokionis)、电鳐(Torpedo Torpedo)或普通电鳐，和特里梅电鳐(Torpedo tremens)的组。优选使用的细胞是石纹电鳐(Torpedo marmorata)或加州电鳐(Torpedo californica)的细胞。

其可以是例如来自本领域技术人员已知的任何哺乳动物神经元细胞的经片段化和分离的细胞膜。其可以是例如从活检中获得的神经元细胞，神经元细胞系，例如用表达离子通道连接的受体的表达载体遗传修饰的神经元细胞。根据PCT公开WO 2012/101378中所述的方法和过程，可以获得例如来自发电细胞的经片段化和分离的细胞膜。

在本发明中，测试表面可以是本领域技术人员已知的任何材料的支撑物，例如选自包含吸收性纸、棉花、纤维素、玻璃纤维和硝化纤维素膜的组。其可以是例如用硼硅酸盐玻璃纤维制造的过滤膜。其可以是例如可商购的玻璃纤维支撑物，例如由Sigma出售的不含粘合剂，等级为GF/C、GF/A、GF/B的Whatman(注册商标)玻璃微纤维过滤器。其可以是例如高孔隙率的尼龙或聚碳酸酯膜，例如包括直径为1μm至8μm，例如1μm、3μm、5μm或8μm孔径的孔隙。其可以是例如高孔隙率的硝化纤维素膜，例如包括直径为1μm至8μm，例如1μm、3μm、5μm或8μm孔径的孔。其可以是例如由Sartorious商品化的高孔隙率的硝化纤维素膜。其可以是例如由Advantec商品化的混合纤维素酯膜、乙酸纤维素膜、亲水性PTFE膜、尼龙或聚碳酸酯膜。优选地，测试表面是玻璃纤维支撑物，特别是硼硅酸盐玻璃微纤维过滤器。

在本发明中，测试表面可以是平坦支撑物或具有特定设计，例如矩形、圆形的支撑物。

测试表面可以是例如纤维支撑物，例如包括直径为0.8μm至8μm，例如1μm至1.6μm的孔。

在本发明中，测试表面的厚度可以为0.08mm到0.350mm，例如0.100mm至0.500mm，例如等于0.26mm。

有利地，本发明人出乎意料地证明，当测试表面是孔径为1μm至6μm的纤维支撑物时：i)其有利地能够将经片段化和分离的细胞膜固定到其表面上，并且ii)有利地能够将电鳐受体集中在一个窄带中。本发明人还惊人地证明，当经片段化和分离的细胞膜被固定在玻璃纤维支撑物上时，其能够使蛋白质，特别是存在于膜片段中的离子通道连接的受体完全保持它们与其任何配体结合性质的生物学活性。

根据本发明，在本文中也称为设定区域(1)的区域(1)可以是适合于施加或接收样品的任何区域。该区域可以是本领域技术人员已知的任何形式，例如库、杯状(cupule)、孔、芯状或平坦表面。

根据本发明，设置区域(1)可以移动和/或连接到区域(2)或(3)。当区域(1)可移动时，其可以是例如用于取样并将其施加至区域(2)。当区域(1)连接到区域(2)或(3)时，可将其直接浸入包含样品的容器中和/或可将样品施加在该区域。

有利地，根据本发明，区域(1)和(2)位于相同的支撑物上。

根据本发明，区域(1)至(3)的材料/测试表面可以相同或不同。根据本发明，材料/测试表面如上所定义。优选地，设置区域(1)可以是例如玻璃纤维支撑物，如上所述用硼硅酸盐玻璃纤维或高孔隙率的尼龙或聚碳酸酯膜制造的过滤膜。更优选地，材料区域(1)至(3)是玻璃纤维支撑物。

令人惊讶地，本发明人已经证明，使用玻璃纤维支撑物能够将包含离子通道连接的受体的经片段化和分离的细胞膜固定和浓缩到其表面上，不会产生受体活性的任何劣化以及也包含离子通道连接的受体的经片段化和分离的细胞膜的结构的损坏。换句话说，令人惊讶地，发明人已经证明固定在玻璃纤维支撑物上的受体保持其所有的生物学性质；特别是其结合位点仍然有效。

在本发明中，缀合物区域(2)可以包含一定量的酶，所述一定量的酶与结合离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的分子偶联，或者与结合离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的纳米金包被的大分子偶联或与结合离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的碳黑包被的大分子偶联或与针对离子通道连接的受体的神经毒素结合位点的抗体偶联。考虑到其知识，本领域技术人员能够选择待施加到缀合物区域(2)的包含与分子偶联的酶的溶液的体积来获得相应的蛋白质量以可视化复合物受体-配体。

在本发明中，测试区域(3a)可以包含一定量的经片段化和分离的细胞膜，例如电鳐发电细胞细胞膜，其总蛋白质浓度范围为10μg/mL～500μg/mL。换句话说，可将测试区域(3a)中包含离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经片段化和分离的细胞膜从包含浓度为10μg/mL～500μg/mL总蛋白质的经片段化和分离的细胞膜的原液固定并浓缩到窄测试区域(3a)。考虑到其知识，本领域技术人员能够选择待施加到测试区域(3a)的包含离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经片段化和分离的细胞膜的溶液体积以获得相应量的蛋白质。

在本发明中，测试对照区域(3b)可包含一定量的经片段化和分离的细胞膜，其包含与经标记的配体结合的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，具有10μg/mL～500μg/mL总蛋白质。换句话说，可将对照区域(3b)中包含离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经片段化和分离的细胞膜从包含浓度为10μg/mL～500μg/mL总蛋白质的经片段化和分离的细胞膜的原液固定并浓缩到窄对照区域(3b)。考虑到其知识，本领域技术人员能够选择待施加到测试区域(3a)的包含离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经片段化和分离的细胞膜的溶液体积以获得相应量的蛋白质。

在本发明中，对照区域(3b')可以包含一定量的10μg/mL～500μg/mL离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体。在对照区域3b'中离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体可以是如上述所定义的离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体。其可以是例如可与链霉亲和素、纳米金包被的缀合物或碳黑包被的缀合物结合的生物素化分子。

根据本发明，上述各个区域(1)至(3)可以附接到固体支撑物(例如层压卡片)和/或包括在容器中，该容器包括在区域(3)的层面上能够使可视化结果的窗户以及在区域(1)的层面上能够设置样品的孔。

根据本发明，该装置还可以包括吸收区域(4)，例如如图1所公开的。根据本发明，吸收区域(4)可以是本领域技术人员已知的任何吸收性固体支持物。其可以例如是吸收性吸墨纸。其还可以例如是吸收性吸墨纸、吸收性滤纸和/或其混合物。

根据本发明，例如包含吸收性滤纸的吸收区域(4)可通过例如毛细管作用驱动被设置的样品(也被称为移动相)的运动。

在本发明的侧流测试装置中，区域(1)和区域(2)的支撑物可以在其一端重叠，并且区域(2)的另一端可以与区域(3)的一端重叠。当施加样品时和/或当区域(1)的自由端浸入样品中时，各个区域(1)至区域(3)的重叠有利地使样品能够通过毛细管作用而在各个区域中迁移。优选地，区域(1)、区域(2)和区域(3)布置在相同的测试表面上。例如，图2表示本发明的侧流测试装置的示例。

优选地，吸收区域(4)与区域(3)的自由端重叠。因此，区域(4)能够使通过毛细管作用而使样品穿过装置的各个区域的迁移加速。有利地，区域(4)使得能够吸收样品的多余液体。

根据本发明，各个区域(1)至(4)可以独立地被保护膜覆盖。该保护膜例如可为塑料膜，例如聚氯乙烯(PVC)膜；或可生物降解的膜，例如聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)或聚乳酸(PLA)膜。

有利地，该膜独立地保护本发明装置的各个区域。

本发明的另一个目的是一种制造分析装置的方法，该分析装置包括固载和/或固定在其表面上的膜片段，该方法包括以下步骤：

a.通过过滤使包含经片段化和分离的细胞膜的第一溶液穿过测试表面来将所述经片段化和分离的细胞膜附着并浓缩至装置的测试表面；

b.附着与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体相关的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，所述配体通过过滤使包含所述与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体相关的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的第二溶液通过测试表面而被固定并浓缩至装置的测试表面；或者附着离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，所述配体直接固定在测试对照表面上；

c.通过将测试表面浸入包含缀合物的第三溶液中来附着所述缀合物，所述缀合物包含酶，所述酶与结合至离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的分子偶联或者与结合至针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体的分子偶联；和/或所述缀合物包括与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子；

d.干燥测试表面；

e.将测试表面组装并附接至固体支撑物。

换句话说，本发明的另一个目的是用于制造分析装置的方法，该分析装置包括固载在其表面上的膜片段，该方法包括以下步骤：

a.通过过滤使所述经片段化和分离的细胞膜的第一溶液穿过测试表面来将所述经片段化和分离的细胞膜附着并浓缩至装置的测试表面，

b.附着并浓缩与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，所述离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道通过过滤使包含所述与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的第二溶液穿过测试表面而被固定至装置的对照测试表面；或者

附着离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，所述配体直接固定在测试对照表面上；

c.通过将测试表面浸入包含缀合物的第三溶液中来附着所述缀合物，所述缀合物包含酶，所述酶与结合与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的分子偶联或者与结合针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体的分子偶联；和/或所述缀合物包括与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子；

d.干燥测试表面；

e.将测试表面组装并附接至固体支撑物。

在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何过滤方法来进行将经片段化和分离的细胞膜附着并浓缩至测试表面上的步骤a。例如可通过将第一溶液倾倒到测试表面上并使溶液迁移穿过测试表面来进行。例如，可将第一溶液倾倒到测试表面的一个面上，直到溶液完全从所述表面迁移到其相反面并被消除。在其上倾倒第一溶液的表面由此限定为测试表面的顶面。例如，溶液可以倾倒在测试表面的一个面上并在真空压力下迁移。有利地，当施加真空时，其能够加速溶液从一面到另一面的迁移。例如，步骤a可以使用如图3所示的四窗口狭槽装置来进行。有利地，使用如图3所示的四窗口狭槽装置能够均匀设置和浓缩经片段化的细胞膜。

根据本发明，在设置受体之后，附着步骤a可进行预定的时间；例如，该步骤可以进行至少4小时，且优选至少过夜；例如，步骤c)可以进行4至12小时。

根据本发明，附着步骤a可在特定温度下进行；例如，该步骤可以在至少25℃下进行，优选至少在37℃下进行；例如，步骤a)可以在25℃至37℃下进行。

有利地，当步骤a)在室温(例如25℃至35℃)下进行时，其允许测试表面干燥。

根据本发明，附着步骤a可能涉及测试区域(3a)的制造。

在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何过滤方法来进行将与离子通道连接的受体的经标记的配体相关的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道附着到测试表面上的步骤b。例如，可通过将第二溶液倾倒到测试表面上并使溶液迁移穿过测试表面来进行。例如，可将第二溶液倾倒到测试表面的一个表面上，直到溶液完全从所述表面迁移到其相反面并且被消除。在其上倾倒第二溶液的表面由此限定为测试表面的顶面。

有利地，可通过施加真空下的任何过滤方法来进行将与离子通道连接的受体的经标记的配体相关的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，或者将离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道附着在测试表面上。有利地，当在真空下进行将与离子通道受体和/或电压门控离子通道的经标记的配体相关的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道或者将离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体附着至测试表面的步骤b时，真空允许驱动溶液迁移通穿过测试表面。在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的且适用于此的任何装置来施加真空。其可以是例如狭槽装置，例如如图3所示的狭槽装置。

根据本发明，附着步骤b可以进行预定的时间；例如，该步骤可以进行至少4小时和优选至少过夜；例如，步骤b可以进行4至12小时。

根据本发明，附着步骤b可以在特定温度下进行；例如，该步骤可以在至少25℃下进行，且优选至少在37℃下进行；例如，步骤b可以在25℃至37℃下进行。

换句话说，步骤b可包括附着和浓缩与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，所述经标记的配体固定在离子通道连接的受体上或电压门控离子通道上，其本身通过过滤使第二溶液穿过测试表面而固定在限定为对照区域的表面上，所述第二溶液包含与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道；或者，步骤b可包括附着离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，所述配体通过过滤使包括配体的第二溶液穿过测试表面而将所述配体直接固定在限定为测试对照区域或对照区域(3b')的测试表面上，所述配体被直接固定在测试对照区域。

根据本发明，附着步骤b可能涉及测试区域(3a)的制造。

在本发明中，步骤a和/或步骤b可以在真空下进行。换句话说，当在步骤a和/或步骤b期间倾倒第一溶液和/或第二溶液时，可以在真空下进行，其有利地能够加速溶液穿过测试表面的迁移和/或加速测试表面的干燥。

在本发明中，可以通过将测试表面浸入第三溶液或者通过本领域技术人员已知的任何方法来进行附着缀合物的步骤c；所述缀合物包含酶，所述酶与结合离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的分子偶联或者与结合针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体的分子偶联；和/或所述缀合物包括与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子。上述浸入可例如通过将将测试表面全部或部分浸入第三溶液来进行。

换句话说，可以通过将测试表面浸入第三溶液或者通过本领域技术人员已知的任何方法来进行附着缀合物的步骤c；所述缀合物包含酶，所述酶与结合离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的分子偶联或者，所述缀合物与针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体结合，和/或选自包含与离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子的组。上述浸入可例如通过将测试表面全部或部分浸入第三溶液来进行。

根据本发明，附着步骤c可以进行预定的时间；例如，该步骤可以进行至少4小时和优选至少过夜；例如，步骤c可以进行4至12小时。

根据本发明，附着步骤c可以在特定的温度下进行；例如，该步骤可以在至少25℃下进行，且优选至少在37℃下进行；例如，步骤c)可在15℃至37℃下进行。

在本发明中，测试表面如上所限定。

在本发明中，经片段化和分离的细胞膜如上所限定。

在本发明中，离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道如上所限定。

在本发明中，离子通道连接的受体的配体和/或电压门控离子通道的配体如上所限定。

在本发明中，离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体如上所限定。

在本发明中，与结合离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的分子偶联的酶如上所限定。

在本发明中，酶的底物如上所限定。

在本发明中，包含经片段化和分离的细胞膜的第一溶液可以是本领域技术人员已知的适合于包含经片段化和分离的细胞膜的任何溶液。其可例如为pH为6.5至10，例如pH等于7.5的溶液。其可例如为包含150mM氯化钠、50mM Tris-HCl或Tris、pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲(TBS)溶液，包含130mM氯化钠、10mM磷酸钠、pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液，或包含150mM氯化钠、100mM碳酸钠、pH 9.5的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液。第一溶液可进一步包含甘氨酸，例如1至10mM甘氨酸，优选5mM甘氨酸。

根据本发明，第一溶液中的总蛋白质浓度可以为10μg/mL～500μg/mL，例如25μg/mL～100μg/mL。根据本发明，第一溶液的离子强度可以为0.1至0.7，优选0.15至0.2。换句话说，第一溶液的离子强度可以为0.1mol/L～0.7mol/L，优选0.15mol/L～0.2mol/L。

在本发明中，包含与离子通道受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体相关的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，或者包含离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的第二溶液可以是本领域技术人员已知的适合于包含与离子通道受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体相关的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，或者包含离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经标记的配体的任何溶液。其可例如为pH为6.5至9，例如pH等于7.5的溶液。根据本发明，第二溶液中的总蛋白质浓度可以是10μg/mL～500μg/mL，例如75μg/mL～150μg/mL。

根据本发明，第二溶液的离子强度可以为0.1至0.7，优选0.15至0.2。换句话说，第二溶液的离子强度可以为0.1mol/L至0.7mol/L，优选0.15mol/L至0.2mol/L。

在本发明中，包含缀合物的第三溶液可以是本领域技术人员已知的任何溶液，所述缀合物包含与分子偶联的酶，所述分子与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合或者与针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体结合，和/或所述缀合物包含与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子。

换句话说，包含缀合物的第三溶液可以是本领域技术人员已知的任何溶液，所述缀合物包含与分子偶联的酶，所述分子与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合或者与针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体结合，和/或所述缀合物选自包括与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子的组。

其例如为pH为6.5至9，例如pH等于7.5的溶液。

根据本发明，第三溶液中的总蛋白质浓度可以是10μg/mL～500μg/mL，例如50μg/mL～100μg/mL。

根据本发明，第三溶液的离子强度可以为0.1至0.7，优选0.15至0.2。换句话说，第三溶液的离子强度可以为0.1mol/L至0.7mol/L，优选0.15mol/L至0.2mol/L。

根据本发明，在进行分析装置的制造方法之前，可稀释第三溶液。例如，第三溶液可以从1/50稀释到1/5000。

根据本发明，在步骤a和/或步骤b和/或步骤c之后，该方法可以包括：额外的步骤d，干燥测试表面。

干燥步骤d可以通过本领域技术人员已知的任何干燥方法来进行。其例如可为加热步骤，例如在25℃～37℃之间的温度下的的加热步骤。

在本发明中，步骤d可以通过本领域技术人员已知的且适合于其的任何加热方法来进行。其例如可通过将测试表面在温度高于25℃，优选高于30℃的烘箱中放置至少一小时，例如12小时来进行。步骤d例如可以在室温下在实验台上的干燥器中进行。

有利地，令人惊讶的是，发明人已经证明支撑物和膜片段的脱水改善了经分离和片段化的膜(特别是电鱼发电细胞膜片段)在玻璃纤维支撑物(特别是硼硅酸盐玻璃纤维上)上的永久固定。特别地，发明人已经证明永久固定的改善可能是由于干燥时的疏水相互作用。

根据本发明，在步骤a和/或步骤b和/或步骤c之前，该方法可以包括：额外步骤a'，浸泡测试表面。

浸泡步骤a'可以通过将测试表面倒入缓冲溶液，例如pH 7.5的缓冲溶液中，例如Tris缓冲溶液(TBS)中，如TBS(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)来进行。

根据本发明，附着步骤可以在各自限定不同区域(1)至(3)的不同测试表面上进行或者在一个测试表面上进行，在这一个测试表面上，所述附着在同一表面上但在所述测试表面的不同的隔开的位置上进行。

当附着步骤在分别限定不同区域(1)至(3)的单独的测试表面上进行时，本发明的方法可以进一步包括：步骤e，将不同的测试表面组装并附着在固体支撑物上。例如，分别限定的区域(1)至(3)的支撑物的测试表面，所述测试表面区域(1)和(2)可以相关联的，以便在它们的一端重叠，区域(2)的另一端与区域(3)的一端重叠。当施加样品和/或当区域(1)的自由端浸入样品中时，各个区域(1)至(3)的重叠能够有利地通过毛细管作用使样品在各个区域中迁移。

根据本发明，上述附着步骤可以在具有各个区域(1)至(3)的单一测试表面上进行，上述区域(1)至(3)可以附着至固体支撑物(例如层压卡)和/或包括在容器中，所述容器包含在所述区域(3)的水平处以使结果能够可视化的孔口和在所述区域(1)的水平处用于设置样品的孔。因此，当附着步骤在具有不同区域(1)至(3)的单一测试表面上进行时，该方法可以进一步包含：额外步骤e，将测试表面组装并附着在固体支撑物上。

根据本发明，在固体支撑物上组装和附着不同的测试表面步骤e可以在固体塑料支撑物上进行。

根据本发明，步骤e可以包括：在固体支撑物的顶部上附着和组装区域(2)，其中，测试表面的近端中的一个包括区域(3)；在所述固体支撑物的另一近端处附着和组装用于设置样品的区域(1)，所述固体支撑物的另一近端与(2)的一端重叠；以及附着和组装吸收区域4。

根据本发明，固体支撑物可以是塑料固体支撑物，测试表面可为如上限定的玻璃纤维，以及吸收区域(4)可为吸收性滤纸。

在图2中示出了根据本发明可获得的体外装置的实例。

本发明的装置和/或能够通过本发明的方法获得的装置可用于检测和/或量化神经毒素。

特别地，本发明的侧流测试装置允许快速且简便地检测样品中的神经毒素。

因此，本发明的另一个目的是本发明的体外装置和/或能够通过本发明的方法获得的体外装置在检测和/或量化样品中的神经毒素的用途。

在本发明中，神经毒素如上所限定。

在本发明中，样品如上限定。

本发明人还证实，本发明的装置(也被称为本发明的侧流测试装置)可用于检测存在于经片段化和分离的膜中的离子通道连接的受体的配体和/或电压门控离子通道的配体。

因此，本发明的目的是本发明的体外装置和/或能够通过本发明的方法获得的体外装置在检测存在于经片段化和分离的膜中的离子通道连接的受体的配体和/或电压门控离子通道的配体中的用途。

有利地，当经分离和片段化的膜来自电鳐鱼时，可使用本发明的装置来纯化和鉴定烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)配体。有利地，电鳐发电细胞膜片段在表面上的强粘附性使得能够附着并捕获与电鳐nAChRs相互作用的至少一种或多种配体。例如在用洗涤溶液(例如甲醇)洗涤根据本发明的装置之后，可进行对附着的配体的回收，或者使用具有由本领域技术人员预先确定的离子强度、pH和去污剂浓度的其他缓冲液或竞争毒素来进行，从电鳐nAChR释放配体。

本发明的另一目的是使用本发明的装置体外检测神经毒素的方法，所述方法包括以下步骤：

a.将待测样品与标记毒素，特别是标记的神经毒素一起设置在设置区域(1)上，

b.设置包含与分子偶联的酶的底物的溶液，所述分子与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合或者与针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体结合；和/或设置包含纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子的溶液，所述纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子与离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合，和

c.分析测试区域和对照区域，当测试区域上的结果不同于对照区域上的结果时，检测到神经毒素。

根据本发明，分析步骤c)可以通过适用的且本领域技术人员已知的任何方法来进行。其可例如通过用肉眼或用侧流测试读取器进行监测/量化来进行。

使用本发明的装置体外检测神经毒素的方法可包括：检测神经毒素的另一步骤d)，当测试对照区域有颜色并且测试区域没有颜色时，检测到神经毒素。

换句话说，检测神经毒素的另一步骤d)能够推断样品中是否存在神经毒素。

根据本发明，基于标记毒素的竞争性结合抑制，测试区域上缺乏有色带则表示存在神经毒素(即螺旋内酯或类毒素-a)。当测试区域和对照区域有颜色时，则不存在神经毒素；当测试区域按照相同的方式与对照区域相比没有颜色时，即没有着色或颜色的强度小于对照区域，则为阳性，即有神经毒素进入样品。图2B、图4A、图4B和图4C表示用根据本发明的方法和/或装置获得的结果的实例。

附图说明

图1是用于检测神经毒素的装置的示意图，其中，R表示电鳐烟碱乙酰胆碱受体，L表示生物素化的烟碱配体，T表示针对烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的毒素，S表示链霉亲和素缀合物和TS表示测试表面。在该实例中，在GF/C膜的对照线中固定并浓缩与生物素化的配体缀合的nAChR。而在GF/C滤膜的测试线中，仅浓缩并固定nAChR。缀合物垫定位在样品垫和GF/C滤膜之间。每当施加含有生物素化的配体和烟碱毒素的样品时，烟碱毒素与受体的结合位点反应，使生物素化配体朝向吸水垫迁移。缀合物的底物的添加导致在对照区域中形成有色沉淀。

图2A表示该装置的侧面示意图。在GF/C膜的对照线中固定并浓缩有与生物素化配体缀合的nAChR。而在GF/C滤膜的测试线中，仅浓缩并固定nAChR。样品、经标记的配体和缀合物底物施加至的样品垫定位在装置的最左端。缀合物垫定位在样品垫和GF/C滤膜之间。吸水垫占据该装置的最右端。

图2B显示不含毒素但存在13-去甲基螺旋内酯C的对照测试的照片。每当施加含有生物素化的配体和无毒样品的样品时，烟碱标记的配体与固定在测试线中的受体的结合位点反应。缀合物底物的添加导致在测试线和对照线中形成有色沉淀物(照片中的顶装置)。每当施加含有生物素化的配体和烟碱毒素的样品时，烟碱毒素与受体的结合位点反应，将生物素化配体向吸水垫迁移。缀合物底物的添加导致在对照线中形成有色沉淀，并且在测试区域中有无色或较淡的色带(照片的底部装置，其中显示了2.5μM 13-去甲基螺旋内酯C的影响)。2分的欧元硬币用作设备的尺寸参考。

图3表示改造自Hoeffer(商标)48孔狭槽印迹装置的4孔狭槽印迹装置的示意图，用于通过真空将富含受体的膜片段附着和浓缩到固体支撑物上，来制造根据本发明的装置。狭槽(slot)1和3专门用于“对照区域”。狭槽2和狭槽4专门用于“测试区域”。干燥后，过滤膜(11.5×8.4cm)能够制造40个根据本发明的装置(包括对照区域和测试区域的2.5×0.45cm条带)

图3A表示改造自Hoeffer(商标)48孔狭槽印迹装置的4孔狭槽印迹装置的第三层的顶视图的示意图，图3B表示改造自Hoeffer(商标)48孔狭槽印迹装置的4孔狭槽印迹装置的第三层的底视图的示意图，图3C表示改造自Hoeffer(商标)48孔狭槽印迹装置的4孔狭槽印迹装置的第二层的顶视图的示意图，图3D表示改造自Hoeffer(商标)48孔狭槽印迹装置的4孔狭槽印迹装置的第二层的底视图的示意图，图3E表示改造自Hoeffer(商标)48孔狭槽印迹装置的4孔狭槽印迹装置的第一层的顶视图的示意图。

图4表示通过本发明的侧流试验的α-银环蛇毒素、江鳐青毒素-G和13,19-二甲基螺旋内酯C的剂量-反应检测的照片。在这种情况下，使用了两条测试线(在这些实施例中没有对照线)。

在图4A中，检测到在0.01μM至10μM范围内的不同量的蛇毒素α-银环蛇毒素。在没有添加烟碱毒素的对照测试(Ctrl)中，两条测试线均被着色。在较高浓度(10μM和1μM)下，两条测试线均为无色，表示100％抑制。在较低的浓度下，两条测试线都是有色的，但是与对照测试(Ctrl)相比强度较低。

在图4B中，检测到在0.01μM至100μM范围内的不同量的鞭毛藻毒素江鳐青毒素-G。在没有添加烟碱毒素的对照测试(Ctrl)中，两条测试线均被着色。在较高浓度(100μM和50μM)下，两条测试线均为无色，表示100％抑制。在较低浓度(0.001μM至1μM)下，只有上部测试线被着色，但是与对照测试(Ctrl)相比强度较低。

在图4C中，检测到在0.01μM至10μM范围内的不同量的鞭毛藻毒素13,19-二甲基螺旋内酯C。在没有添加烟碱毒素的对照测试(Ctrl)中，两条测试线均被着色。在所有测试浓度下，13,19-二甲基螺旋内酯C有效地抑制经标记的配体的结合：在1μM和10μM下100％抑制；且在较低浓度(0.01μM至1μM)下，强抑制。

具体实施方式

实施例1：制造用于检测神经毒素的装置的方法

在下述的实施例中，使用的产品和设备如下所示：

生物素化的α-银环蛇毒素(分子探针，Invitrogen，USA)

与链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(Streptavidin-AP，Promega，Madison，WI，USA)

α-银环蛇毒素(Sigma-Aldrich，USA)

TBS缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.5)

TBS-BSA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5％BSA，pH 7.5)

Western Blue(注册商标)(Promega，WI，USA)

滤纸玻璃纤维GF/C(Whatman，Maidstone Kent，UK)

滤纸纤维素(1mm厚，Whatman，UK)

头带双面胶

毒素标准物：类毒素-a(Tocris)、13-去甲基螺旋内酯C(NRC-IRAP Halifax，NS，Canada)、α-银环蛇毒素(Sigma-Aldrich，USA)、在Armen Zakarian教授实验室合成的江鳐青毒素-G(University of California,Santa Barbara,California,USA)、13,19-二去甲基螺旋内酯C(CIFGA，Lugo，Spain)。

由电鳐(Torpedo)的发电细胞纯化的包含离子通道连接的受体的经分离和片段化的膜。

通过过滤将富含烟碱乙酰胆碱受体的经分离和片段化的发电细胞膜附着并浓缩到测试表面上。将支撑膜预先浸入TBS溶液中(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)，其中，该支撑膜为玻璃滤纸GF/C或GF/A或GF/B，优选玻璃型滤器GF/C(11.5×8.4cm)。用钳子将测试表面布置在狭槽印迹过滤装置(图3)。然后在真空下过滤测试表面以消除过量的缓冲液。立即并且仍在真空下，将含有电鳐发电细胞膜(70μg总蛋白)的体积为3000μL的TBS溶液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)用12-通道电子移液器(每个移液器枪头250μL)施加至长孔处。通过玻璃过滤器GF/C保留并浓缩电鳐发电细胞的膜。然后将测试表面置于30℃的烘箱中过夜。令人惊讶地，支撑物和膜片段的脱水通过疏水相互作用改善了电鳐发电细胞膜片段在硼硅酸盐玻璃纤维上的永久固定。

如下进行富含结合有经标记的配体:生物素化的α-银环蛇毒素的烟碱型乙酰胆碱受体的发电细胞膜的附着：

在附着之前，用生物素化的α-银环蛇毒素(2μM)过夜孵育3mL富含烟碱型乙酰胆碱受体(35μg/mL)的电鳐发电细胞膜。将玻璃过滤器GF/C，或GF/A或GF/B滤纸或优选型玻璃过滤器GF/C型测试表面(支撑膜)浸入TBS(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)溶液中。然后，如前所述用钳子将测试表面布置在狭槽印迹过滤装置上。

然后在真空下对膜进行过滤。立即并且仍在真空下，将体积为3000μL的含有已与生物素化的α-银环蛇毒素反应的经分离和片段化的电鳐发电细胞膜的TBS溶液(50mMTris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)用12通道电子移液器(每个通道250μL)施加至测试表面。通过玻璃过滤器GF/C保留并浓缩与烟碱乙酰胆碱受体结合具有生物素化的α-银环蛇毒素的电鳐发电细胞膜。然后如前所述将支撑膜置于30℃的烘箱中过夜。令人惊讶地，支撑物和膜片段的脱水通过疏水相互作用改善了电鳐发电细胞膜片段在硼硅酸盐玻璃纤维上的永久固定。

如前所述，同时施加电鳐发电细胞膜和具有结合烟碱乙酰胆碱受体的生物素化α-银环蛇毒素的电鳐发电细胞膜这两者。狭槽1和3专门用于“对照区域”。狭槽2和4专门用于“测试区域”。干燥之后，过滤膜(11.5×8.4cm)能够制造40个根据本发明的装置(包括对照区域和测试区与的2.5×0.45cm条带)。

如下制备缀合物。还选择玻璃过滤器GF/C以保留碱性链霉亲和素-过氧化物酶缀合物，这是因为本发明人令人惊讶地证明玻璃过滤器GF/C与蛋白质形成非特异性结合的低能力以及其保留大体积和吸附蛋白质的能力。此外，将牛血清白蛋白加入缀合物溶液中以进一步减少缀合物在玻璃过滤器的不可逆吸附。临时制备含有碱性磷酸酶(1:500稀释度)的2mL体积的TBS-BSA(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％牛血清白蛋白，pH 7.5)。

将12条长2.1cm、宽0.45cm的条带浸入TBS-BSA/碱性磷酸酶溶液中。整体在室温下孵育4小时。使用夹具将条带布置在一块Parafilm M(注册商标)上以使接触最小化，并将其在30℃的烘箱中干燥过夜。在4℃下储存条带缀合物直至使用。

因此，如下制造如图1所示的检测条带：将双面胶带粘贴在0.1mm的塑料膜上。用剪切机切出长60mm、宽0.45cm的带，并在从胶带的第二粘合剂侧除去保护膜后放置在模具上。将包括测试读取线和对照读取线的2.5cm长，0.45cm宽的玻璃过滤器GF/C的条带布置在距样品施加区边缘的1.5cm处。两条传感器线之间的距离为0.8cm。折叠缀合物条带三次(最终尺寸：长0.8cm，宽0.45cm)，并且部分布置在距施加区0.8cm处的胶带和迁移条带上。将长1.7cm、宽0.45cm且厚1mm的吸收性滤纸粘附到固定缀合物迁移条带的样品施加区。将长2.2cm、宽0.45cm且厚1mm的吸收性滤纸粘合到吸收区并与迁移条带接触以用于通过毛细管现象吸收所施加的样品。一旦已设置好一切，立即将其放置在塑料外壳中。

在另一实施方式中，如下制造如图2所示的检测条带：将包括“测试线”和“对照线”且长25mm、宽4.5mm的玻璃过滤器GF/C条带安装在覆盖有双面胶带的长60mm、宽4.5mm且厚0.1mm的塑料带上。对照线和测试线之间的距离为10mm。由长8mm、宽4.5mm且厚0.25mm玻璃过滤器GF/C制成的缀合物垫放置在距测试带的10mm处，与迁移条带和粘合带重叠4mm。将长22mm、宽4.5mm且厚1mm的吸收性滤纸放置为与缀合物垫和粘合带重叠以形成所谓的样品施加垫(图1和图2A)。将长17mm、宽4.5mm且厚1mm的吸收性滤纸定位另一端，与迁移区重叠3mm，以通过毛细管作用驱动所施加的溶液迁移(吸水垫)。一旦已设置好一切，立即将其放置在塑料外壳中。

在另一实施方式中，样品施加装置从48孔-狭槽印迹装置Hoeffer(商标)改动。Hoeffer(商标)设想的装置被设计为三层。第一层用于将装置连接到真空设备或者除水器以收集过滤后的溶液。Hoeffer(商标)设想的第二层用于在其上设置硼硅酸盐滤膜或任何滤膜。Hoeffer(商标)设想的第三层用于施加样品。如图3所示，这种改动为将48个过滤器窗口改为四个水平的狭槽。预先在TBS中浸泡的硼硅酸盐膜(11.5×8.4cm)层叠在第二层的顶部。样品施加器放在含有硼硅酸盐膜的第二层的顶部。该装置用6个螺丝拧紧。该装置连接到除水器或真空装置。施以真空以除去过量的水，并在10秒后，施加富含受体的膜样品。如前所述，将电鳐发电细胞膜和具有与烟碱乙酰胆碱受体结合的生物素化的标记α-银环蛇毒素的电鳐发电细胞膜用12通道的移液器同时施加于每个狭槽中。狭槽1和3专门用于“对照区”。狭槽2和4专门用于“测试区”。一旦样品被过滤，立即切断真空，拧开装置并且回收硼硅酸盐膜并且如下所述对其进行干燥。一旦干燥，立即对膜进行切片以安装侧流装置。过滤膜(11.5×8.4cm)能够制造40个根据本发明的装置(包括对照区和测试区的2.5×0.45cm条带)。获得的装置在图3中示出。

实施例2：使用根据本发明的装置检测神经毒素

所使用的装置是根据上述实施例1制造的装置。

在本实施例中，进行了几个实验，没有任何毒素的实验作为对照实验和具有毒素即α-银环蛇毒素、螺旋内酯、江鳐青毒素、类毒素-a的实验。

a)对照实验：

在样品孔中加入150μL的TBS-BSA(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％牛血清白蛋白，pH 7.5)。

随后加入150μL用于碱性磷酸酶Western

(Promega)的底物。

得到的结果证明“对照”线是阳性的，这意味并且证明在毒素不存在的情况下，与碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素已经与复合物[烟碱乙酰胆碱受体-α-银环蛇毒素-生物素]的生物素基团结合，固定在“对照”线上。Western Blue(注册商标)底物的水解在“对照”线中产生有色沉淀。

b)在不存在毒素的情况下的测试实验：

在样品中加入150μL的含生物素化α-银环蛇毒素(2.4nM)的TBS-BSA(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％牛血清白蛋白，pH 7.5)。

随后加入150μL用于碱性磷酸酶Western

(Promega)的底物。

所获得的结果证明“测试”线和“对照”线是阳性的，这意味并且证明在毒素不存在的情况下，生物素化的α-银环蛇毒素与固定在“测试”线上的烟碱乙酰胆碱受体结合。此后链霉亲和素碱性磷酸酶从“测试”线和在现有的“对照”线上结合到复合物[烟碱乙酰胆碱受体-α-银环蛇毒素-生物素]的生物素部分。Western Blue(注册商标)底物的水解在两条读数线(“测试”和“对照”)上都产生有色沉淀(图2B，上部装置)。

c)在测试毒素的存在下进行实验：

将含有生物素化的α-银环蛇毒素(2.4nM)和13-去甲基螺旋内酯C(2.5μM)样品的150μL的TBS-BSA(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％牛血清白蛋白，pH 7.5)加入到样品中。

随后加入150μL用于碱性磷酸酶Western Blue(注册商标)(Promega)的底物。

所获得的结果证明“测试”和“对照”线是有颜色但强度不同，或者测试线是无色的(这是样品中毒素含量高的标志)。在具体的实施例中，在13-去甲基螺旋内酯C和生物素化的α-银环蛇毒素(这两者都可以与固定在“测试”线上的烟碱乙酰胆碱受体结合)的存在下，毒素13-去甲基螺旋内酯C依据其浓度和亲和性来抑制示踪剂的结合，从而防止测试线上发生有色沉淀。因此，如果示踪剂受体结合的毒素抑制是完全的，则Western Blue(注册商标)底物被水解，仅在“对照”读数线上产生有色沉淀。否则，如果抑制毒素示踪剂-受体结合不完全，则与“对照”线相比，“测试”线上的染色强度或多或少地降低，着色强度与在样本中的毒素浓度成反比(图2B，底部的设备)。

实施例3：用使用两条测试线的装置检测神经毒素

所使用的装置是根据上述实施例1制造的装置，除了使用两条测试线而不是一条测试线和一条对照线。对照线用于对照条带测试是否正常工作。发明人控制所有的侧流测试装置运行良好，并进行了多次没有毒素的测试，这些没有毒素的测试作为设备按预期工作的对照(Ctrl)(图4)。

在本实施例中，使用不同浓度的不同毒素进行了几个实验。通过规定的两条测试线，我们测试了毒素在给定浓度下的效价。

特别地，测试了在μM0.01至10μM之间不同剂量的蛇毒素α-银环蛇毒素(图4A)。为此目的，使用TBS-BSA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5％BSA，pH 7.5)由市售α-银环蛇毒素(Sigma；250μM)制备1mL浓度为10μM的α-银环蛇毒素。接着，使用TBS-BSA缓冲液10倍稀释先前的浓缩溶液来制备1mL的1μMα-银环蛇毒素。如所述使用TBS-BSA缓冲液进行梯度10倍稀释，以获得0.1μM和0.01μMα-银环蛇毒素溶液。

还测试了在0.01μM至100μM范围内的不同剂量的鞭毛藻毒素江鳐青毒素-G(图4B)。为此目的，使用TBS-BSA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5％BSA，pH 7.5)，由合成的江鳐青毒素-G原液(A.Zakarian；2mM)制备浓度为100μM的1mL江鳐青毒素-G。接着，使用TBS-BSA缓冲液2倍稀释先前的浓缩溶液来制备1mL的50μM江鳐青毒素-G。通过使用TBS-BSA缓冲液50倍稀释前一50μM江鳐青毒素-G溶液获得1μM江鳐青毒素-G的溶液。如所述使用TBS-BSA缓冲液进行梯度10倍稀释，以获得0.1μM和0.01μM江鳐青毒素-G溶液。

最终，还测试了在0.01μM至10μM范围内的不同剂量的鞭毛藻毒素13,19-二去甲基螺旋内酯C。为此目的，使用TBS-BSA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5％BSA，pH7.5)由浓缩的13,19-二去甲基螺旋内酯C原液(CIFGA；100μM)制备浓度为10μM的1mL 13,19-二去甲基螺旋内酯C。接着，使用TBS-BSA缓冲液10倍稀释先前的浓缩溶液来制备1mL的1μM 13,19-二去甲基螺旋内酯C。如所述使用TBS-BSA缓冲液进行梯度10倍稀释，以获得0.1μM和0.01μM 13,19-二去甲基螺旋内酯C。

如上述实施例2中所公开的那样进行竞争性实验。

如图4A所证实的，蛇毒素α-银环蛇毒素以高浓度(10μM和1μM)在两条测试线中均抑制标记的示踪剂的结合。在0.1μM时，第二条测试线的强度低于第一条测试线，而在1.01μMα-银环蛇毒素时，两条测试线均显示出相似但低于对照条带的强度。

如图4B所示，在江鳐青毒素G的情况下，两种测试线在100μM和50μM浓度下都是无色的，而在江鳐青毒素G的浓度为1μM～0.01μM时，只有第二条测试线着色的强度低于对照条带显示的强度。

如图4C所示，鞭毛藻毒素13,19-二甲基螺旋内酯C在所有浓度即0.01μM～10μM下，抑制生物素化毒素示踪剂的结合。

因此，该实施例清楚地证明，本发明的方法和根据本发明的装置能够检测环状亚胺毒素并且有利地能够检测低浓度，例如浓度为0.01μM的环状亚胺毒素。

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Claims (22)

1.一种用于体外检测样品中神经毒素或离子通道连接的受体的配体，和/或电压门控离子通道的配体的侧流测试装置，所述侧流测试装置包括：

用于布置样品的区域（1）；

包括以下的区域（2）：

包括与结合至配体的分子相偶联的酶的缀合物，所述配体为离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，或

包括与结合至抗体的分子相偶联的酶的缀合物，所述抗体为针对离子通道连接的受体的神经毒素结合位点的抗体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体，和/或

包括纳米金包被分子的缀合物，所述纳米金包被分子结合至离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，或

包括碳黑包被分子的缀合物，所述碳黑包被分子结合至离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，或

包括荧光分子的缀合物，所述荧光分子结合至离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体；

可视化区域（3），所述可视化区域包括：

测试区域（3a），所述测试区域（3a）包含：包括固定在测试表面上的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经片段化和分离的细胞膜，以及

对照区域（3b），所述对照区域（3b）包含：包括与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的经片段化和分离的细胞膜，所述离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道被固定在所述测试表面上，或

对照区域（3b'），所述对照区域（3b'）包含离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，所述配体直接固定在所述测试表面上；

以及

吸收区域（4），

其中，所述测试表面是玻璃纤维支撑物，所述玻璃纤维支撑物具有直径为1µm~1.6µm的孔隙；并且所述测试表面是经干燥的，固定有经片段化和分离的细胞膜。

2.根据权利要求1所述的侧流测试装置，其中，区域（1）和区域（2）在它们的一端重叠，区域（2）的另一端与区域（3）的一端重叠，且吸收区域（4）与区域（3）的自由端重叠。

3.根据权利要求1所述的侧流测试装置，其中，所述玻璃纤维支撑物的厚度为0.10mm~0.5 mm。

4.根据权利要求1所述的侧流测试装置，其中，所述离子通道连接的受体选自包括以下的组：配体门控受体通道，或者电压门控通道。

5.根据权利要求4所述的侧流测试装置，其中，所述离子通道连接的受体选自烟碱乙酰胆碱受体、电压门控钠通道或电压门控钾通道。

6.根据权利要求1所述的侧流测试装置，其中，所述细胞膜选自包括以下的组：发电细胞细胞膜、天然哺乳动物神经元细胞膜、以及遗传修饰的表达配体门控受体通道或电压门控通道的哺乳动物神经元细胞的膜。

7.根据权利要求1所述的侧流测试装置，其中，所述离子通道连接的受体是烟碱乙酰胆碱受体，且所述细胞膜是电鳐发电细胞细胞膜。

8.根据权利要求7所述的侧流测试装置，其中，所述测试区域（3a）的表面包括从包含经片段化和分离的电鳐发电细胞细胞膜的原液固定并浓缩到所述测试区域（3a）的经片段化和分离的电鳐发电细胞细胞膜，其中所述包含经片段化和分离的电鳐发电细胞细胞膜的原液的浓度为10µg/mL~500 µg/mL总蛋白。

9.根据权利要求7所述的侧流测试装置，其中，所述对照区域（3b）的表面包括从包含经片段化和分离的电鳐发电细胞细胞膜的原液固定并浓缩到所述对照区域（3b）的经片段化和分离的电鳐发电细胞膜，所述经片段化和分离的电鳐发电细胞膜与所述烟碱乙酰胆碱受体的配体相关，所述包含经片段化和分离的电鳐发电细胞细胞膜的原液的浓度为10µg/mL~500 µg/mL总蛋白。

10.一种用于制造根据权利要求1至9中任一项的侧流测试装置的方法，所述侧流测试装置包括固定在其表面的膜片段，所述方法包括以下步骤：

a. 通过过滤使包含经片段化和分离的细胞膜的第一溶液穿过测试表面来将所述经片段化和分离的细胞膜附着并浓缩至所述侧流测试装置的测试表面；

b. 附着并浓缩与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道，所述离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道通过过滤使包含所述与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的离子通道连接受的体和/或电压门控离子通道的第二溶液穿过测试表面而被固定至所述侧流测试装置的对照测试表面；或

附着离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体，所述配体直接固定在测试对照表面上；

c. 通过将测试表面浸入包含缀合物的第三溶液中来附着所述缀合物，所述缀合物包含与分子偶联的酶，所述分子与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合或者与针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体结合，和/或所述缀合物包括与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合的纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子；

d. 干燥测试表面；

e. 将所述测试表面组装并附着至固体支撑物上，

其中，所述测试表面是玻璃纤维支撑物，所述玻璃纤维支撑物具有直径为1µm~1.6µm的孔隙。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述离子通道连接的受体选自包括烟碱乙酰胆碱受体、电压门控钠通道、电压门控钾通道的组。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述细胞膜选自包括以下的组：发电细胞细胞膜、天然哺乳动物神经元细胞膜，以及遗传修饰的表达配体门控受体通道或电压门控通道的哺乳动物神经元细胞的膜。

13.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述离子通道连接的受体是烟碱乙酰胆碱受体，且所述细胞膜是电鳐发电细胞细胞膜。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第一溶液包含蛋白质浓度为10µg/mL~500µg/mL的经片段化和分离的电鳐发电细胞细胞膜。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第二溶液包含蛋白质浓度为10µg/mL~500µg/mL的与烟碱乙酰胆碱受体的配体相关的烟碱乙酰胆碱受体。

16.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第二溶液包含蛋白质浓度为10µg/mL~500µg/mL的与烟碱乙酰胆碱受体的配体相关的烟碱乙酰胆碱受体。

17.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第三溶液包括偶联至链霉亲和素的酶的1/50至1/5000的稀释液。

18.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述步骤a）或步骤b）的任何过滤在真空下进行。

19.根据权利要求12所述的方法，其中，所述玻璃纤维支撑物的厚度为0.10mm~0.50mm。

20.根据权利要求1至9中任一项所述的侧流测试装置和/或能够通过根据权利要求10至19所述的方法获得的侧流测试装置在检测和量化神经毒素中的用途。

21.根据权利要求4至9中任一项所述的侧流测试装置和/或能够通过根据权利要求10至19所述的方法获得的侧流测试装置在检测离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道受体配体中的用途。

22.一种使用根据权利要求1至9中任一项所述的侧流测试装置来体外检测神经毒素的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 将待测试的样品与标记的神经毒素一起布置在布置区域（1）上，

b. 布置包含与分子偶联的酶的底物的溶液，所述分子与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合或者与针对离子通道连接的受体和/或电压门控离子通道的神经毒素结合位点的抗体结合；和/或布置包含纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子的溶液，所述纳米金包被分子、碳黑包被分子或荧光分子与离子通道连接的受体的经标记的配体和/或电压门控离子通道的经标记的配体结合，和

c. 分析所述测试区域和所述对照区域，

d. 检测所述神经毒素，当所述测试对照区域有颜色而所述测试区域没有颜色时，检测到所述神经毒素。

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