CN113092610B - 一种从海洋微藻中提取裸甲藻亚胺毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从海洋微藻中提取裸甲藻亚胺毒素(Gymnodimine,GYM)的方法，包括以下步骤：收集处于稳定生长期的海洋产毒藻，按照55mL/L的比例向藻液中添加二氯甲烷作为萃取剂，磁力搅拌充分混合后，倒入分液漏斗中静置，收集下层有机相；将有机相离心、旋转蒸发浓缩后得到毒素提取液。本发明采用液‑液萃取的方法提取GYM毒素，提取步骤简单，易于操作，成本较低，提取效率高，毒素回收率可达87.5％，能够从大体积的产毒藻培养液中高效回收和提取毒素，为毒理学实验及毒素标准物质的制备提供充足的毒素来源。

Description

一种从海洋微藻中提取裸甲藻亚胺毒素的方法
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种从海洋微藻中提取裸甲藻亚胺毒素的方法。
背景技术
裸甲藻亚胺毒素(Gymnodimine,GYM)是一组含有环状亚胺结构的脂溶性海洋藻毒素，目前已确认鞍状凯伦藻(Karenia selliformis)和奥氏亚历山大藻(Alexandriumostenfeldii)可产生GYM毒素。该毒素可在贝类体内长期残留，并沿食物链向高营养级生物传递，直接影响海洋中鱼、虾及贝类捕食者，严重威胁海洋生态系统和人体健康。
GYM毒素可与烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)相互作用，具有潜在的医药应用价值，可作为分子工具用于治疗神经退行性疾病的药物研发。但此类毒素主要来源于海洋产毒微藻，通过产毒藻或染毒贝类提取纯度较高的标准物质，以满足毒素的常规检测、毒理学与药理学研究的需求。
目前GYM毒素的获取以室内大规模培养的产毒微藻作为毒素来源，但藻毒素的回收和提取面临困难。一方面，典型的产毒藻株鞍状凯伦藻的细胞体积小(<30μm)、生长密度低(<20000cells mL-1)，且在培养体系中呈悬浮状态，收集藻细胞较为困难；另一方面，在离心、抽滤等过程中藻细胞极易破碎，造成毒素大量流失，导致毒素的回收率较低。因此，亟需研发一种简单、高效的GYM毒素回收和提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从海洋微藻中提取裸甲藻亚胺毒素的方法，能够从大体积的产毒藻株培养液中快速、高效地获取GYM毒素，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的从海洋微藻中提取裸甲藻亚胺毒素的方法，是将萃取剂加入到GYM产毒藻株的培养液中进行萃取；经一定时间萃取后静置，收集下层有机相；然后将有机相溶液离心，收集下层液体，通过负压旋转蒸发浓缩得到毒素提取液。
作为实施例的具体记载，所述的产毒藻株以鞍状凯伦藻为例。
萃取剂优选为二氯甲烷，其在藻液中的添加比例为50-70mL/L，优选为55mL/L；
所述的藻细胞生长状态为进入稳定生长期的产毒藻株，密度约为20000cells mL-1。
所述的萃取过程中使用磁力搅拌，搅拌时间优选为5～10分钟，转速优选为2000～2400rpm。
所述的静置时间，优选为20～30分钟。
所述的离心过程，离心力优选为2400×g～4800×g，离心时间优选为5～10分钟。
所述的负压旋转蒸发，其中水浴温度优选为20～30℃，负压优选为0.05～0.07MPa，蒸发瓶转速优选为120～150rpm。
本发明提取毒素的步骤简单，易于操作，对操作人员的技术水平要求较低；有机试剂消耗量少，成本较低；耗时短，提取效率高，毒素回收率可达87.5％，能够用于规模化提取藻毒素，可为毒理学实验及毒素标准物质的制备提供充足的毒素来源。
附图说明
图1是不同萃取剂、分散剂对GYM毒素的提取效果图。
图2是不同比例二氯甲烷对GYM毒素的提取效果图。
图3是GYM标准样品(A)以及本发明萃取收集毒素提取液(B)的液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)色谱图。
图4是本发明萃取收集的毒素提取液的全扫描色谱图(m/z 50～1500)。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明的提取效果及参数优化过程，下面通过具体实验结果进行详细说明。
实施例1：萃取剂和分散剂的选择
实验步骤：
(1)取GYM-A标准溶液，氮气吹干，加入自然海水(过0.45μm滤膜)，涡旋混合，超声溶解。
(2)取1.0mL上述海水样品，应用Oasis-HLB SPE柱(60mg,3cc)进行纯化，测定其初始GYM-A浓度。首先，依次用3mL甲醇和3mL 20％的甲醇水溶液(v/v)活化和平衡SPE柱(流速约1mL/min)；然后，将目标溶液配制成含有20％甲醇的上样液加入SPE柱内(流速约0.5mL/min)；随后，用3mL 20％甲醇水溶液进行淋洗(流速约1mL/min)，除去盐分；最后，用3mL甲醇进行洗脱(流速约1mL/min)，收集洗脱液，过0.22μm有机滤膜，待LC-MS/MS分析。
(3)选择二氯甲烷(CH2Cl2)、三氯甲烷(CHCl3)、四氯化碳(CCl4)、四氯乙烯(C2Cl4)作为萃取剂，甲醇、乙腈、丙酮作为分散剂。取5mL添加标准毒素的过滤海水，将200μL萃取剂和100μL分散剂快速注入水样中；将水样涡旋混匀2min，随后在1600×g条件下离心5min；去掉上层水相，将下层有机相氮吹干，1.0mL甲醇复溶，过0.22μm有机滤膜，LC-MS/MS分析。比较不同萃取剂、分散剂组合情况下，对GYM毒素的提取效果。
实验结果：
不同萃取剂、分散剂组合条件下GYM毒素的提取效果如图1所示。不添加分散剂时，四种萃取剂的提取效果差别较大，二氯甲烷最好，回收率为89.0％；三氯甲烷和四氯化碳次之，回收率分别为87.7％和76.7％；四氯乙烯提取效果最差，回收率仅为57.5％。除四氯化碳-丙酮组合的情况，其他情况下，分散剂添加与否的萃取回收率结果无显著性差异(p>0.05)。
综合考虑有机试剂毒性及管控因素，最终的提取方案选择二氯甲烷作萃取剂，不添加分散剂。
实施例2：不同比例二氯甲烷对GYM毒素的提取效果
实验步骤：
(1)选取处于稳定生长期的鞍状凯伦藻，取10mL藻液，2500×g条件下离心5分钟，取出上清液过Oasis-HLB SPE柱(60mg,3cc)，实施步骤同实施例1；向沉淀的藻细胞加入3mL甲醇，经液氮反复冻融2次后，以强度55％的条件超声破碎藻细胞10min。通过LC-MS/MS分析上清液和藻细胞沉淀中的毒素含量，用于确定藻液中毒素的总量。
(2)向500mL藻液中加入不同体积的二氯甲烷，加入量分别为12.5mL、20mL、27.5mL、35mL。经磁力搅拌5分钟后，将其倒入分液漏斗中静置30分钟，收集下层有机相，在4800×g条件下离心10分钟，收集下层清澈的液体，再向离心管中加入5mL二氯甲烷，重复离心一次，合并两次离心所得有机相，经氮气干燥，甲醇复溶，应用LC-MS/MS定量分析萃取收集的毒素。
实验结果：
不同比例二氯甲烷对GYM毒素的提取效果如图2所示，二氯甲烷加入量为35mL时，提取效果最好，回收率达79.4％。加入量为27.5mL与35mL时，回收率无显著性差异(p>0.05)。
综合考虑提取效率及试剂成本因素，二氯甲烷在藻液中的添加比例优化为55mL/L。
实施例3：大体积产毒藻培养液中GYM毒素的提取
实验步骤：
(1)选取处于稳定生长期的鞍状凯伦藻，取10mL藻液，通过LC-MS/MS分析上清液和藻细胞沉淀中的毒素含量，用于确定藻液中毒素的总量。
(2)向2L藻液中加入二氯甲烷进行萃取，加入量设置为110mL，经磁力搅拌5分钟后，将其倒入分液漏斗中静置30分钟，收集下层有机相，在4800×g条件下离心10分钟，收集下层清澈的液体，再向离心管中加入5mL二氯甲烷，重复离心一次，合并两次离心所得有机相，经旋转蒸发去除溶剂，用甲醇复溶，应用LC-MS/MS定量分析萃取收集到的毒素。
实验结果：
二氯甲烷加入量为110mL时，回收率达87.5％；将藻液体积扩大后，仍有很好的提取效果。
将优化好的参数用于大规模毒素提取，对提取产物进行检测，图3为GYM标准样品(A)以及本发明萃取收集毒素提取液(B)的液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)色谱图；图4为本发明萃取收集的毒素提取液的全扫描色谱图(m/z 50～1500)。

Claims (5)

1.一种提取裸甲藻亚胺毒素的方法，其特征在于，所述的方法是将萃取剂加入到产毒的海洋微藻中进行萃取；萃取结束后静置，收集下层有机相；然后将有机相溶液离心，收集下层液体，通过负压旋转蒸发浓缩后得到毒素提取液；所述的萃取剂为二氯甲烷，不添加分散剂；所述的二氯甲烷在藻液中的添加比例为50-70mL/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二氯甲烷在藻液中的添加比例为55mL/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取过程中进行磁力搅拌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将有机相溶液离心，其中离心力为2400～4800g，离心时间为5～10分钟。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的负压旋转蒸发，其中水浴温度为20～30℃，负压为0.05～0.07MPa，蒸发瓶转速为120～150rpm。
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