CN108699130A - 用于选择素靶向的重组嵌合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重组蛋白(P‑选择素糖蛋白配体‑1和神经视网膜特异性亮氨酸拉链)PSGL‑1‑NRL嵌合蛋白，其包含选择素结合结构域和非共价二聚化结构域，所述非共价二聚化结构域为亮氨酸拉链，更优选地为人或小鼠神经视网膜特异性亮氨酸拉链的亮氨酸拉链结构域。所述嵌合蛋白还包含共价二聚化结构域，其具有至少一个适于与另一个嵌合蛋白形成二硫桥以形成同二聚体的半胱氨酸。在所述嵌合蛋白中，PSGL‑1结构域对应于人PSGL‑1的细胞外区域，并且更优选地为成熟蛋白的选择素结合区。所述嵌合蛋白被正确地翻译后修饰并在哺乳动物系统中高效表达。其被硫酸化、O‑连接的糖基化和唾液酸化，并结合P、E和L选择素，允许用于诊断或治疗目的的体内和体外靶向。

Description

用于选择素靶向的重组嵌合蛋白
发明领域
本发明涉及用于诊断和治疗用途的新型选择素靶向蛋白的制备。
现有技术水平
P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)是白细胞粘附分子，其在生理血流下介导细胞栓系和在活化的内皮细胞上滚动。该活性是白细胞外渗的重要初始步骤。PSGL-1最初被鉴定为P-选择素的配体，随后的工作表明PSGL-1也是E-选择素和L-选择素的配体(参见例如，美国专利号6,277,975)。
选择素家族的两个成员P-选择素和E-选择素在分子成像的背景下具有特别的相关性。已知在血管内皮上P-和E-选择素的上调或表达在炎症条件下发生，而在静止条件下内皮选择素的存在通常低至零。其中选择素是有用的分子成像靶标的疾病状态包括缺血后损伤、急性冠脉综合征、关节炎、炎性肠病(包括回肠炎和结肠炎)、动脉粥样硬化、心肌炎、血栓形成和多发性硬化。然而，选择素分子成像有可能用于描绘和鉴定其中在正常条件下发生选择素表达的组织，诸如皮肤微脉管系统。
已知P-选择素(也称为CD62P)的上调非常快速地发生(在数分钟内)，使得P-选择素成为炎性疾病早期阶段的潜在标志物。P-选择素也存在于活化血小板的表面，使其成为血栓形成的标志。E-选择素(CD62E)也在发炎的脉管系统上表达，尽管通常在炎症反应中晚于P-选择素。因此，E-选择素是疾病晚期炎症的有用标志物。
在选择素的配体中，PSGL-1在白细胞至发炎组织的募集中起重要作用。白细胞通常不与血管内皮相互作用。然而，炎症导致细胞粘附分子(CAM)诸如P-选择素在血管壁表面上表达。流动的血液中存在的白细胞可以与CAM相互作用。该相互作用过程的第一步是通过PSGL-1与内皮细胞和粘附血小板上的P-选择素和/或E-选择素相互作用来进行的。这种相互作用导致白细胞在内皮细胞表面上“滚动”，然后稳定粘附并使白细胞迁移到发炎组织中。
人PSGL-1(GenBank Acc.N Q14242.1；GI 2498904)是粘蛋白样的同源二聚性的二硫键键合糖蛋白，其在大多数造血细胞(包括例如嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、树突细胞和血小板)的表面上表达。
人PSGL-1的氨基酸序列显示氨基末端信号肽(氨基酸残基1-17)和具有配对碱性氨基酸转化酶(PACE)的共有切割位点的前肽(氨基酸残基18-41)。成熟蛋白质的N-末端细胞外区域始于残基42。PSGL-1分子的细胞外结构域含有几个富含丝氨酸/苏氨酸的十聚体重复序列，其含有多个O-糖基化连接位点以及还含有一些N-糖基化连接位点。该分子区域折叠成棒状结构，负责PSGL-1的粘蛋白样特征。在嗜中性粒细胞上，这种棒状结构和PSGL-1在微绒毛尖上的定位促进了PSGL-1与表达选择素的细胞的结合。PSGL-1的十聚体重复区域之后为跨膜区域(残基268-292)和细胞质结构域(残基293-361)。
首先由Sako等(Cell,1993,75(6),1179-1186)实现的重组PSGL-1的表达已允许定义与选择素结合相关的区域和修饰，这些区域和修饰已有报道，例如Liu等J.Biol.Chem.1998,12:7078-7087,Cummings RD,Brazilian Journal of Medical andBiological research,1999,32:519-528,Sako等Cell,1995,83:323-331等(之前引用的)。从对PSGL-1的整体研究来看，对于选择素结合重要的区域已经被定位在成熟PSGL-1的N末端部分，并且包含具有三个酪氨酸硫酸化位点和具有位于Thr 16处的sLex的O-连接寡糖的残基5-16。
PSGL-1的复杂翻译后修饰模式(该蛋白质需要两种不同的翻译后修饰：酪氨酸硫酸化以及岩藻糖和唾液酸对特定核心的2O-连接的糖基化，以被P-选择素的凝集素结构域实现Ca2+依赖性识别)需要该分子在重组真核系统中表达。Fugang Li等J.Biol.Chem,1996,271:3255-3264描述了rPSGL-1的正确糖基化形式的重组表达的要求。US 5,827,817和US6,277,975描述了PSGL-1蛋白的几种变体(其中有PSGL-1-Fc IgG1融合蛋白)以及它们在CHO和COS细胞中与岩藻糖基转移酶基因(FT)组合的表达。因此，具有部分免疫球蛋白Fc片段的PSGL-1嵌合体已经在携带合适的酶的CHO或COS中表达以进行正确的糖基化。
同一申请人已经发现，与超声成像微囊泡的磷脂共价结合的这种PSGL-1 IgG1Fc融合蛋白的较短变体显示出与靶标的改善的结合并增加了微泡的稳定性。这些发现由本发明的同一申请人在WO2012/020030中公开。
本申请公开了PSGL-1嵌合蛋白的重组表达，所述PSGL-1嵌合蛋白依赖于非共价二聚化结构域来产生PSGL-1融合蛋白的同二聚体形式，由此避免了抗体Fc片段的使用和存在此类片段的缺点。事实上，本发明的重组构建体利用DNA调节蛋白的功能性片段“亮氨酸拉链”，其促进蛋白质-蛋白质相互作用和同-或异-二聚体/多聚体形式，在该形式下它们起着能够与DNA相互作用并调节其表达的转录因子的作用。
亮氨酸拉链是在每第7个(有时是第4个)氨基酸位置处具有亮氨酸重复，能够形成右手α螺旋的蛋白质结构域，它们通过所述α螺旋促进与相同或不同对应物的寡聚化，从而产生同-或异-二聚体/多聚体和DNA表达调控特性。
在大肠杆菌(E.coli)中亮氨酸拉链作为二聚化结构域的用途已被利用来产生二聚体抗体或其功能片段ScFv、F(ab')2。在De Kruif,J.和Logtenberg T.,J.Biol.Chem.,1996,271:7630-7634中描述了双功能ScFv的制备。
在Chingwei V.Lee,J.Immunological Methods,2004,284:119-132中已将GCN4(酵母亮氨酸拉链)用于在大肠杆菌的M13系统中进行(ab')2片段的噬菌体展示。
涉及重组CD40的WO2005/105840提出使用所谓的“融合伴侣”来在真核细胞中诱导CD40变体的寡聚化。甘露糖结合蛋白、四连蛋白的胶原结构域和亮氨酸拉链，包括神经视网膜特异性亮氨酸拉链NRL(GenBank登录号M81840)，被作为可能的融合伴侣列入。
本申请人现已发现，当PSGL-1功能片段被克隆到NRL序列的上游时，它们不仅被正确加工并表达为功能性同二聚体，而且表达和分泌也非常高效地发生，远远超过对于PSGL-1Fc衍生的构建体观察到的表达和分泌，所述PSGL-1Fc衍生的构建体具有携带通常用于二聚体蛋白表达的铰链区和Fc的标准IgG骨架，所述PSGL-1Fc衍生的构建体已成为PSGL-1同二聚体表达的参考标准。
本发明现在允许以合适的量和以标准质量制备P/E选择素特异性试剂，以在体内用于治疗或诊断应用。
嵌合蛋白可在CHO细胞系统中以高水平表达，所述CHO细胞系统被认为具有用于生产重组蛋白的安全使用特性，并且可提供选择素结合所需的糖基化和翻译后加工。高表达水平和功能性翻译后加工现在允许该试剂的工业规模扩大。
附图简述
图1.在还原和非还原条件下来自变体1-5的条件培养基的Western印迹。泳道1和6：变体5，分别在还原和非还原条件下；泳道2和7：变体1，分别在还原和非还原条件下；泳道3和8：变体2，分别在还原和非还原条件下；泳道4和9：变体3，分别在还原和非还原条件下；泳道5和10：变体2，分别在还原和非还原条件下。MW标记位于左侧。
图2.各125nM的片段1(Fr-1，实线)与本发明的嵌合蛋白(变体1A，阴影线)之间的SPR Biacore(P-选择素上的蛋白质结合反应)比较。Y轴：共振单位(RU)反应(包括缔合/解离/再生)作为X轴上的时间(秒)的函数。
图3.大鼠炎症性后肢的超声成像。在片段-1或变体1A微泡注射后10分钟，用固定泡成像(Fixed Bubble Imaging)(FBI)获得图像。
图4.注射载有变体1A-脂质体-DIR(小鼠1至6)或Fr-1-脂质体-DIR(小鼠7至12)的脂质体后小鼠后肢炎性LPS模型的光学成像。
在脂质体注射后2小时获得荧光图像(左爪：发炎的爪；右爪：对侧爪)。
图5.实施例13中描述的HA纯化后的最终级分库的RP-HPLC分析(阴性)。靶蛋白的保留时间(Rt)为约9.7分钟。
发明概述
本发明公开了一种重组嵌合P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)蛋白，其至少包含选择素结合结构域、亮氨酸拉链结构域和二硫键促进区，其中选择素结合区优选至少包含SEQID NO:11的aa 5-16。
亮氨酸拉链结构域包含与SEQ ID NO:12的aa 187-208(神经视网膜特异性亮氨酸拉链)具有至少90％同源性或同一性，或更优选与SEQIDNO：12的aa 181-21具有至少90％同源性或同一性的氨基酸序列。
在本发明的重组嵌合PSGL-1蛋白中，二硫键促进区(共价二聚化结构域)包含由下列通式定义的氨基酸序列：
(X1)n-C(X2)m-(X3)，其中：
-X1、X2代表除半胱氨酸(Cys)外的任意氨基酸或氨基酸序列，
-C为Cys
-X3为任意氨基酸，以及
-n、m是由1-6组成的整数，
或优选为(SEQ ID NO:20)。
重组嵌合蛋白是二聚体蛋白，其包含两个如上定义的重组嵌合PSGL-1单体，通过至少一个二硫键彼此共价连接，并且优选是同二聚体。
其在哺乳动物系统中表达，其中其被正确地翻译后修饰并以高水平作为可溶性二聚体分泌到培养基中。
本发明还包括编码如上定义的重组嵌合蛋白的DNA序列和驱动其在哺乳动物系统(优选CHO细胞)中表达的真核表达载体。哺乳动物表达系统还在不同或相同的表达载体上包含糖基化酶β1,6N-乙酰葡糖胺基转移酶(C2GnT)和岩藻糖基转移酶VII(FTVII)以进行适当的糖基化。
因此，本发明还包括用编码嵌合重组PSGL-1蛋白的DNA或如上定义的载体转化的哺乳动物细胞和由哺乳动物细胞分泌的分离的纯化蛋白。
分离的嵌合蛋白是同二聚体，至少在SEQ ID NO:11的第16位的Thr处被O-连接糖基化并且至少在第5、7和10位的Tyr处被硫酸化。
该蛋白质是用于诊断或治疗部分的有用靶向剂，其可以通过包含氨基酸Cys或赖氨酸的接头或间隔子缀合于所述所述诊断或治疗部分，优选存在于并被置于C-末端。
诊断上有用的部分优选选自：放射性标记物、酶、荧光标记物、发光标记物、金属螯合化合物、充气脂质微囊泡和诊断活性部分的组合，更优选为金属螯合化合物或充气微囊泡。这些缀合物可用于在以选择素过表达为特征的病理状况(诸如：急性冠脉综合征(ACS)、炎症性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、与肿瘤相关的新血管生成、类风湿性关节炎、缺血再灌注损伤、移植物排斥)中，或者更一般地，表达高于生理水平的P-选择素和/或E-选择素的任何器官或组织的病理状况中，通过超声、磁共振、光声、闪烁照相、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、正电子发射断层扫描(PET)、X射线、射频声学和光学进行成像。更优选地，病理状况是IBD、ACS、肿瘤检测或移植物排斥。
更优选地，本发明的嵌合蛋白是用于IBD、ACS、肿瘤检测和移植物排斥的有用靶向剂。
治疗活性部分优选选自：细胞因子、细胞抑制剂、毒素、抗炎剂、免疫调节剂、抗聚集剂、皮质类固醇、单克隆抗体、生长因子或包含金属螯合部分以携带放射性核素的放射治疗剂。
本发明还包括药物组合物，其包含如上所定义的用于诊断或治疗目的的重组嵌合蛋白或其缀合物。
本发明的另外的实施方案是制备本发明的重组嵌合蛋白的方法，该方法包括用编码其的DNA序列或包含所述DNA序列的真核表达载体转化真核细胞，以获得稳定表达嵌合蛋白的重组系统，收获培养基并从所述培养基中纯化重组蛋白。
本发明还涉及重组可溶性蛋白质的纯化方法，其包含羟基磷灰石作为最后的色谱步骤。羟基磷灰石，优选地陶瓷羟基磷灰石优选在强阴离子交换和疏水相互作用色谱法之后进行。
本发明的另外的实施方案是使用包含根据本发明的重组可溶性嵌合蛋白的靶向缀合物和以过表达选择素为特征的病理状况的诊断成像，治疗性治疗特征在于选择素的过表达的病理状况的方法，其包括向受试者预先施用诊断缀合物或药物组合物并通过成像方法记录图像。此类成像方法优选地选自：超声、磁共振、光声、闪烁照相、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、正电子发射断层扫描(PET)、X射线、射频声学和光学。
以选择素的过表达为特征的病理状况优选选自：急性冠脉综合征(ACS)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、与肿瘤相关的新血管生成、类风湿性关节炎、缺血再灌注损伤、移植排斥，或者更通常地，表达高于生理水平的P-选择素和/或E-选择素的任何器官或组织的病理状况。更优选地，病理状况是IBD、ACS、癌症或移植物排斥。
本发明的详述
定义
除非另有说明，否则本发明所涉及的人PSGL-1的氨基酸和核苷酸序列通过GenBank登录号Q14242.1标识。该登录号还标识了功能结构域，诸如PSGL-1的信号肽区域(其由aa 1-17组成)、前肽区域(其由aa 18至41组成)(其标识了成熟蛋白质在aa 42(对应于SEQ ID NO:11的aa 1)处起始)、N-和O-糖基化位点和硫酸化位点。
神经视网膜特异性亮氨酸拉链(NRL)氨基酸序列由NCBI登录号NP_006168.1(GI:1709348，人)标识。在本发明中，神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)包括在NRL的亮氨酸拉链区中至少90％同源的所有氨基酸序列，包括小鼠NRL(P54846)。
NRL(首先由Swaroop等Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89:266-270分离和表征的)的单核苷酸多态性已被鉴定：如果具有功能，它们包含在本发明中；在NP_006168.1序列中，已在氨基酸187-208之间鉴定了亮氨酸拉链结构域。源自NRL序列的该区域的N-末端或C-末端处的侧翼氨基酸也可以是功能域的一部分(非共价二聚化基序)。
如本文中所用，术语“重组”用于描述非天然改变或操作的核酸，用外源核酸转染的宿主细胞，或通过操纵分离的DNA和宿主细胞转化而非天然表达的多肽。重组是特别地包括使用基因工程技术在体外构建的DNA分子的术语，使用术语“重组”作为形容词描述的分子、构建体、载体、转染的细胞、多肽或多核苷酸包括这样的分子、构建体、载体、细胞、多肽或多核苷酸，即使它们具有与天然存在的分子相同的部分序列。
术语“多肽”用于指通过肽酰胺键(–C(:O)NH–)经主链(与侧链相对)连接的两个或更多个氨基酸的化合物。术语“肽”在本文中与“多肽”可互换使用，但通常用于指具有少于40个，优选少于25个氨基酸的多肽。
术语“蛋白质”用于指通过肽酰胺键(–C(:O)NH–)经主链(与侧链相对)连接的超过40个氨基酸的化合物。
如本发明中所用，术语“嵌合蛋白”或“融合蛋白”或“嵌合体”包含与至少一种非PSGL-1多肽可操作地连接的PSGL-1多肽。“PSGL-1多肽”共享PSGL-1的氨基酸序列(优选人)，而“非PSGL-1多肽”具有与PSGL-1基本上不同源，并且源自相同或不同的生物体的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，“PSGL-1多肽”包含PSGL-1的细胞外部分或其较短片段，仍然结合选择素(特别是P和E选择素)，诸如PSGL-1(SEQ ID NO:11)的1-47片段，其包含aa 5-16区域，该区域定义选择素结合区。选择素结合区可任选地包含衍生自PSGL-1序列的aa 5-16的N-或C-末端处的侧翼氨基酸。
通过将框内彼此融合的编码PSGL-1多肽的DNA序列与编码非PSGL-1多肽的DNA序列在真核表达的调控区(诸如启动子或多聚腺苷酸化位点)控制下可操作地连接在一起，在重组系统中表达和产生“融合”或“嵌合蛋白”。
术语“结合”是指通过标准测定法(包括本文所述的那些)确定结合多肽可识别给定的靶标并与其可逆结合。此类标准测定法包括但不限于平衡透析、凝胶过滤、表面等离子体共振、免疫亲和力测定，包括竞争性免疫测定和由结合产生的光谱变化的监测。
如本文中所用，“标记基团”或“可检测标记物”是能够产生可检测信号的基团或部分。特别优选的是可用于诊断成像的标记物，即可通过磁共振、放射性检测、超声、X射线、光(UV、红外线、荧光等)检测的标记物或携带可用于放射疗法或其他形式的疗法的部分(诸如放射性金属或其他实体)的标记物。具体标签将在下面详述。
术语“特异性”是指相对于另一种靶而言，对一种靶标具有更高结合亲和力的结合多肽。结合特异性可以通过两种测试的靶材料的解离平衡常数(KD)或缔合平衡常数(Ka)来表征。在一个优选实施方案中，本发明的结合多肽对于期望的靶标具有低于约10μM，更优选低于约1μM，最优选低于约0.5μM或甚至更低的解离常数。术语“选择素特异性”是指PSGL-1结合部分，其对P、L、E选择素中的至少一种选择素具有比无关靶标更高的亲和力。
如本文中所用，术语“患者”是指任何哺乳动物，尤其是人。
术语“药学上可接受的”载体或赋形剂是指无毒的载体或赋形剂，可将其与本发明的化合物一起向患者施用，并且其不破坏其药理学活性。
术语“靶标”或“靶分子”是指结合部分或结合多肽可以结合的任何物质，例如蛋白质或多肽、细胞、受体、碳水化合物、脂质等。如本文中所用，“靶标”包括呈分离形式的或在细胞、组织或器官中或其表面上表达的选择素的家族。因此，如本文中所用，如果没有另外说明的话，“靶向”部分是指能够结合选择素，优选P和E-选择素的PSGL-1蛋白或其功能片段。
术语“治疗药剂”或“治疗剂”是指在体内对恶性细胞具有有益的治疗性或细胞毒性作用的化合物或药剂。治疗剂包括被称为例如生物活性剂、细胞毒剂、药物、化学治疗剂、放射治疗剂、遗传物质等的那些组合物。
术语“带正电荷的”氨基酸是指下列组中的氨基酸：精氨酸、组氨酸、赖氨酸。这些氨基酸通常被认为是“可互换的”，这意味着用同一组中的另一种氨基酸取代残基通常在蛋白质或多肽中被很好地耐受，即使当残基包含在蛋白质的关键结构域(诸如α-螺旋、结合口袋、空间依赖性约束等)中时这可能不适用。
术语“带负电荷的”氨基酸是指下列组中的氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸。这些氨基酸通常被认为是“可互换的”，这意味着用同一组中的另一种残基取代残基通常在蛋白质或多肽中被很好地耐受，即使当残基包含在蛋白质的关键结构域(诸如结合口袋或空间依赖性区域约束等)中时这可能不适用。
术语具有“极性不带电荷的侧链”的氨基酸是指下列组中的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。这些氨基酸通常被认为是“可互换的”，这意味着一个残基用同一组中的另一种残基取代通常在蛋白质或多肽中被很好地耐受，除上述示例性例外。
术语具有“疏水侧链”的氨基酸是指下列组中的氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这些氨基酸通常被认为是“可互换的”，这意味着一个残基用同一组中的另一种残基取代通常在蛋白质或多肽中被很好地耐受，即使当残基包含在蛋白质的关键结构域(诸如α-螺旋、结合口袋、空间依赖性约束等)中时这可能不适用。
在蛋白质中具有特定功能的氨基酸是包括在下组中的氨基酸：半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸。取决于是否由于残基的大小而发挥功能，甘氨酸可被其他小尺寸的残基诸如丝氨酸或丙氨酸替代。不一致时，当涉及二硫桥时，半胱氨酸可能不会被替代。
至于共价二聚化结构域，本申请人指的是包含可在二硫桥中与不同多肽链(链外二硫键桥)上的另一个半胱氨酸连接的半胱氨酸的氨基酸序列，其在细胞外环境中是稳定的。
至于非共价二聚化结构域，申请人指的是能够确定和/或有利于蛋白质-蛋白质相互作用的氨基酸序列。优选非共价二聚化结构域是结构性α-螺旋，通过亮氨酸残基的周期性重复确定的，在本领域通常称为“亮氨酸拉链”。
可根据本发明使用的亮氨酸拉链氨基酸区域优选不含任何赖氨酸(K或Lys)。亮氨酸拉链结构域通常通过亮氨酸的周期性重复而在真核“调节”蛋白中被容易地鉴定。其中，即Q9Y2D1的亮氨酸拉链，对应于aa 236-250，或激活转录因子5的亮氨酸拉链(GI:114678546)。
然而，根据本发明的优选亮氨酸拉链选自：
-神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白片段，其是从哺乳动物中分离的，并且与人NRL蛋白的片段187-208具有≥90％的同源度，甚至更优选为小鼠NRL(Q543Y0)或人NRL同种型2(P54845-2)或牛蛋白F1N4J1的亮氨酸拉链结构域。
详述
本发明涉及重组PSGL-1嵌合蛋白，其包含选择素结合结构域和非共价二聚化结构域，其为亮氨酸拉链，更优选为人或小鼠神经视网膜特异性亮氨酸拉链的亮氨酸拉链结构域，优选对应于NP_006168.1(SEQ ID NO:12)的至少区域187-208，或更优选地，对应于SEQID NO:12的至少区域181-215。或者，非共价二聚化结构域与人NRL蛋白的片段187-208具有≥90％的同源度，甚至更优选地为小鼠NRL(Q543Y0)或人NRL同种型2(P54845-2)或牛蛋白F1N4J1的亮氨酸拉链结构域。
至于P-选择素结合结构域，我们在本文中指的是包含对选择素(特别是对于P-选择素)具有结合亲和力的氨基酸序列(“活性序列”)的肽或多肽；所述活性序列包含至少氨基酸5-16(Cummings RD,Brazilian Journal of Medical and Biological research,1999,32:519-528)或优选选自SEQ ID NO:11的片段1-19、5-41和1-47，其中氨基酸1代表成熟PSGL-1蛋白的第一个氨基酸，并且对应于GenBank登录号Q14242.1的aa 42。
PSGL-1蛋白是通过接近跨膜结构域的Cys 320处的二硫键连接的跨膜同源二聚体，如GenBank记录中所定义的。
到目前为止，通过在PSGL-1选择素结合结构域下游引入IgG1Fc结构域，已经实现了重组PSGL-1的二聚化。Fc结构域包含携带至少两个半胱氨酸的铰链区，所述两个半胱氨酸在二硫桥中连接以使同源二聚体中的嵌合蛋白共价结合。免疫球蛋白Fc区已在几种重组系统中用于改善或促进对于选择素结合必不可少的二聚化。
然而，Fc结构域的存在呈现了一些缺点。首先，证明了与Fc结构域融合的PSGL-1结合在气体微泡表面，引发聚集体的形成(WO2012/020030)。此外，Fc结构域还可能通过巨噬细胞表达的Fc-受体的特异性识别来引发免疫反应。这可导致携带Fc蛋白片段的分子从血液循环中清除，或触发免疫反应诸如过敏反应。
事实上，本发明的同一申请人发现较短的Fc区为用于微泡制备的衍生物提供了改良的性质。本发明克服了这些缺点，其中人NRL的亮氨酸拉链结构域替代了Fc区。该区域优选为神经视网膜特异性亮氨酸拉链的亮氨酸拉链结构域，包含NP_006168.1的至少aa 187-208或优选地aa 186-209、185-210、184-211、183-212、182-213、181-214、181-215、186-208、186-210、187-208或包含来自序列NP_006168.1(SEQIDNO:12)的区域181-215的至少aa187-208加上N-或C-末端或两端处的另外1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个侧翼氨基酸的任何片段。
本申请人已经发现DNA调节蛋白NRL的亮氨酸拉链结构域不仅允许通过促进二硫键形成而使嵌合单体高效共价二聚化，而且还在哺乳动物重组系统中提供二聚体功能性蛋白的非常高效的表达和分泌。
甚至更令人惊讶的是，这种新的嵌合蛋白被正确地翻译后修饰，即在预期的PSGL-1区域中在Tyr处被正确地O-糖基化和硫酸化，其为二聚体并且通过二硫桥共价结合，并且以优于或至少等同于如WO2012/020030中描述的优化的片段1(Fr-1)的亲和力与选择素靶标结合。这些结论已通过许多数据获得，所述数据在实验部分中有更详细说明。
上述发现非常令人惊讶，因为本发明的嵌合蛋白(P-选择素糖蛋白配体-1和神经视网膜特异性亮氨酸拉链)(在本文称为sPSGL-1-NRL)是来自无关蛋白的结构域的组合，当与经工程化以携带PSGL-1选择素结合结构域作为N-末端区域的其他嵌合蛋白的表达水平相比时甚至更加独特，所述PSGL-1选择素结合结构域与本领域常用的其他二聚化结构域(诸如IgG1Fc片段)框内融合。
具体地，在本发明的优选实施方案之一中，SEQ ID NO:11的PSGL-1结构域1-47已与以下结构域框内融合：
-共价二聚化结构域(包含至少如下所定义的半胱氨酸)，优选在非共价二聚化结构域(或稳定结构域)(诸如NRL亮氨酸拉链，而非人IgG1的Fc或CH3结构域)之后或可选地在其之前，并与其框内融合；
-任选且优选C-末端处的间隔子，以避免与在C-末端连接的基团或部分的任何空间位阻，和
-在嵌合蛋白的N末端处的用于分泌的信号肽，其适于在成熟嵌合蛋白中被切掉，并且优选不是内源PSGL-1信号和前肽序列。
在哺乳动物系统中产生并测试其表达的几种变体中：变体1和1A代表本PSGL-1-NRL嵌合蛋白发明(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:37)的优选实施方案，变体2(SEQ ID NO:4)，其对应于与人IgG1铰链和CH3结构域(分别用作共价和非共价二聚化(或稳定)结构域)框内融合的PSGL-1，或变体5(SEQ ID NO:10)，其包含为了比较目的而制备的WO2012/020030中描述的优化片段1的相同功能结构域。值得注意的是，在目标蛋白质变体中，上述序列表鉴定了在表达的成熟形式中被切除的信号肽。
特别地，已经观察到仅含有NRL亮氨酸拉链的变体1提供了适合于药剂生产的表达水平。在相同细胞系统中表达的变体1-5的相对表达的比较数据在图1中给出，其中标记的嵌合蛋白的表达水平已通过瞬时表达、变性和非变性条件下的SDS-PAGE以及利用针对置于C末端的常用标签(即，FLAG八肽)的抗体的Western印迹来估计。
因此，不与特定理论相联系，有人认为在生理学上为二聚体的蛋白质(PSGL-1)中存在有利于蛋白质-蛋白质相互作用的非共价二聚化结构域诸如亮氨酸拉链，更优选NRL的亮氨酸拉链，通过本发明的最终嵌合蛋白的有利折叠或稳定化作用，导致提高的表达水平，这可通过单克隆分离和培养中的稳定化进一步优化。初步克隆选择后提供的滴度远高于0.1g/L.
在本发明的嵌合蛋白中，共价二聚化结构域，或者称为二硫键促进区，包含至少一个可用于与单体嵌合蛋白对应物中的另一个Cys形成二硫键的Cys残基，使得两个嵌合蛋白单体通过至少一个二硫桥共价结合。
包含共价二聚化结构域的通式为：
(X1)n-C(X2)m-(X3)，
其中X1和X2代表不包括Cys的任意氨基酸或氨基酸序列；C是半胱氨酸，X3是任意氨基酸，n和m是1-6的整数。X1优选包含脯氨酸、组氨酸或苏氨酸；甚至更优选包含脯氨酸和组氨酸或组氨酸和苏氨酸或脯氨酸和苏氨酸。根据一个优选实施方案，X1包含脯氨酸、组氨酸和苏氨酸(优选按此顺序)，并且n至多为5。X2是不包括Cys的任意氨基酸或氨基酸序列，优选包含脯氨酸。优选X2是Pro-Pro；X3优选为半胱氨酸并且包含至少脯氨酸。更优选地，携带半胱氨酸的区域是IgG1铰链区或其功能性片段。优选的二硫键促进区是：PHTCPPCP(SEQ IDNO:20)。
根据一个优选实施方案，嵌合蛋白还包含C末端处的间隔子，其包含适于与其他肽或化学部分(诸如成像和/或治疗性部分)共价生物缀合的残基。用于生物缀合的示例性氨基酸为半胱氨酸和赖氨酸。间隔子的长度为约4-20个氨基酸，并包含选自Gly、Ser、Pro、Ala、Val、Leu的一个或多个氨基酸；其在其C-末端(优选在倒数第二个位置处)具有半胱氨酸或赖氨酸。间隔子优选为包藏有丙氨酸或其他中性氨基酸诸如缬氨酸或类似物的聚甘氨酸，并且其具有半胱氨酸或赖氨酸，优选赖氨酸，其中所述缀合氨基酸之后是Gly、Ser、Pro、Ala、Val、Leu，优选至少一个Gly。间隔子优选具有序列G4AG4KG(SEQIDNO:17)。或者，嵌合蛋白在其C-末端包含Flag序列，即用于鉴定和纯化目的。Flag序列通常由技术人员使用并且在本领域中是已知的。一个实例是DYDDDDK序列(SEQ ID NO:35)，其允许通过与合适的抗体的免疫亲和力进行蛋白质识别和/或纯化。
根据一个优选实施方案，单体蛋白质作为具有信号肽的前体被翻译，然后被加工，并在切割信号肽后最终作为同二聚体被分泌到培养基(条件培养基)中。
用于分泌的信号肽存在于嵌合蛋白的前体的N末端。优选地，信号肽是小鼠IgH信号肽，其具有序列：MEWSWWVFLFFLSVTTGVHS(SEQIDNO:18)。可使用其他信号肽(或前导肽)，诸如PSGL-1内源性信号肽序列或重组蛋白质表达领域中常用的其他异源信号肽序列，从而允许分泌翻译后加工的重组蛋白质。表1中提供了本领域已知的一些信号(或前导)肽的实例。
表1.前导信号肽序列
作为SEQ ID NO:18的替代方案，来自SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:34的任何上述信号肽可用于实现重组蛋白的分泌。
本发明的PSGL-1-NRL嵌合重组蛋白以二聚体形式高效结合P/E选择素，其中每个单体是如上定义的重组PSGL-1，并以适当地以糖基化和硫酸化的形式产生。迄今为止发表的若干研究已经回顾了PSGL-1对P/E/L选择素结合的翻译后要求，即糖基化、硫酸化，并绘制了对于该加工和选择素结合来说重要的残基(R.D Cumming,Braz.J.Biol.Res.,1999,32(5):520-528和D.Sako Cell,1995,83:323-331)。
在根据本发明的嵌合蛋白的优选实施方案中，在温和酸处理后通过液相色谱与质谱联用(LC-MS)已经评估了唾液酸化(透明酸的存在)。本发明的重组蛋白的唾液酸残基含量可以为约5％至30％w/w，10％至28％w/w，15％至25％w/w，更优选15％至25％。
为了表征重组嵌合蛋白，已经用Asp-N和胰凝乳蛋白酶酶促消化进行了肽作图。
还评估了N-末端谷氨酰胺(Gln)环化成焦谷氨酰胺(pGlu)、Tyr硫酸化、Thr O-糖基化(Core 2 SLeX的存在)以及二聚体结构，并且在实验部分进行了更详细描述。
通过胰凝乳蛋白酶切割证实了蛋白质的二聚体结构，根据重组蛋白的一个优选实施方案，其提供了(TCPPCPL)2片段。
通过Asp-N消化证实了N-末端酪氨酸(Y)残基5、7和10的硫酸化。通过胰凝乳蛋白酶裂解在苏氨酸16处证实了具有SLeX四糖基序的O-糖基化。
从以上所有内容可得出结论：在嵌合蛋白中，对于选择素结合重要的PSGL-1的N-末端结构域在对应于成熟PSGL-1蛋白的位置5、7和10的Tyr残基处被适当地硫酸化，并且在位置16中的苏氨酸残基处被糖基化，特别是O-连接的糖基化；O-连接的聚糖通常包含糖残基，诸如N-乙酰半乳糖胺(GalNac)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖(Man)、己糖、木糖、唾液酸或其混合物。
这些翻译后修饰(PTM)已在SEQ ID NO:38中进行了概括。
优选存在于本发明的嵌合蛋白的PSGL-1部分上的O-连接的聚糖优选为GalNac、GlcNAc、岩藻糖、唾液酸和半乳糖。PSGL-1上的O-连接的聚糖优选被唾液酸化和岩藻糖基化，并且优选由与苏氨酸残基结合的唾液酸基路易斯X聚糖结构(sLex，唾液酸-吡喃基半乳糖苷-岩藻糖-N-乙酰葡糖胺)组成。
这种类型的翻译后修饰已被描述为对于P-选择素结合是必需的(R.D Cumming,Braz.J.Biol.Res.,1999,32(5):520-528和D.Sako Cell,1995,83:323-331)。
形成二聚体，并且每个单体通过至少一个二硫桥共价连接至另一个单体。
通过在哺乳动物细胞诸如HEK-293、COS-1或CHO细胞中表达已经实现了嵌合蛋白的正确翻译后加工，所述哺乳动物细胞已被用于PSGL-1表达。在任何情况下，PSGL-1优选在哺乳动物细胞中与C2GnT(核心2β1-6-N乙酰葡糖胺基转移酶)和岩藻糖基转移酶诸如以下酶之一共表达：Fuc-TIII(Fuc-T：岩藻糖基转移酶)、Fuc-IV或Fuc TVII(Fugang Li等J.Biol.Chem,1996,271:3255-3264)或其功能性片段。优选使用Fuc TVII或其功能性片段。使用OptiCHOTM(LifeTechnology)培养基(可以成功地使用其他无血清的化学成分确定的培养基，例如GE/PAA的ActiCHOTM、Millipore的FortiCHOTM、CellVentoTM CHO 200和CellVentoTM CHO 220、SAFC的83836C、Irvine的BalanCDTM、Sigma-Aldrich的等)并且在没有选择压力的情况下，使细胞，优选适于悬浮生长的CHO生长至少7天，通常长达14天。补充1-10mM，优选4-8mM的谷氨酰胺(或类似物GlutMaxTM)。OptiCHOTM和ActiCHOTM(LifeTechnology)对于表达目的是优选的。
嵌合蛋白可通过三步色谱法纯化至所需的纯度水平，所述三步色谱法包括：阴离子交换、疏水相互作用和尺寸排阻或羟基磷灰石(HA)色谱。包含HA柱的纯化作为最后的纯化步骤是优选的，并提供了治疗级纯嵌合蛋白。
因此，根据一个另外的实施方案，本发明包括如上定义的嵌合蛋白的纯化方法，其包括羟基磷灰石(HA)色谱作为最终步骤。更优选地，纯化方法包括在强阴离子交换(AE)上进行的第一色谱，在疏水相互作用(HI)固相上进行的第二色谱和在HA(优选陶瓷羟基磷灰石)上进行的第三步骤。
更一般地，本发明涉及纯化任何含有可溶性PSGL-1的融合蛋白或嵌合蛋白的方法，其中所述PSGL-1包含成熟PSGL-1(SEQ ID NO:11)的至少aa 5-16，还在这种5-16片段的N-或C-末端处包含一个或多个侧翼氨基酸。
更优选地，嵌合蛋白中的PSGL-1片段包含达到成熟PSGL-1的多达至少aa 1-47的所有侧翼氨基酸。甚至更优选地，嵌合蛋白还包含SEQ ID NO:12的至少aa 187-208(神经视网膜特异性亮氨酸拉链)或与所述187-208区域具有至少90％同源性或同一性的氨基酸序列和如上通过通式定义的共价二聚化结构域。嵌合蛋白的一个常规实施方案具有SEQ IDNO:39。
然而，包含HA作为最后步骤的本发明的纯化方法可以成功地应用于任何嵌合或重组蛋白，所述嵌合或重组蛋白在N末端处具有包含PSGL-1的至少aa 5-16或1-47的成熟PSGL-1的N末端区域。
包含HA作为最后纯化步骤的方法允许使PSGL-1的纯度达到高于95％，优选96％，97％，98％或99％并且基本上不含污染性DNA，如通过商业DNA定量测定诸如DNA定量的其他蛋白质试剂盒、荧光测定(Sigma)测量的。
至于最终产率，通过上述方法，以高于50％，通常高于60％以及通常为约或高于70％的总嵌合靶蛋白含量的产率回收靶蛋白。这些产率代表了良好的结果，对于工业过程而言最重要的是，它们可被良好地标准化并且是可重现的，且变化非常小。
可以根据制造商的说明使用具有这些特征的标准商业树脂或柱子。陶瓷HA可从BIORAD商购获得。如本领域技术人员已知的，可以调节纯化和洗脱条件。
为了便于放大，梯度洗脱可以有利地用离散步骤洗脱来代替，以便限制过程分析的数量并减少总的过程时间。在下面描述的变体1和1A的优选实施方案中，表征了纯化的蛋白质(纯度≥90％)并且：
·确认了前导肽的正确去除；
·PSGL变体1A糖蛋白的N-末端结构主要呈焦谷氨酸形式pQATEYEYL。事实上，AspN消化酶的使用允许检测N-末端Gln环化，通过该过程存在于N-末端的Gln残基倾向于经历自发环化以形成焦谷氨酸；
·已通过以下过程确认了PSGL变体1A的二聚体特征：在还原和非还原条件下凝胶电泳，然后酶促消化，随后使用LC-MS进行片段表征。实验数据表明，PSGL变体-1A可完全处于其二聚体形式；
·已证实Thr16上存在O-聚糖部分并确定了其结构。已经证实了预期的Sialyl-Lewis-X基序、包含N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖、岩藻糖和唾液酸的Core 2结构，如在实验部分中更详细地描述的；
·还证实了对于结合L-和P-选择素重要的成熟蛋白质的残基Y5、Y7和Y10的硫酸化。通过质谱法进行糖蛋白硫酸化的监测。如本领域技术人员已知的，在本发明的靶嵌合蛋白中证实的酪氨酸5、7和10的硫酸化对于PSGL-1和变体1A的生物活性是极其重要的。
在本申请中已经报道了另外的蛋白质表征数据，并且在实验部分中更详细地描述了该数据。
因此，根据主要方面，本发明涉及如上定义的分离和纯化的PSGL-1嵌合蛋白，其能够结合P、L和E选择素，优选P选择素。
分离的重组蛋白是同二聚体，其中每个同二聚体具有包含以下氨基酸序列或优选由其组成的一级序列，更优选按以下顺序组成：
-N-末端处的成熟PSGL-1蛋白(SEQ ID NO:11)的aa 1-47；
-至少一种氨基酸序列，其包含适合于具有如上定义的式：(X1)n-C(X2)m-(X3)(更优选SEQIDNO:20)的二硫桥的半胱氨酸或由其组成；
-NRL(SEQ ID NO:12)的至少aa 181-215；
-任选地，长达15aa的氨基酸间隔子，其在C-末端或更优选在倒数第二个位置处具有：至少一个或多个Gly和/或Ala，优选地氨基酸诸如Lys或Cys。更优选地，这种间隔子是由4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个甘氨酸制成的聚甘氨酸，优选包含并埋藏至少丙氨酸，更优选在倒数第二个位置处还包含赖氨酸以用于进一步的化学缀合。甚至更优选地，氨基酸间隔子是SEQ ID NO:17。因此，在一个特别优选的实施方案中，嵌合蛋白具有序列SEQ IDNO:37，其中仍然显示了在成熟蛋白中切掉的信号肽。翻译后修饰的嵌合靶蛋白单体在SEQID NO:38中表示为一个优选的实施方案。
具有以下方面所必需的基序或区域的嵌合变体蛋白的通式：
-选择素结合，如以上充分定义的，
-共价二聚化(即具有侧翼区域的包含Cys的基序)，
-还在SEQ ID NO:39中报道了非共价二聚化(即包含至少NRL aa 187-208的基序)，其优选包含用于优选在最终或倒数第二位置(即Lys或Cys)处缀合嵌合蛋白的残基。
分离和纯化的PSGL-1嵌合蛋白的纯度可通过UPLC-UV或表面等离子体共振测定(在例如Biacore装置(如实验部分中更详细描述的)上)测定。
本发明还涉及编码上述呈单体形式的蛋白质的任何DNA序列，其优选包含编码如上定义的嵌合蛋白的SEQ ID NO:2的氨基酸1-118的核苷酸序列。根据一个特别优选的实施方案，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:36的nt 1-354，优选由核苷酸1-360组成。
或者，编码本发明的嵌合蛋白的DNA序列包含至少编码PSGL-1的P-选择素结合结构域(优选SEQ ID NO:11的aa 1-47)的核苷酸序列和编码至少神经视网膜特异性亮氨酸拉链结构域(SEQ ID NO:12)的aa 187-208(任选地在N-或C-末端包含1个、2个、3个、4个、5个、6个侧翼氨基酸)或更优选编码至少NRL(SEQ ID NO:12)的aa 181-215的核苷酸序列。
遗传密码的冗余允许不同的密码子用于单个氨基酸，因此密码子的不同组合，即不同的DNA序列，允许表达具有相同的一级氨基酸序列的蛋白质并产生相同的重组蛋白。因此，可被设计来通过对每种生物使用偏爱密码子在选定的重组系统中优化表达的此类不同的DNA序列全部包含在本发明的范围内。
特别优选的重组嵌合蛋白包括由SEQ ID NO:1的nt 1-354编码的SEQ ID NO:2的氨基酸1-118。SEQ ID NO:2的氨基酸1-118任选地还在C-末端包含至少一个适于与标记或治疗性部分的反应基团化学缀合的氨基酸，其中所述氨基酸是赖氨酸或半胱氨酸。更优选地，这种反应性氨基酸之后是至少另一种不带电荷的氨基酸，优选甘氨酸。甚至更优选地，适用于缀合的氨基酸位于多达15aa的氨基酸序列的C末端，随后是至少一个中性或不带电荷的氨基酸，诸如甘氨酸。
本发明还包括包含所述DNA序列的表达载体和具有重组序列(瞬时或稳定整合到基因组中)的转染的细胞克隆。优选的细胞克隆是具有稳定整合的载体DNA拷贝的那些细胞克隆，诸如在CHO细胞中，更优选地，在适应悬浮生长的CHO细胞(其可与标准地用于哺乳动物细胞表达的表达载体一起商购获得，即在Lifescience(ThermoFisher Scientific)的FreedomTMCHO-STM试剂盒中)中获得的那些细胞克隆。
可以扩增适应悬浮的CHO细胞并使其生长至约2.107个细胞/L的密度，以实现重组蛋白的高效分泌。
根据另一方面，本发明包括制备如上定义的重组嵌合蛋白的方法，其包括用编码其的DNA序列或包含编码其的DNA序列的载体转化真核细胞以获得重组真核系统(优选稳定表达嵌合蛋白并且其中所述嵌合蛋白优选被分泌到培养基中的CHO细胞系统)，收获培养基并通过纯化从所述培养基中回收重组蛋白。
然后，可通过C-末端残基将纯化的重组嵌合蛋白成功缀合于诊断和/或治疗性部分或将其这样(即与药物组合物中的合适成分或赋形剂组合)使用。
用于诊断和治疗应用的嵌合蛋白的缀合物
本发明的嵌合蛋白用于将与其连接的诊断和治疗活性部分靶向表达选择素的组织、细胞或器官。如果被适当地翻译后修饰，由PSGL-1区域或其片段提供的嵌合蛋白的特异性靶向选择素(Liu等，J.Biol.Chem.,1998,273:7078-7087)。在该表达系统中已经证实，非共价二聚化结构域(诸如亮氨酸拉链)的存在不会改变与靶标的结合强度，所述非共价二聚化结构域具有非常独特的二级结构。
因此，根据主要实施方案之一，本发明涉及包含嵌合蛋白作为成像部分的靶向剂(靶向表达选择素的细胞、组织、器官等)的缀合物。
“成像部分”是指可通过诊断成像方法检测的任何部分，即能够提供，改善或以任何方式有利地修饰通过目前使用的成像诊断技术检测到的信号的任何诊断有效部分，所述成像诊断技术包括：超声(US)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、X射线成像、光声成像、荧光和光学成像，所述技术在本发明中包括术中成像，即使得能够登记诊断上有用的，优选具有对比度的图像的任何技术。在本发明中还设想了混合成像方法，其中嵌合蛋白与至少两个可用不同成像方法检测的部分连接。混合成像的实例是PET/CT、SPECT/CT、MR/PET、MR/SPECT；超声和MR、超声和CT；MR和CT。
成像部分可包括用于双重检测的成像部分的任何可能组合，例如对于MRI/PET，其可包括顺磁性金属螯合单元和放射性核素螯合单元。根据本发明的诊断有效部分的实例包括，例如，螯合的γ射线或发射正电子的放射性核素；呈螯合或多螯合络合物形式的顺磁性金属离子、X射线吸收剂(包括原子序数大于20的原子)；染料分子；荧光分子；磷光分子；在紫外光谱中吸收的分子；量子点；能够在近红外辐射或远红外辐射内吸收的分子以及，通常地产生可检测信号或与检测系统特异性相互作用的所有部分。综上所述，本领域技术人员已知，所使用的成像方式必须根据本发明的诊断化合物所结合的成像可检测部分来选择。因此，例如对于与嵌合蛋白连接的荧光成像部分诸如CyC5，荧光光检测系统将是合适的。
下表提供了一些示例性对比度产生剂和优选成像模式。
表2.示例性对比度产生剂和优选成像模式
模式 对比度产生剂
将嵌合蛋白与诊断和治疗性部分缀合以用于分子靶向
通常通过化学手段进行本发明的嵌合蛋白的缀合物的制备。
缀合伴侣的反应基团，即嵌合蛋白和待与其缀合的基团，以“保护”形式存在或制备。在本说明书中，除非另有说明，否则术语“保护基团”表示适于保持与其结合的官能团的特征性化学功能的保护基团。具体地，在本文中，保护基团用于保持氨基或羧基官能团。因此，适当的保护基团可包括，例如，Fmoc、苄基、苄氧基羰基或烷基酯或通常用于保护此类功能且本领域技术人员已知的其它基团。
能够与多肽单元诸如本发明的嵌合蛋白的N-末端(-NH2)或C-末端(-COOH)基团发生化学反应，将此类基团通过化学反应转化成维持相应的多肽/蛋白质针对选择素的特异性、但不能分别与不同部分上的羧基或氨基功能因发生化学反应的合适的衍生物的其它化学基团称为“去活化基团”。去活化基团不应参与甲酰胺基交联反应。一个实例由乙酰基-基团[也称为CH3(CO)-或甚至Ac]代表，用于通过将肽链转化为相应的非反应性乙酰化AcHN-基团来使肽链的氨基末端去活化。
另一方面，氨基本身及其衍生物诸如，例如-NH2、-NH(CH3)或H2NOC-CH2-NH-可通过分别提供相应的–CONH2、–CONH(CH3)或–CONH-CH2-CONH2非反应性酰胺而用作游离羧基的“去活化基团”。
例如，如果嵌合蛋白包含反应性氨基(例如赖氨酸的伯氨基)，则其可与诊断性部分诸如含有合适的相应反应性部分的微囊泡的组分反应，所述相应反应性部分是诸如异硫氰酸酯基团(以形成硫脲键)、反应性酯(以形成酰胺键)、羰基(以形成亚胺键，其可被还原成胺键)、活化的羟基(例如，呈甲苯磺酰化的甲苯磺酸酯或氰酸酯、乙烯基砜或环氧化物的形式)。
或者，当本发明的靶向配体包含反应性硫醇基团时，诊断或治疗性部分(即微泡的组分)上的合适的互补反应性部分可包括卤代乙酰基衍生物、马来酰亚胺(以形成硫醚键)或包含呈2-吡啶硫基(PDT)基团形式的硫化物(其在与衍生自靶向配体的硫醇反应时，导致稳定的二硫键形成)、活化的羟基(例如，呈甲苯磺酰化的甲苯磺酸酯或氰酸酯、乙烯基砜或环氧化物的形式)的混合二硫化物。
或者，根据本发明的一个实施方案，含有氨基反应性部分(例如伯氨基团，特别是末端-NH2基团)的靶向配体可以首先与含硫化合物反应，以在靶向配体中引入反应性硫醇部分，然后，其与诊断性组分(即，如上说明的微囊泡的组分)上的相应互补部分反应。可用于在含有反应性氨基部分的靶向配体中引入反应性硫醇部分的合适的含硫化合物的实例包括，例如：硫代亚胺酸酯(诸如Traut试剂)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)或N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)。含S试剂和各自的硫醇化反应的详细描述可参见例如Greg T.Hermanson的书：“Bioconjugate Techniques”,Elsevier编辑，第2版，(2008年4月)，第1章，第4-1节。例如，可以制备马来酰亚胺衍生的磷脂(例如磷脂酰乙醇胺-PE-或聚乙二醇化的PE)并使其与靶向配体(例如SEQ ID NO:3)反应，其中伯氨基(例如赖氨酸侧链的-NH2)先前已经与含硫化合物(诸如先前说明的那些)反应，以引入反应性硫醇部分；然后，所得化合物可用于制备被靶向的充气微泡。
根据另一个替代方案，当靶向配体包含反应性羧基时，诊断或治疗性基团(即微囊泡的组分)上的合适的反应性部分可以是胺和酰肼(以形成酰胺或N-酰基，N'-烷基酰肼的功能)。
根据上述优选实施方案，含有氨基反应性部分(例如在赖氨酸残基上)的靶向配体可以首先与含马来酰亚胺的化合物反应，以在靶向配体中引入反应性马来酰亚胺部分，然后与微囊泡组分上的相应互补部分反应。可用于在含有反应性氨基部分的靶向配体中引入反应性马来酰亚胺部分的含马来酰亚胺试剂和添加马来酰亚胺基团的各自反应是本领域熟知的。合适的含马来酰亚胺的化合物的实例包括，例如：AMAS(N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯)、EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯))、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺)酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、SM(PEG)n试剂(琥珀酰亚胺基-(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-乙二醇)酯)、SMPH(琥珀酰亚胺基-6-((β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯))、磺基-EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-KMUS(N-(κ-马来酰亚胺基十一烷酰氧基)-磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)-环已烷-1-羧酸酯)、磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基(丁酸酯))。
其他类似试剂可含有不同于马来酰亚胺的巯基反应性基团，例如LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-[3-2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯、NHS-溴乙酸酯(N-羟基琥珀酰亚胺基溴乙酸酯)、NHS-碘乙酸酯(N-羟基琥珀酰亚胺基碘乙酸酯))、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SULFO-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯)。
根据用于超声诊断成像的微囊泡实施方案，可使含巯醇的磷脂(例如硫醇化的磷脂酰乙醇胺-PE-或聚乙二醇化的PE)与靶向配体反应，其中伯氨基团(例如赖氨酸侧链的NH2)先前已经与硫醇反应性化合物(例如马来酰亚胺，诸如前面所述的那些)反应，以在其中引入硫醇反应性部分；然后，所得化合物可用于制备微囊泡或其他诊断或治疗性缀合物。
在本发明的嵌合蛋白中，优选在嵌合蛋白的C末端制备缀合物，留下N-末端可用于与选择素靶标结合。
用于超声的诊断有效部分
微囊泡
一类特别适用于超声对比成像的造影剂包括分散在含水介质中的纳米和/或微米尺寸的气泡悬浮液。特别有趣的是其中例如通过使用乳化剂、油、增稠剂或糖，或通过将气体或其前体捕获或包封在各种系统中来稳定气泡的那些制剂。这些被稳定的气泡在本领域中通常用各种术语来指称，这通常取决于用于其制备的稳定化材料；这些术语包括例如“微球体”、“微泡”、“微胶囊”或“微气球”。如本文中所用，术语“充气微囊泡”或缩写“微囊泡”包括任何上述术语。
充气微囊泡
根据本发明的一个优选实施方案，充气微囊泡用与本发明的嵌合蛋白(作为选择素靶向配体)共价结合的脂质或磷脂制备，并且优选为微泡。至于微泡，我们指的是悬浮在含水载体中的气泡，其在气-液界面处具有带有稳定化两亲材料的薄外壳(膜)。气体微泡的含水悬浮液的实例公开于例如US 5,271,928,US 5,445,813,US 5,413,774,US 5,556,610,5,597,549,US 5,827,504和WO 04/069284中。该术语还包括呈冻干或喷雾干燥组分形式(优选包含磷脂、分散体)的微泡前体。
在与根据上述定义的微泡不一致时，术语“微气球”或“微胶囊”包括其中气泡被脂质或者天然或合成聚合物的固体材料外壳包围的悬浮液。微气球及其制备的实例公开于例如US 5,711,933和US 6,333,021中。
适于形成微泡的稳定化外壳的组分包括例如磷脂；溶血磷脂；脂肪酸，诸如棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸；具有脂质的聚合物，诸如壳多糖、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)，也称为“聚乙二醇化脂质”；含有磺化单糖、二糖、低聚糖或多糖的脂质；胆固醇、硫酸胆固醇或半琥珀酸胆固醇；生育酚半琥珀酸酯；具有与醚或酯连接的脂肪酸的脂质；聚合脂质；二乙酰基磷酸酯；磷酸二鲸蜡酯；神经酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(诸如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯、乙氧基化大豆甾醇、乙氧基化蓖麻油或环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)嵌段共聚物；胆固醇脂肪酸酯，包括丁酸胆固醇酯、异丁酸胆固醇酯、棕榈酸胆固醇酯、硬脂酸胆固醇酯、醋酸羊毛甾醇酯、棕榈酸麦角固醇酯或正丁醇植物甾醇酯；糖酸的固醇酯、包括胆固醇葡糖苷酸酯、羊毛甾醇葡萄糖醛酸酯、7-脱氢胆固醇葡萄糖醛酸酯、麦角固醇葡萄糖醛酸酯、葡萄糖酸胆固醇酯、葡萄糖酸羊毛甾醇酯或葡萄糖酸麦角固醇酯；糖酸与醇的酯，包括月桂基葡糖醛酸酯、硬脂酰葡糖醛酸酯、肉豆蔻酰基葡糖醛酸酯、葡萄糖酸月桂酯、葡萄糖酸肉豆蔻酯或葡萄糖酸硬脂酸酯；糖与脂肪酸的酯，包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡糖醛酸、葡糖酸或聚糖醛酸；皂苷，包括萨洒皂角苷配基、异菝葜皂苷元、常春藤苷配基、齐墩果酸或洋地黄毒苷配基；甘油或甘油酯，包括甘油三棕榈酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二棕榈酸酯；长链醇，包括正癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、十六醇或正十八烷醇；6-(5-胆甾-3β-基氧基)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；双半乳糖甘油二酯；6-(5-胆甾-3β-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷；6-(5-胆甾-3β-氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-甘露吡喃糖苷；12-(((7'-二乙氨基香豆素-3-基)羰基)-甲基氨基)十八烷酸；N-12-(((7'-二乙氨基香豆素-3-基)羰基)-甲基氨基)-十八烷酰基-2-氨基棕榈酸；N-琥珀酰二油酰磷脂酰基乙醇胺；1,2-二油酰-sn-甘油；1,2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰甘油；1,3-二棕榈酰-2-琥珀酰-甘油；1-十六烷基-2-棕榈酰甘油酰磷酸乙醇胺或棕榈酰基高半胱氨酸；烷基胺或烷基铵盐，其包含至少一个(C10-C20)、优选(C14-C18)烷基链诸如N-硬脂胺、N,N'-二硬脂胺、N-十六烷基胺、N,N'-二十六烷基胺、N-硬脂酰氯化胺、N,N'-二硬脂酰氯化胺、N-十六烷基氯化铵、N,N'-二十六烷基氯化铵、二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；叔胺或季铵盐，其包含一个或优选两个(C10-C20)，优选(C14-C18)，通过(C3-C6)亚烷基桥与N-原子连接的酰基链，诸如，例如1,2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、1,2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1,2-油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰-3-二甲基铵-丙烷(DSDAP)；及其混合物或组合。
取决于组分的组合和微泡的制造方法，上面列出的示例性化合物可以用作形成微泡外壳的主要化合物，或者作为简单的添加剂，因此仅以少量存在。
根据一个优选实施方案，形成微泡外壳的至少一种化合物是两亲性化合物(即包含亲水和亲脂部分的有机分子)，优选磷脂，任选地与上述任何其他物质混合。根据本说明书，术语磷脂旨在包括任何两亲性磷脂化合物，其分子能够在最终的微泡悬浮液中的气-水边界界面处形成材料的稳定化膜(通常以单分子层的形式存在)。因此，这些材料在本领域中也称为“成膜磷脂”。
两亲性磷脂化合物通常含有至少一个磷酸基团和至少一个，优选两个亲脂性长链烃基团。
合适的磷脂的实例包括甘油与一个或优选两个(相同或不同)脂肪酸的残基以及与磷酸的酯，其中磷酸残基又与亲水基团结合，所述亲水基团是诸如，例如胆碱(磷脂酰胆碱-PC)、丝氨酸(磷脂酰丝氨酸-PS)、甘油(磷脂酰甘油-PG)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺-PE)、肌醇(磷脂酰肌醇-PI)。仅具有一个脂肪酸残基的磷脂的酯在本领域通常称为磷脂的“溶血”形式或“溶血磷脂”。存在于磷脂中的脂肪酸残基通常是长链脂肪酸，通常含有12-24个碳原子，优选14-22个碳原子；脂族链可含有一个或多个不饱和度或优选为完全饱和的。包含在磷脂中的合适脂肪酸的实例是例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸，二十二烷酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选使用饱和脂肪酸，诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。
磷脂的其他实例是磷脂酸，即甘油-磷酸与脂肪酸的二酯；鞘磷脂类，诸如鞘磷脂(sphingomyelins)，即其中甘油与脂肪酸的二酯的残基被神经酰胺链取代的那些磷脂酰胆碱类似物；心磷脂，即1,3-二磷脂酰甘油与脂肪酸的酯；糖脂诸如神经节苷脂GM1(或GM2)或脑苷脂；糖脂；硫苷脂和鞘糖脂。
如本文所用，术语磷脂包括天然存在的、半合成的或合成制备的产物，其可以单独使用或作为混合物使用。
天然存在的磷脂的实例是天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(PC)衍生物)，诸如通常为大豆或蛋黄卵磷脂。
半合成磷脂的实例是天然存在的卵磷脂的部分或完全氢化的衍生物。优选的磷脂是磷脂酰胆碱、乙基磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或鞘磷脂的脂肪酸二酯。
优选的磷脂的实例是，例如，二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰-磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰-磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰-磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油酰-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)、二-十五烷酰-磷脂酰胆碱(DPDPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)，1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)，1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)，1-棕榈酰基-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-油酰-2-棕榈酰-磷脂酰胆碱(OPPC)、二月桂酰-磷脂酰甘油(DLPG)及其碱金属盐、二花生酰磷脂酰甘油(DAPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰-磷脂酰甘油(DMPG)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)及其碱金属盐、二油酰-磷脂酰甘油(DOPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二花生酰磷脂酸(DAPA)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰二磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)、二花生酰磷脂酰基乙醇胺(DAPE)、二亚油酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二花生酰磷脂酰丝氨酸(DAPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)和二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)、二月桂酰-磷脂酰肌醇(DLPI)、二花生酰磷脂酰肌醇(DAPI)、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二油酰-磷脂酰肌醇(DOPI)。
合适的磷脂还包括通过将亲水性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)与其连接而修饰的磷脂。优选聚合物修饰的磷脂包括“聚乙二醇化的磷脂”，即与PEG聚合物结合的磷脂。聚乙二醇化磷脂的实例是聚乙二醇化的磷脂酰乙醇胺(简称“PE-PEG”)，即其中亲水性乙醇胺部分与可变分子量(例如300至20000道尔顿，优选500至5000道尔顿)的PEG分子连接的磷脂酰乙醇胺，诸如DPPE-PEG(或DSPE-PEG、DMPE-PEG、DAPE-PEG或DOPE-PEG)。例如，DPPE-PEG2000是指其上连接有平均分子量为约2000的PEG聚合物的DPPE。
特别优选的磷脂是DAPC、DSPC、DSPG、DPPA、DSPA、DMPS、DPPS、DSPS和乙基-DSPC。最优选的是DSPG或DSPC。
也可以使用磷脂的混合物，诸如，例如DSPE、DPPE、DPPC、DSPC和/或DAPC与DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、乙基-DSPC和/或乙基-DPPC的混合物。
在优选实施方案中，磷脂是微泡的稳定外壳的主要组分，占形成充气微泡的外壳的组分总量的至少50％(w/w)。在一些优选实施方案中，基本上整个外壳(即至少80重量％且高至100重量％)可由磷脂形成。
磷脂可以方便地与任何上述化合物混合使用。因此，例如，可任选地将物质诸如胆固醇、麦角固醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、没食子酸丙酯或抗坏血酸棕榈酸酯、脂肪酸诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸及其衍生物或丁基化羟基甲苯和/或其它非磷脂化合物以0至50重量％，优选高至25％的比例添加到一种或多种前述磷脂中。特别优选的是两亲化合物诸如C10-C20羧酸，优选棕榈酸。
根据一个优选实施方案，根据本发明的微泡的外壳包括带有总(正或负)净电荷的化合物。所述化合物可以是带电荷的两亲性物质，优选脂质或磷脂。
带有总负电荷的磷脂的实例是磷脂酰丝氨酸的衍生物，特别是脂肪酸二酯衍生物，诸如DMPS、DPPS、DSPS；磷脂酸的衍生物，诸如DMPA、DPPA、DSPA；磷脂酰甘油的衍生物，诸如DMPG、DPPG和DSPG或磷脂酰肌醇的衍生物，诸如DMPI、DPPI或DPPI。经修饰的磷脂，特别是PEG修饰的磷脂酰乙醇胺，诸如DPPE-PEG或DSPE-PEG，也可用作带负电荷的分子。还有上述磷脂的溶血形式，诸如溶血磷脂酰丝氨酸衍生物(例如溶血-DMPS、-DPPS或-DSPS)、溶血磷脂酸衍生物(例如溶血-DMPA、-DPPA或-DSPA)和溶血磷脂酰甘油衍生物(例如溶血-DMPG、-DPPG或-DSPG)可有利地用作带负电荷的化合物。带负电荷的化合物的其他实例是胆汁酸盐诸如胆酸盐、脱氧胆酸盐或甘胆酸盐；和(C12-C24)，优选(C14-C22)脂肪酸盐诸如，例如棕榈酸盐、硬脂酸盐、1,2-二棕榈酰-sn-3-琥珀酰甘油盐或1,3-二棕榈酰-2-琥珀酰甘油盐。
优选地，带负电的化合物选自DPPA、DPPS、DSPG、DPPG、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG5000或其混合物。
带负电荷的组分通常与相应的正抗衡离子相缔合，其可以是单价的(例如碱金属或铵)、二价的(例如碱土金属)或三价的(例如铝)。优选地，抗衡离子选自碱金属阳离子，诸如Na+或K+，更优选Na+。
带有总正电荷的磷脂的实例是乙基磷脂酰胆碱的衍生物，特别是乙基磷脂酰胆碱与脂肪酸的二酯，诸如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC或DSEPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DPPC或DPEPC)。负抗衡离子优选是卤离子，特别是氯离子或溴离子。可掺入微泡外壳中的带正电荷的化合物的实例是具有卤素抗衡离子(例如氯或溴)的单-、二-或四-烷基铵盐，其包含至少一个(C10-C20)，优选(C14-C18)烷基链，诸如，例如单-或二-硬脂基氯化铵、单或二-十六烷基氯化铵、二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。可掺入微泡外壳中的带正电荷的化合物的其它实例是具有卤素抗衡离子(例如氯或溴)的叔或季铵盐，其包含一个或优选两个(C10-C20)，优选(C14-C18)酰基链，通过(C3-C6)亚烷基桥与N-原子连接，诸如，例如1,2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、1,2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1,2-油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)或1,2-二硬脂酰-3-二甲基铵-丙烷(DSDAP)。
DSEPC、DPEPC和/或DSTAP优选用作微泡外壳中的带正电荷的化合物。
带正电荷的组分通常与相应的负抗衡离子相结合，所述负抗衡离子可以是单价的(例如卤素)、二价的(例如硫酸根)或三价的(例如磷酸根)。优选地，抗衡离子选自卤离子，诸如F-(氟)、Cl-(氯)或Br-(溴)。
中性和带电荷的化合物，特别是磷脂和/或脂质的混合物可以令人满意地用于形成微泡外壳。相对于脂质和磷脂的总量，带电荷的脂质或磷脂的量可以为约95mol％至约0.1mol％，优选为80mol％至0.5mol％。
中性磷脂与带电荷的脂质或磷脂的优选混合物是，例如，DPPG/DSPC、DSTAP/DAPC、DPPS/DSPC、DPPS/DAPC、DPPE/DPPG、DSPA/DAPC、DSPA/DSPC、DSPC/PA(二硬脂酰磷脂酰胆碱/棕榈酸)和DSPG/DSPC。
可用于形成充气微囊泡的稳定化外壳的任何上述组分，特别是磷脂，优选聚乙二醇化的磷脂，可通过在其中插入合适的反应性部分(以允许结合合适的化合物，诸如包含SEQ ID NO:1所示序列，或更优选包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-118的序列的靶向配体)来修饰。例如，聚乙二醇化的磷脂(例如DSPE-PEG2000)可以包含能够(共价地)与包含上述序列的化合物上的相应反应性部分反应的末端反应性部分(例如马来酰亚胺，简称“mal”，因此形成DSPE-PEG-mal组分)。在本说明书的下文中举例说明了其他合适的反应性部分的实例。
根据一个可选的实施方案，靶向配体组分可以与充气微胶囊缔合。微胶囊的优选实例是具有稳定化外壳的那些微胶囊，所述稳定化外壳包含聚合物，优选可生物降解的聚合物，或任选地与可生物降解的聚合物混合的可生物降解的不溶于水的脂质(诸如三棕榈酸甘油酯)。合适的微胶囊及其制备的实例公开于例如US 5,711,933和US 6,333,021(通过引用整体并入本文)。也可以使用具有蛋白质性质外壳的微胶囊，即由天然蛋白质(白蛋白、血红蛋白)制成的微胶囊，诸如US-A-4,276,885或EP-A-0 324 938(在此通过引用并入)中所述的那些微胶囊。可以例如按照上述制备方法将靶向配体与微胶囊的外壳形成组分结合，或通过将共价地结合于靶向配体的两亲性组分(如先前举例说明的那些两亲性组分)与形成微胶囊外壳的组分混合来将所述靶向配体掺入微胶囊。
其他赋形剂或添加剂可以存在于微囊泡的干燥制剂中，或者可与用于其重建的含水载体一起加入，而不必参与(或仅部分参与)微泡的稳定化外壳形成。这些赋形剂或添加剂包括pH调节剂(诸如组氨酸)、重量摩尔渗透压浓度调节剂、粘度增强剂、乳化剂、填充剂等，并且可以以常规量使用。例如，可使用诸如聚氧丙烯二醇和聚氧乙烯二醇的化合物及其共聚物。粘度增强剂或稳定剂的实例是选自线性和交联的多糖和低聚糖、糖类和亲水性聚合物诸如聚乙二醇的化合物。
由于充气微泡的制备可能涉及冷冻干燥或喷雾干燥步骤，因此可有利地在制剂中包含冻干添加剂，诸如具有低温保护和/或冻干保护作用的试剂和/或填充剂，例如氨基酸诸如甘氨酸；碳水化合物，例如糖诸如蔗糖、甘露糖醇、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖或环糊精，或多糖诸如葡聚糖；或聚氧亚烷基二醇诸如聚乙二醇。通常，冻干添加剂的量可以为微囊泡形成组分的量的约10至约1000倍(w/w)。
可使用任何生物相容性气体、气体前体或其混合物来填充上述微囊泡(在下文中也被表述为“微囊泡形成气体”)。
气体可包括例如空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；笑气；稀有气体(noble gas)或惰性气体，诸如氦气、氩气、氙气或氪气；放射性气体如Xe133或Kr81；超极化稀有气体诸如超极化氦气、超极化氙气或超极化氖气；低分子量烃(例如含有最多7个碳原子)，例如烷烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷或异戊烷、环烷烃诸如环丁烷或环戊烷、烯烃诸如丙烯、丁烯或异丁烯，或炔烃诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选诸如氟化气体，或卤化、氟化或全氟化低分子量烃(例如含有最多7个碳原子)；或任何前述物质的混合物。当使用卤代烃时，优选所述化合物中的至少一些，更优选全部卤素原子是氟原子。
氟化气体是优选的，特别是全氟化气体(尤其在超声成像领域)。氟化气体包括含有至少一个氟原子的材料，诸如，例如氟化烃(含有一个或多个碳原子和氟的有机化合物)；六氟化硫；氟化的，优选全氟化的酮类诸如全氟丙酮；氟化的，优选全氟化的醚诸如全氟二乙醚。优选化合物是全氟化气体，诸如SF6或全氟化碳(全氟化烃)，即其中所有氢原子被氟原子取代的烃，已知其形成特别稳定的微泡悬浮液，如例如在EP 0554213(其通过引用并入本文)中所公开的。
术语全氟化碳包括饱和的、不饱和的和环状的全氟化碳。生物相容性、生理学上可接受的全氟化碳的实例是：全氟烷烃诸如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟正丁烷，任选地与其他异构体诸如全氟异丁烷的混合物)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烃诸如全氟丙烯、全氟丁烯(例如全氟2-丁烯)或全氟丁二烯；全氟炔烃(例如全氟-2-丁炔)；和全氟环烷烃(例如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷和全氟环庚烷)。优选的饱和全氟化碳包括，例如，CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12和C6F12。
还可有利地以任何比例使用任何上述气体的混合物。例如，混合物可包括常规气体诸如氮气、空气或二氧化碳，以及形成稳定的微泡悬浮液的气体，诸如六氟化硫或如上所述的全氟化碳。合适的气体混合物的实例可以例如见于WO 94/09829(其通过引用并入本文)。以下组合是特别优选的：气体(A)和(B)的混合物，其中气体(B)是氟化气体，选自前面说明的那些氟化气体，包括其混合物，并且(A)选自空气、氧气、氮气、二氧化碳或其混合物。气体(B)的量可占总混合物的约0.5％至约95％v/v，优选约5％至80％。
特别优选的气体是SF6、C3F8、C4F10或其混合物，任选地与空气、氧气、氮气、二氧化碳或其混合物混合。
在某些情况下，包括气态物质的前体(即能够在体内转化为气体的物质)可能比较理想。优选地，气态前体和由其衍生的气体是生理学上可接受的。气态前体可被pH活化、光活化、温度活化等。例如，某些全氟化碳可以用作温度活化的气态前体。这些全氟化碳，诸如全氟戊烷或全氟己烷，具有高于室温(或生产和/或储存试剂的温度)但低于体温的液/气相变温度；因此，它们经历液/气相变并在人体内被转化为气体。
对于在MRI中的应用，微囊泡优选含有超极化贵气体诸如超极化氖气、超极化氦气、超极化氙气或其混合物，任选地与空气、二氧化碳、氧气、氮气、氦气、氙气或如上定义的任何卤代烃混合。
对于在闪烁照相术中的应用，微囊泡优选含有放射性气体诸如Xe133或Kr81或其混合物，任选地与空气、二氧化碳、氧气、氮气、氦气、氙气或如上定义的任何卤代烃混合。
用于NMR成像和治疗的金属螯合剂。
将金属离子(其可以是成像探针或放射疗法效应物)连接到生物分子(诸如本发明的嵌合蛋白)的最可靠和最常用的方法是通过双功能螯合剂，其具有金属螯合笼和共价连接生物分子的反应基团。
金属配位笼可分为环状的，诸如DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)或TETA(1,4,8,11四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸)，或线性的，诸如EDTA(乙二胺四乙酸)或DTPA(二亚乙基三氨基五乙酸)。
一旦选择了最合适的金属螯合笼或“螯合配体”，通过反应基团与目标生物分子的缀合可以通过固相合成或在溶液中进行。Lattuada L.等在Chem Soc.Rev,2011,40,3019-3049中综述了用于将金属螯合配体与其他部分，特别是生物分子缀合以制备被靶向的金属螯合剂的合成方法。
根据本段中公开的实施方案，金属可通过成像技术检测或用于治疗的放射性核素来检测。适合于成像的金属特别地包括可通过磁共振成像(MRI)检测的顺磁性金属离子，或可通过诸如闪烁照相术、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)的成像技术检测的放射性核素。
在本说明书中，术语：“螯合剂”、“螯合配体”或“螯合试剂”包括特征在于存在极性基团的化学部分、试剂、化合物或分子，所述极性基团能够与过渡金属或其他金属形成含有不止一个配位键的络合物。在本发明的一个优选方面，所述螯合配体包括环状或线性多氨基酸、多羧酸或多膦酸，并含有至少一个以游离或任选地活化的官能团形式存在的氨基、硫醇或羧基，适用于缀合靶向蛋白的官能团或合适的双功能接头。
接头可用作间隔子或用于改善整个分子的药代动力学性质。一些最常用的接头已概述于Liu S.和Edwards S.Bioconjugate Chem.2001,12:7-34中，以及关于肽缀合，公开于WO2008/071679中。
对于本文所用的术语“标记的”或“络合的”，即在“用金属标记的螯合配体”的上下文中，我们指的是与金属元素络合的配体，即呈与金属元素的螯合物或配位络合物的形式的配体。
对于术语“金属实体”或“金属元素”，我们指的是可通过成像技术检测的金属离子，或用于成像或治疗的放射性核素。该术语包括可通过磁共振成像(MRI)检测的顺磁性金属离子和可通过闪烁照相成像、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)检测的或适合于放射疗法的发射辐射的金属诸如放射性核素，如下定义的。
合适的螯合配体选自：多氨基多羧酸及其衍生物，包括例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物，包括苯并-DTPA、二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、苄基-DTPA和二苄基-DTPA、N,N-双[2-[(羧甲基)[(甲基氨甲酰基)甲基]乙基]-甘氨酸(DTPA-BMA)、N-[2-[双(羧甲基)氨基]-3-(4-乙氧基苯基)丙基)]-N-[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]甘氨酸(EOB-DTPA)、4-羧基-5,8,11-三(羧甲基)-1-苯基-2-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-酸(BOPTA)、N,N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]L-谷氨酸(DTPA-GLU)；DTPA-Lys(参见图3a的化合物1)；乙二胺四乙酸(EDTA)；1,4,7,10-四氮杂环十二烷1,4,7-三乙酸(DO3A)及其衍生物，包括例如[10-(2-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷1,4,7-三乙酸(HPDO3A)；1,4,7-三氮杂环壬烷N,N',N"-三乙酸(NOTA)；6-[双(羧甲基)氨基]四氢-6-甲基-1H-1,4-二氮杂-1,4(5H)-二乙酸(AAZTA)及其衍生物，例如如WO03/008390(通过引用并入本文)中所公开的，1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)及其衍生物，包括例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA、(α,α',α”,α”')-四甲基-1,4,7,10四氮杂环十四烷-1,4,7,10四乙酸(DOTMA)；或1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N”,N””-四乙酸(TETA)；或其中一个或多个羧基被膦酸和/或次膦酸基团取代的相应化合物，包括，例如、N,N’-双-(吡哆醛-5-磷酸)乙二胺-N.N'-二乙酸(DPDP)；乙二胺四(甲基膦酸)(EDTP)、1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸)(DOTP)、膦酰烷基-多氮杂大环化合物(例如在US 5,362,476和US 5,409,689中公开的)和在US 6,509,324中公开的线性膦酰烷基衍生物；或大环螯合剂诸如特沙弗林(texaphirines)、卟啉类化合物(porphyrins)、酞菁(phthalocyanines)。
在上述螯合配体中，特别优选的是：DTPA、DTPA-Glu、DTPA-Lys、DOTA和DOTA衍生物，诸如在EW and Orvig,Chem.Soc.Rev.2014,43:260中公开的那些，以及在Hermann等，Dalton Trans.,2008,3027-3047中公开的吡啶基-DO3A或例如在WO03/008394和WO2013/135750中描述的多齿配体AAZTA及其衍生物。
用于MRI的优选顺磁性金属元素是原子序数为20至31、39、42、43、44、49和57至83的那些金属元素。
甚至更优选的顺磁性金属离子选自下列：Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Ni(2+)、Rh(2+)、Co(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、Tb(3+)、Pm(3+)、Nd(3+)、Tm(3+)、Ce(3+)、Y(3+)、Ho(3+)、Er(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(3+)、Mn(2+)；Gd(3+)是最优选的。
核成像(放射性核素成像)和放射治疗
在本发明的另一个实施方案中，与本发明的选择素靶向嵌合蛋白连接的部分是放射性核素，其用于放射性成像(诊断)或放射疗法(治疗性应用)。
放射性金属螯合部分的主要特征涉及其在极度稀释(即从nM到pM浓度)的条件下的体内使用；然而，螯合部分与放射性金属之间的一些最合适的匹配是已知的，并概述于Price EW和Orvig C Chem.Soc.Rev,2014,43,260中。
对于放射成像，可将靶向剂与“放射成像可检测部分”(即可通过成像技术诸如闪烁照相成像、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)检测的部分)连接。
优选地，所述放射性成像可检测部分包含与螯合剂螯合的放射性核素(所述螯合剂通常是双官能的并且包含具有金属络合性质的螯合部分和用于连接生物分子的官能团，诸如本发明的选择素靶向剂)或者，可选地与生物分子直接连接(即碘)。
可制备与蛋白质上的胺或硫醇基团形成酰胺、硫脲、脲、希夫碱或硫醚键的官能团，其携带螯合剂，用可通过所述闪烁照相、SPECT或PET成像技术检测的放射性核素标记。
在任何情况下，最优选的螯合配体是线性的或更优选大环螯合配体，并且是上述的那些螯合配体，诸如DTPA，或更优选地，DOTA，其仍然代表许多同位素(包括111In、177Lu、86/90Y、225Ac和44/47Sc)的金标准，并且已与67/68Ga一起被广泛地使用，尽管最近被其更稳定的NOTA和DOTA衍生物取代。
放射性核素的螯合配体的其它合适实例可选自线性、大环、三联吡啶和N3S、N2S2、N2S3、N2S4、N3S3或N4螯合剂，包括例如US 5,367,080、US 5,364,613、US 5,021,556、US 5,075,099和US 5,886,142中公开的配体，以及本领域已知的其他螯合配体，包括但不限于6-肼基吡啶-3-羧酸(HYNIC)，或1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(TETA)；和双-氨基双-硫醇(BAT)螯合剂，诸如例如US 5,720,934中公开的那些，或多氮杂大环化合物的磷酸衍生物，诸如WO2005/062828中描述的那些。
N4螯合配体也描述于例如US 5,608,110,US 5,665,329、US 5,656,254和US 5,688,487中。某些N3S或N2S2螯合剂描述于例如US 5,659,041、US 5,574,140、US 5,780,006、US 5,662,885和US 5,976,495中。螯合剂还可包括螯合配体巯基-乙酰基-乙酰基-甘氨酰-甘氨酸(MAG3)的衍生物，其含有N3S和N2S2体系诸如MAMA(单酰胺单胺二硫醇)、DADS(N2S二胺二硫醇)、CODADS等。这些配体系统和各种其它配体描述于Liu和,Chem Rev,1999,99,2235-2268和其中引用的文献中。
螯合还可包括含有配体原子的络合物，所述配体原子不以四配位基阵列的形式提供给金属。这些包括锝和铼二肟的硼酸加合物，例如US 5,183,653、US 5,387,409和US 5,118,797中所述的。
在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白或多肽的二硫键用作螯合放射性核素诸如99mTc的配体。这样，通过引入Tc(肽-S-S-肽改变为肽-S-Tc-S-肽)来扩大肽环。
根据本发明的优选放射性核素包括，例如：99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、167Tm、141Ce、111In、113In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Au、111Ag、199Au、51Mn、52mMn、52Fe、60Cu、72As、94mTc、or 110In、142Pr、159Gd。
放射性核素的选择将基于所需的治疗或诊断应用。例如，出于治疗目的(例如，为原发性肿瘤和转移提供放射疗法)，优选的放射性核素可包括64Cu、90Y、105Rh、111In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、175Yb、177Lu、186/188Re和199Au，其中186/188Re、177Lu和90Y是特别优选的。出于诊断目的(例如，为了定位炎症和在治疗后监测其发展)，优选的放射性核素可包括64Cu、67Ga、68Ga、99mTc和111In。99mTc因其低成本、可用性、成像性质和高比活性而对于诊断应用是特别优选的。特别地，99mTc的核和放射性质使该同位素成为理想的闪烁照相成像剂。事实上，该同位素具有140keV的单光子能量和约6小时的放射性半衰期，并且可以从99Mo-99mTc发生器容易地获得。
用于PET成像的优选金属放射性核素是发射正电子的金属离子，例如：51Mn、52Fe、60Cu、68Ga、72As、94mTc或110In。
优选的螯合配体是用于111In和放射性镧系元素诸如例如177Lu、90Y、153Sm和166Ho，或用于67Ga、68Ga、61Cu、62Cu、64Cu或67Cu的那些，其选自：
具体地，对于包括111In和放射性镧系元素诸如例如177Lu、90Y、153Sm和166Ho的金属实体，特别优选的是下列配体残基：
其中在上式a)和b)中，R是烷基，优选甲基。
对于放射性99mTc、186Re、188Re，特别优选的是以下d)至l)的下列螯合部分：
这些和其它金属螯合基团例如描述于US 5,608,110，US 6,143,274，US 5,627,286，US 5,662,885，US 5,780,006和US 5,976,495中。
另外，上述式c)的螯合基团描述于US 6,143,274中；上述通式h)和i)的螯合基团描述于US 5,627,286和US 6,093,382中；式I)的螯合基团描述于US 5,662,885、US 5,780,006和US 5,976,495中。
在式h)和i)中，X为CH2或O，Y为C1-C10支链或无支链烷基；Y为芳基、芳氧基、芳基氨基、芳基氨基酰基；Y为芳基烷基，其中与芳基部分附接的一个或多个烷基为C1-C10支链或无支链烷基基团、C1-C10支链或无支链羟基或多羟烷基基团或聚烷氧基烷基或多羟基-聚烷氧基烷基基团，J为>C(＝O)、–OC(＝O)–、–SO2–、>NC(＝O)–、>NC(＝S)–、–N(Y)–、–NC(＝NCH3)–、–NC(＝NH)–、–N＝N–、衍生自合成或天然存在的氨基酸的均聚酰胺或杂聚胺；其中n为1-100。这些结构的叶酸衍生物描述于例如US 6,093,382中。
对于闪烁照相术更优选的是放射成像造影剂，其包含用99mTc标记的上述a)至l)的上述配体残基之一作为成像可检测部分。
用标记的糖进行PET成像
在本发明的又一个实施方案中，将融合蛋白与标记的糖部分连接，以用于PET成像。
优选地，所述糖部分通过用放射性核素(诸如，例如124I、125I、131I、123I、77Br、76Br和18F)卤化来标记；18F是特别优选的。
光学成像
在一些实施方案中，将光学成像剂缀合于本发明的嵌合蛋白。在光学成像剂中，用于体内、离体和体外成像应用的荧光染料是本领域技术人员所熟知的，并且已开发出多种对体内荧光成像最佳的荧光染料，所述荧光染料也可商购获得。这些试剂在不同程度上最大化了组织穿透深度、荧光发色团的光散射和荧光发射性质，以提供最佳的信号-背景比。通常，光吸收和散射随着波长的增加而减小；在约700nm以下，这些效应导致几毫米的浅穿透深度，而900nm以上则水吸收可以干扰信号-背景比。因此，在近红外(NIR)区域(700-900nm)具有激发/发射的荧光染料迄今为止主要用于在小动物中以及潜在地在人中进行体内成像。
其中最常用的是：吲哚青绿、花青衍生物Cy3、Cy3.5、Cy5和Cy5.5、Cy7(花青染料和衍生物可供使用，即由GE Healthcare提供)、LS-287、LS-288、800CW、IR-820、-806、IR-786、800RS、750、650(s可从Li-CorBioscience获得)、Alexa647、Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa680、Alexa750(Alexa染料可以例如从Invitrogen获得)、其组合等，其化学结构已在例如WO2014/191467中进行了报道。
已例如在Gibbs S.L.Quant Imaging Med Surg2012,2(3):177-187中描述了用于图像引导的手术的大多数化合物的结构及其商业可获得性。特别优选的是被开发用于NIR成像的花青染料及其化学衍生物，诸如：Cy5.5、800CW、800RS和750。
用途
上述靶向诊断剂特别适用于体内和离体成像。本发明的嵌合靶向蛋白还可用于治疗目的，其包括用于治疗患者的疾病的任何方法，其中使用本发明的嵌合靶向蛋白，任选地与成像剂结合，以向表达选择素的细胞、组织或器官离体和/或体内递送治疗性化合物，即能够发挥或负责发挥生物学作用的分子。
通常，该用途涉及本发明的嵌合蛋白与被赋予生物活性的试剂/部分/分子(诸如细胞因子、细胞抑制剂(诸如多柔比星、甲氨蝶呤、顺铂、长春碱、长春新碱等)、毒素、抗炎剂、免疫调节剂诸如细胞因子抑制剂、抗聚集剂、皮质类固醇、单克隆抗体、生长因子和上述放射治疗剂(包含具有放射性核素的金属螯合部分)的缀合，籍此而将生物活性部分靶向表达选择素的组织/细胞/器官，其中在所述组织/细胞/器官中观察或检测到炎症。
用于诊断和/或治疗目的的病理性炎性病症的特征应当在于高于生理学的选择素表达水平；选择素优选为E-选择素和/或P-选择素，更优选为P-选择素。特别地，本发明的成像剂可用于检测血管内皮的炎性病症，诸如下面列出的炎性病症。
更优选地，病理性炎性病症选自特征在于高于生理水平的选择素表达水平的以下病症：急性冠脉综合征(ACS)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、与肿瘤相关的新血管生成、类风湿性关节炎、缺血再灌注损伤、移植物排斥，或更一般地，表达高于生理水平的P-选择素和/或E-选择素的任何器官或组织的病症。
更优选地，本发明的嵌合蛋白是用于IBD、ACS、肿瘤检测和移植物排斥的有用靶向剂。
此外，根据本发明的靶向成像剂在患有炎性疾病或病理的患者的(治疗性)治疗期间(其中“在...期间”包括在治疗开始之前的任何时间，在所述治疗的过程中和/或在所述治疗结束时)用作高效诊断工具，以对其监测和评估。例如，本发明的靶向成像剂可有利地用于抗炎治疗(例如任何上述疾病或病理学的治疗)的监测和/或随访，例如，以确定或评估施用抗炎或炎症抑制剂药物对疾病或病理学的影响。
例如，在IBD中，本发明的靶向成像剂可用于跟踪对利用例如美沙拉嗪、皮质类固醇、甲氨蝶呤或英夫利昔单抗的治疗性治疗的反应，并根据患者对治疗性治疗的反应而对患者进行分层或监测缓解维持治疗。优选地，成像技术基于用于超声检测的嵌合可溶性蛋白靶向微泡。
在一个优选实施方案中，在治疗期间，例如按规则的时间间隔，在每次药物施用或治疗干预后和/或在选定次数的药物施用或治疗后以预定的时间间隔，使患者的目标区域在施用本发明的靶向成像剂时经受选择的成像检测系统；然后优选在治疗结束或完成时进行目标区域的最终成像。
还可将本发明的靶向成像剂用于超声相关技术，例如用于治疗相关成像，其中它们有利地与通过高声压(通常高于非破坏性诊断成像方法中通常使用的声压)下的超声波产生的充气微囊泡受控局部破坏相关联。例如，这种受控破坏可用于治疗血凝块(一种也称为超声溶栓的技术)，任选地与释放与造影剂相关的合适的治疗性化合物组合。或者，所述治疗相关成像可包括将治疗剂递送到细胞中，这是由于微囊泡的局部破裂或活化诱导的细胞水平的瞬时膜透化作用的结果。例如，该技术可用于将遗传物质有效递送到细胞中；或者，可以局部递送药物(任选地与遗传物质组合)，从而允许患者的联合药物/遗传疗法(例如在肿瘤治疗的情况下)。可以按照常规方法将治疗剂与充气微囊泡结合，或者可其作为组合物的单独化合物施用。另外，靶向剂可用于通过在暴露于超声之后瞬时打开血脑屏障来促进治疗剂向脑组织的递送。
通常，将有效量的靶向诊断剂施用(例如通过注射)给有此需要的患者，并且使待成像或治疗的患者的身体部位或组织(“目标区域”)经历期望的成像方法。优选地，静脉内施用造影剂。术语患者包括出于诊断/治疗目的或出于实验目的(包括例如在实验室动物中使用造影剂，例如以跟踪实验性治疗性治疗)经历造影剂施用的任何受试者(人或动物)。
根据一个优选实施方案，通常通过注射其悬浮液而向患者施用有效量的靶向微囊泡。因此，目标区域的成像可因与靶标结合的微囊泡在目标区域中的存在而获得增强。
在超声应用中可以采用各种成像技术，例如包括基本和非线性(例如谐波)B模式成像、脉冲或相位反转成像以及基本和非线性多普勒成像；如果需要，可使用三维或四维成像技术。此外，还设想了需要破坏(例如通过高声压下的超声波)充气微囊泡的诊断技术，其为高灵敏度的检测方法。
根据本发明的微囊泡通常可以以每kg患者约0.01至约5.0μl的气体(捕获在微囊泡内)的浓度施用，这取决于例如它们各自的组成、待成像的组织或器官和/或所选择的成像技术上。该一般浓度范围当然可以根据具体的成像应用而变化，例如，当可以以非常低的剂量(诸如在彩色多普勒或功率脉冲反转中)观察信号时。可能的其他诊断成像应用包括闪烁照相术、光学成像、光声成像、磁共振成像和X射线成像，包括X射线相衬成像。
还可将超声成像方法方便地与MRI结合使用(如上针对组合(或融合)成像方法所提及的)以实现受影响的病变的更好作图。
药物组合物
本发明还包括包含根据设想的用途缀合或修饰的上述公开的嵌合蛋白的药物组合物，可将其局部或胃肠外(包括鼻内、皮下、肌内、静脉内、动脉内、关节内或病灶内施用)施用。通常，静脉内(i.v.)、动脉内、关节内、心内施用是优选的。
将作为活性成分的本发明分子溶解、分散或混合在药学上可接受的并与所述活性成分相容的稀释剂或赋形剂中，这在本领域中是公知的。合适的赋形剂是例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。其他合适的载体是本领域技术人员所公知的。另外，如果需要，该组合物可含有少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、稳定剂和/或pH缓冲剂。
根据本发明的药物组合物可通过例如常规混合、溶解、制粒、研磨、粉碎、制锭、粉化、乳化、包封、包埋或冻干方法来制备。
因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可以药学上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的施用途径。
对于注射，可将本发明的化合物配制在水溶液中，优选还包含合适的赋形剂或稳定化合物的生理上相容的缓冲液诸如Hank溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液中。
口服施用可通过液体或固体组合物来实现。在后一种组合物中，还给锭剂核心提供合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加到片剂或锭剂包衣中以用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
口服施用的固体组合物包括由明胶制成的推入式胶囊(push-fit capsules)以及由明胶和增塑剂诸如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入式胶囊可含有与填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)、润滑剂(诸如滑石粉或硬脂酸镁)和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可以添加稳定剂。用于口服施用的所有制剂应该以适合于所选择的施用途径的剂量存在。对于口腔施用，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
在根据本发明的一个实施方案中，口服施用肽(例如作为糖浆、胶囊或片剂)。在某些实施方案中，可通过使用保护性赋形剂来增强肽递送。这通常通过将肽与组合物复合以使其抗酸和酶促水解或通过将肽包装在适当的抗性载体诸如脂质体中来实现。保护用于口服递送的肽的方法是本领域熟知的。
压缩片剂可通过在合适的机器中压制呈自由流动形式(诸如粉末或颗粒)的活性肽(任选地与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合)来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末肽的混合物来制备。可以任选地对片剂进行包衣或刻痕，并且可使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素(以提供所需的释放曲线)将其配制来使其中的活性成分缓慢或受控释放。
糖浆可通过将活性肽加入到浓缩的糖(例如蔗糖)水溶液中来制备，也可向其中加入任何必需的成分。这些辅助成分可包括调味剂、延缓糖结晶的试剂或增加任何其他成分的溶解度的试剂(诸如多元醇，例如甘油或山梨糖醇)。
对于吸入施用，根据本发明使用的变体可以通过使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)，以气溶胶喷射的形式从加压包装或喷雾器方便地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量量的阀来确定。可以配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其含有肽和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
用于肠胃外施用的药物组合物包括呈水溶形式的活性成分的水溶液。另外，适当时可将活性化合物的悬浮液制备成油性注射悬浮液。合适的天然或合成载体是本领域熟知的。悬浮液还可含有合适的稳定剂或试剂，其增加化合物的溶解度或者嵌合蛋白质或缀合基团的稳定性，以允许制备浓缩溶液。或者，活性成分可以呈粉末形式，以在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重建。
还可使用例如常规的栓剂基质诸如可可脂或其它甘油酯将本发明化合物配制成直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂。
通过使用持续释放蛋白质或脂质作为“包装”系统，可以维持延长的血清半衰期。这种持续释放系统是本领域技术人员所公知的，并且可包括原样配制嵌合蛋白或以缀合形式将嵌合蛋白配制成纳米球、纳米囊泡或脂质体。
前述制剂和施用方法旨在是说明性的而非限制性的。应当理解，通过使用本文提供的教导，可以容易地设计其他合适的制剂和施用方式。
适用于本发明上下文的药物组合物包括其中以有效地实现预期目的的量含有活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量是指有效预防、延迟、缓解或改善所治疗的受试者的疾病症状的化合物的量。根据例如Goodman&Gilman，第9版，JG Hardman,A.Gilman,LELimbird,Chapter I“Pharmacokinetics”，第3-27页，治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
因此，本发明还包括用于出于治疗目的或优选诊断目的而将上文公开的嵌合蛋白原样或优选作为缀合物向有此需要的人施用的方法。
出于诊断目的，取决于诊断方法的施用途径和灵敏度，可以以合适的剂量预先施用本发明的药物组合物，然后通过最适合的技术进行成像。
实验部分
实施例1:带标签的重组融合蛋白的制备和表达
制备了许多DNA构建体：
PSGL变体1：该序列编码成熟PSGL-1蛋白的氨基酸1-47、IgG1铰链区、NRL的亮氨酸拉链结构域、甘氨酸(G4SG4)间隔子和用于亲和力识别的FLAG序列。小鼠IgH信号肽用于分泌。变体1嵌合蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。
PSGL变体2，其编码成熟PSGL-1蛋白的氨基酸1-47、IgG1铰链区、具有K->A序列替换的IgG1CH3区。小鼠IgH信号肽用于分泌。C末端的FLAG序列(SEQ ID NO:35)用于纯化目的。嵌合蛋白具有SEQ ID NO:4。
PSGL变体3：编码与IgG1铰链区、成熟PSGL-1蛋白的区域275-290和用于鉴定和纯化目的的C末端处的FLAG序列(SEQ ID NO:35)共价连接的成熟PSGL-1蛋白的氨基酸1-47。小鼠IgH信号肽用于分泌。嵌合蛋白具有SEQ ID NO:6。
PSGL变体4编码与IgG1铰链区和人IgG1Fc区的aa 1-15共价连接的成熟PSGL-1蛋白的氨基酸1-47。小鼠IgH信号肽用于分泌。C末端的FLAG序列(SEQ ID NO:35)用于纯化目的。嵌合蛋白具有SEQ ID NO:8。
PSGL变体5编码PSGL-1蛋白的氨基酸1-88(根据GI:2498904)，其内源信号和前肽序列与IgG1铰链区和人IgG1Fc区的aa 1-15共价连接。用于亲和力识别的C-末端的FLAG序列(SEQ ID NO:35)用于纯化目的。嵌合蛋白具有SEQ ID NO:10。
小规模瞬时转染
根据制造商的说明(2015年7月)，将CHO-S，一种悬浮适应的中国仓鼠卵巢细胞系(FreedomTM CHO-STM试剂盒，GIBCO ThermoFisher Scientific)在潮湿的5％CO2培养箱中于37℃培养在补充有L-谷氨酰胺(Cellgro,Catalog# 61-030-RO,Lot# 61030158)的化学成分确定的培养基CD-CHO(Invitrogen,Carlsbad CA，目录号12490-025，批号1149771)中。在培养CHO-S细胞中不使用血清或其他动物来源的产品。转染前24小时，将细胞接种在摇瓶中，并使用无血清的化学成分确定的培养基进行培养。通过电穿孔将变体1-5表达构建体(每种质粒250μg)瞬时转染到0.05升悬浮CHO细胞中。简言之：使用Maxcyte电穿孔仪，利用50％EP缓冲液和QC400比色杯转染250x 106个CHO细胞。在收获之前，使用无血清培养基使细胞生长7天。
在收获时进行的Western印迹证明了PSGL-1变体的相对表达。在非还原条件下针对条件培养基的特异于FLAG标签的Western印迹分析证实了蛋白质二聚化。条件培养基中的变体1在还原条件下显示～22kDa的预期分子量(图1，泳道2)。其在非还原条件下正确地形成二聚体(图1，泳道7)。在条带1-5中发现的高分子条带很可能是与抗FLAG抗体(抗FLAG抗体，单克隆小鼠IgG1，Sigma-Aldrich，目录号F1804)非特异性结合的分子。
在泳道3(变体2)的情况下，较低分子量的条带可能是降解产物。
针对条件培养基的western印迹用抗体进行，该抗体识别位于所有变体C-末端的Flag表位，因此指示分泌到培养基中的嵌合蛋白的不同构建体的相对量。
带标签(FLAGGED)变体的纯化
通过离子交换和抗FLAG亲和纯化进行纯化。对于五种变体中的每一种，在通过0.2μM过滤澄清后，通过加入1M HCl将条件培养基调节至pH 6，并用蒸馏水将体积加倍。然后将CM加载到1mL阴离子交换色谱柱(Q柱，GE)上，并在20mM Tris pH 7.5,1M HCl中洗脱。将洗脱级分施加到0.5mL抗FLAG亲和M2树脂中，并在室温下摇动5小时。用10mL Tris缓冲盐水洗涤树脂。用5倍柱体积的Tris缓冲盐水中的100μg/mL FLAG肽洗脱蛋白质。对于PSGL变体1，将流出物用抗FLAG M2树脂在4℃下重新孵育过夜，并使用0.25％乙酸pH 3.5进行洗脱。
纯化的PSGL变体1-5的银染SDS-PAGE和OD220分析表明变体1在5种构建体中具有最高的纯度和表达水平。
下表3中给出了通过用牛血清白蛋白的系列稀释物产生标准曲线并将来自PSGL变体的数据与该曲线拟合而计算的OD220处的蛋白质浓度。
表3：离子交换和亲和纯化后蛋白质变体1-5的回收
变体1 变体2 变体3 变体4 变体5
量(mg) 0.41 0.07 0.02 0.02 0.03
在五种构建体中，PSGL变体1具有更高的产率：与其他变体相比，最高表达水平和所得纯度高出至少一个对数。在还原和非还原条件下的Western印迹和银染SDS-PAGE均表明PSGL变体1正确二聚化。
实施例2：变体1A(无FLAG)的表达和纯化
然后根据FreedomTM CHO-STM试剂盒手册(Cat.N A13696-01 LifescienceThermofisher Scientific，2015年7月)产生稳定的CHO-S细胞稳定转化体，其共表达编码核心2β-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶(C2GnT-M)、FTVII(岩藻糖基转移酶VII)(Fugang Li等，J.Biol.Chem,1996,271:3255-3264)和包含SEQ ID NO:1的aa 1-118并且无FLAG序列的嵌合蛋白的DNA序列。
使用OptiCHOTM培养基(其它无血清的化学成分确定的培养基已被成功地使用，例如，ActiCHOTM,CD FortiCHOTM等)并在选择压不存在的情况下使CHO-S克隆生长至少7天，通常长达14天。以1-10mM，优选4-8mM补充谷氨酰胺(或类似物GlutMax)。
收集来自6个稳定CHO克隆的混合物的100mL上清液，将其在0.2μm PES膜上过滤并加载到用20mM TRIS-HCl pH 7.5预平衡的强阴离子交换Capto Q柱(GE 17-5316-02,1.6x6cm,12mL)上。
用超过8个柱体积的高达1M NaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质。含有目标蛋白的洗脱级分(如通过SDS-PAGE分析所示的)用于第二苯基疏水相互作用色谱纯化步骤。
将柱用1M NaOH洗涤，然后用20％EtOH平衡并在4℃于其中储存。
将NaCl溶解在合并的级分中至浓度为4M。然后根据制造商的关于疏水相互作用色谱的说明书将该合并物加载到预先用20mM TRIS-HCl pH 7.5,4M NaCl平衡的1mL HIC柱(HiTrap Phenyl HPTM,GE Healthcare Life Sciences,Catalog#17-1351-01)上。通过在10个柱体积中将氯化钠浓度线性降低至零来实现洗脱。将含有靶蛋白的级分(如通过SDS-PAGE分析显示的)合并在一起用于第三个尺寸排阻色谱(SEC)步骤。用20mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl(其用作流动相)预平衡SEC柱(HiLoad 16/600Superdex 200TM pg,GEHealthcare Life Sciences，目录号28-9893-35)。合并含有嵌合PSGL变体1的级分(如通过SDS-PAGE分析显示的)并将其浓缩(Amicon Ultra Centrifugal Filter Uni t,EMDMillipore)。
作为对SDS-PAGE的更灵敏的替代方法，如说明书手册中所述，使用Phast-System(GE)进行Western印迹分析。将硝酸纤维素膜用PBS+1％BSA饱和(室温下进行1小时)。将膜在室温下与含有抗P-选择素糖蛋白配体-1抗体1:1000(抗P-选择素糖蛋白配体-1抗体，克隆KPL-1,EMD Millipore,cod.MAB4092)的PBS+0.5％Triton X-100+1％BSA一起孵育1小时。
用PBS+0.5％Triton X-100洗涤3次后，将膜与作为二抗的抗小鼠IgG-HRP一起孵育。
在3次洗涤后，用ECL对HRP信号进行显影，显示阳性抗PSGL-1抗体识别。
来自不同亚克隆的嵌合PSGL变体1A显现为约60kDa的单一条带，如所预期的那样，其在还原条件下移位至约30kDa。在纯化产物的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶中没有看到额外的条带和降解产物。
选择一个克隆用于进一步亚克隆，使其中等规模生长并在2L培养基规模上纯化。
实施例3：纯化的变体1A的表征
PSGL变体1A重组蛋白由于不同的翻译后修饰(包括硫酸化以及N-和O-糖基化)而具有高度异质性。对于其的完全表征和正确定量，使用一组分析方法，包括UPLC、MS和利用特定酶的肽作图方法。还仔细地监测对其生物活性至关重要的PSGL变体1A的结构特征。
3.1.UPLC-UV
反相色谱用于测定靶蛋白质含量并定量可能的杂质或降解产物。对于反相色谱实验，以梯度模式在50℃下使用Acquity UPLC BEH300柱(2.1x100mm，1.7μm)。流动相为(A)0.1％TFA的水溶液和(B)0.1％TFA的乙腈溶液。UV检测在216nm下进行。UPLC技术的使用与专用的亚2μm色谱柱相结合可提高分辨率，提高灵敏度，产生优异的峰形和显著缩短分析时间。UPLC-UV方法显示通过纯化方法获得的PSGL变体1A纯度高于90％。
3.2.SEC-UV
使用与UV检测偶联的尺寸排阻色谱法(SEC)(也称为凝胶渗透色谱法(GPC))，其允许基于其有效大小或形状(流体动力学半径)分离蛋白质。在这种情况下，该方法用于测量可能的聚集体和其他尺寸的变体。对于尺寸排阻色谱实验，以等度模式在30℃下使用TSKgel super SW mAb HTP 4.6x150mm(Tosoh),4μm柱。流动相为50mM NaH2PO4,50mM Na2HPO4,100mM Na2SO4，并且在216nm下进行UV检测。使用经优化以减少柱外谱带展宽的UPLC仪器使得能够实现高的柱效率和增加的灵敏度。SEC-UV方法用于分析PSGL变体A-1：未观察到聚集。
3.3.唾液酸含量
众所周知，唾液酸化是生物制药产品的生物利用度、稳定性、代谢和免疫原性的关键特征。为此目的，开发了HPLC MS方法用于嵌合蛋白变体1A的唾液酸测定。
该分析基于与与电喷雾电离串联质谱连接的无衍生化液相色谱(LC-MS/MS)偶联的化学水解方法的组合。首先在温和的酸性条件下通过酸水解从PSGL变体1A中释放唾液酸(N-乙酰神经氨酸NANA)。一旦唾液酸被释放，通过使用LC-MS/MS方法进行定量。通过比较样品中的响应与参考标准校准曲线来测定唾液酸量。在用从其他CHO亚克隆纯化的蛋白质进行的实验中，发现唾液酸化通常为9.6至17.9％w/w。
3.4.MALDI-TOF-MS
还进行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析以测定PSGL变体1A分子量。该技术包括将样品与基质混合，然后将其涂覆在板或探针上，并经历准直聚焦激光束，引起电离和解吸。MALDI具有产生大质量离子的优点，具有高灵敏度和几乎无片段化。在完整和还原的形式下，对PSGL变体1A进行MALDI-TOF实验。如通过MALDI实验所测定的，PSGL变体1A的平均分子量测量为约35.4kDa。用DTT还原导致PSGL变体1A质量减少至1/2，表明纯化的蛋白质的二聚体性质。
3.5.肽作图(酶促消化)
肽作图(PMAP)用于阐明嵌合糖蛋白的翻译后修饰(PTM)，包括硫酸化和N-及O-糖基化。为此目的，将胰凝乳蛋白酶和Asp-N用于蛋白质消化，然后进行LC-MS液相色谱-质谱分析。
3.5.1.用胰凝乳蛋白酶片段化
根据制造商提供的方案(胰凝乳蛋白酶内蛋白酶MS级，Cat.N.90056,ThermoScientific)进行胰凝乳蛋白酶片段化。将一小瓶干燥的胰凝乳蛋白酶在25μL的0.1M HCl中重建，并在使用前将其作为500μL eppendorf管中的2μL等分试样于-18℃下储存。为了制备消化缓冲液(由100mM Tris HCl pH 8,10mM CaCl2组成)，将3.03g的Tris Base(M121.4g/mol)和368mg CaCl2(M 147.02g/mol)组成)溶于水中。使用1.2M HCl将pH调节至8.0，并使体积达到250mL。
将五十(50)μL的PSGL-1变体1A原液(0.5-1.0mg/mL)加入到2μL胰凝乳蛋白酶和48μL消化缓冲液中。将溶液在37℃孵育18小时，然后注入LC-MS。
3.5.2.利用内切蛋白酶Asp-N的片段化
按照制造商提供的方案(Asp N测序级Roche,Cat.N.11054589001)进行内切蛋白酶Asp-N片段化。将一小瓶干燥的Asp-N在50μL水中重构，并在使用前作为500μL Eppendorf管中的5μL等分试样于-18℃下储存。为了制备由50mM磷酸钠组成的消化缓冲液，将1.5gNa2HPO4(M 119.98g/mol)溶于水。使用1M NaOH将pH调节至8.0，并使体积达到250mL。
将十(10)μL的PSGL-1变体1A原液(0.5-1.0mg/mL)加入到5μL胰凝乳蛋白酶和35μL消化缓冲液中。将溶液在37℃孵育18小时，然后注入LC-MS。
将类似的LC-MS分析用于表征Asp-N和胰凝乳蛋白酶消化物。这些实验使用WatersUPLC系统来进行，该系统由温控样品管理器、二元溶剂管理器和加热柱室组成。柱出口直接连接到质谱仪。分析柱是来自的120EC-C182.1x 150mm i.d.，粒度2.7μm，温度为40℃。使用由含有0.1％TFA的超纯水和含有0.1％TFA的乙腈组成的流动相，以梯度模式从柱中洗脱化合物。流速和注射体积分别设定为0.3mL/分钟和10μL。根据化合物，在配备有正和负电离模式的电喷雾电离源的Waters Xevo TQ S串联四极质谱仪上进行检测。氮气和氩气分别用作雾化气体和碰撞气体。以扫描模式进行分析。借助MassLynx软件包进行数据采集和处理。
所有上述分析都得出以下结论：
·PSGL-1变体1A糖蛋白的N-末端结构由焦谷氨酸形式pQATEYEYL主导。
·PSGL变体1A的二聚体特征通过归因于(50TCPPCPL56)2序列的(M+2H)+2＝728.5的存在得到证实。未检测到对应于该肽的单体形式的离子，表明PSGL变体1A完全呈二聚体形式。
·证实了Thr16上的O-聚糖残基的结构：实际上，鉴定了预期的唾液酸-路易斯-X基序，一种包含N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖、岩藻糖和唾液酸的核心2结构。
·在负扫描模式下，通过质谱法也证实了酪氨酸5、7和10的硫酸化。
已在SEQ ID NO:38中报道了大多数翻译后修饰(PTM)。
实施例4：通过表面等离子体共振(SPR)测定对P-选择素的亲和结合
如WO2012/020030的实施例2所述利用纯化的蛋白质Fr1和如上文实施例2中所述的变体1A进行实验。
使用来自GE Healthcare Bio-Sciences AB(General Electric,Piscataway,NJ)的Biacore X100，通过表面等离子体共振(SPR)评估PSGL变体1A的结合强度。SPR技术允许实时监测生物分子之间的结合过程而无需标记。当将P-选择素(靶配体)附接于传感器芯片表面时，使用微流体系统，使目标蛋白在溶液中流过表面，以确保可重现的样品递送和低样品消耗。SPR将结合事件检测为芯片表面处质量的变化。因此，通过将SPR响应相对时间绘图来生成传感图。
首先，在内部进行P-选择素/Fc(R&D Systems Europe Ltd)的生物素化。然后，如下将P-选择素/Fc固定在SA芯片(链霉抗生物素蛋白芯片，GE Healthcare Bio-Sciences)的工作传感器(Fc2)上：用9体积的Milli-Q水(450mL)稀释1体积的10x HBS-N缓冲液(GEHealthcare Bio-Sciences AB)(50mL)。将500微升pH为约5.6的CaCl2 1.5M(Fluka)加入稀释的缓冲液(最终1.5mM)中，并通过0.2μm PES过滤器过滤。在50mL Falcon管中用48.75mL的HBS-N,CaCl21.5mM缓冲液和1.250mL的表面活性剂P20(GE Healthcare Bio-SciencesAB)制备运行缓冲液。将不立即使用的HBS-N缓冲液和1.5mM CaCl2在+4℃下储存。
将待测试的每个样品在运行缓冲液中稀释以达到125nM的指定浓度。在参考传感器(Fc1)和Fc2上以30μL/分钟的流速开始手动运行。选择基准减法(Referencesubtraction)2-1。一旦基线稳定，就注入分析物，持续30秒，或者如果没有达到结合平衡，则持续更长时间。为了直接比较不同分析物或不同浓度的相同分析物的结合，有必要为每个样品制定相同的循环参数，例如：
等待120秒。
注射30秒
等待300秒。
当手动运行完成时，打开Biacore X100评估软件1.0版，创建每个循环的覆盖(overlay)。
基于SPR实验，测量对P-选择素的结合亲和力，发现嵌合蛋白与靶标的结合强度等于或优于Fr1结合。图2显示了Biacore运行的结果，其中本发明的嵌合蛋白(阴影线)相对于Fr.1显示出与P-选择素配体有改善的结合。
根据Chou T-H等Cytokine 51,2010,107-111中描述的方法，还将SPR用于细胞上清液中的变体1A滴定。用链霉抗生物素蛋白和在Bracco生物素化的小鼠α-PSGL-1抗体(KPL-1，Abcam,cat.N.ab78188)覆盖传感器芯片，用于定量上清液中的变体1A。
实施例5：用于磷脂缀合的变体1A-SMCC的制备
根据WO2012/020030的实施例9进行该方法。
简言之，将来自实施例2的变体1(65nmol)溶于1mL含有1mM EDTA的0.2M pH 7.5的磷酸盐缓冲液。在无水二甲基亚砜(DMSO,Fluka)中制备磺基-SMCC(磺基-SMCC：磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)(Pierce)(55mg/mL-125mM)的溶液，并将52μL的该溶液加入到变体1溶液中。将溶液在室温下孵育45分钟。然后通过在20mM pH 6的磷酸盐缓冲液中平衡的旋转柱(Zeba旋转柱5mL，Pierce#89890)将溶液离心。向溶液中加入异丙醇，以获得含有35％异丙醇的溶液。
实施例6：缀合物DSPE-PEG-SH的制备
根据WO2012/020030的实施例10从DSPE-PEG2000-PDP(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(聚乙二醇)-2000]铵盐)制备DSPE-PEG2000-SH(DSPE：用PEG2000修饰的二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)。用异丙醇稀释DSPE-PEG2000-SH的终溶液，得到含有35％异丙醇的溶液。
实施例7：DSPE-PEG-SH/变体1A-SMCC缀合物的制备
将实施例5中获得的1.7mL变体1A-SMCC(65nmol)溶液加入到实施例6中获得的DSPE-PEG2000-SH(325nmol-5当量)的溶液中。在搅拌(旋转轮)的条件下将溶液在室温下孵育3小时。
然后通过阴离子交换色谱法用ANX Sepharose凝胶(GE Healthcare)纯化溶液。将含有纯化的变体1缀合物的溶液通过在TRIS缓冲液20mM pH 7.5中平衡的旋转柱(Zeba旋转柱10mL，Pierce#89893)离心。
实施例8：用实施例7的缀合物制备微囊泡
将10mg DSPC(DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱)和棕榈酸(80/20摩尔比)的混合物在70℃下溶解在环辛烷(0.8mL)中。
分开地，将根据实施例7制备的DSPE-PEG-SH/变体1-SMCC缀合物溶液(28nmol-1.3mL)加入到8.7mL的PEG4000 10％蒸馏水溶液中。将DPPE-PEG5000(DPPE：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺)溶液(0.85mg，于85μL水中)加入该水相中。
通过使用高速匀浆器(Polytron PT3000)混合上述制备的有机溶液和水溶液以获得乳液。将所得乳液在搅拌下于60℃加热1小时，然后冷却至室温(约22℃)。
将所得乳液用PEG4000 10％的蒸馏水溶液稀释两次，并在DIN8R小瓶(0.5mL乳液/小瓶)中取样。将小瓶在-50℃下冷冻1小时(Lyobeta 35冷冻干燥器-TELSTAR)，然后在-20℃和0.2mbar下冷冻干燥12小时。然后将冻干的产物暴露于全氟正丁烷和氮气(35/65v/v)混合物的气氛中并密封小瓶。
通过温和的手动混合将产物分散在一定体积的150mM盐水(1mL/小瓶)中。
实施例9：被靶向的微囊泡在流动室设置中的体外结合活性
为了测试有效结合，将如WO2012/020030(实施例6)中所述制备的被靶向微囊泡和根据本发明(实施例8)制备的那些被靶向微囊泡注射到包含4μg/mL的小鼠Fc P-选择素(目录号737-PS，R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)或人Fc P和E选择素(R&D目录号137-PS50和724 ES 100)的包被的流动室设置中。以推注方式将微囊泡(以80x106/400μL TBS++的相同数量)注射通过流动室(FCS2,Bioptech,USA)，并将它们粘附在小鼠P-选择素(或人P-或E-选择素)包被层上，在有TBS中的50％(v:v)人血浆(Stehelin&Cie AG)存在的情况下，以1.0mL/分钟的流速(剪切速率为714s-1)在10分钟内进行评估。通过使用图像处理程序Analysis FIVE(SIS，Germany)在总共10分钟的输注中以2分钟间隔计数粘附在观察区域中的微囊泡的数量来进行微囊泡积聚的定量分析。10分钟后，随机拍摄5张照片，测量结合的微囊泡的数量，并将其表示为10分钟时结合气泡的数量(NBB)。如借助于镜台测微尺所测量的，每个观察区域为183x 137μm。在室的中间与出口之间进行测量。
类似地，如上所述将根据实施例8制备的被靶向微囊泡的悬浮液(变体1A作为靶向配体)注射到流动室中，并根据上述方法测定它们的结合活性。
以与上述相同的浓度(4μg/ml)对人E-选择素和小鼠P-选择素的包被重复实验。结果示于表4中。
表4：10分钟时结合微囊泡的数量(NBM 10分钟)
如从上述结果可推断的，新制备的MB-PSGL-1变体1A的结合行为类似于具有Fr 1的微泡：它们在血浆中显示牢固结合而没有聚集，并且结合人和小鼠P-选择素以及人E选择素。
实施例10：具有片段1(比较的)和变体1A的微囊泡的体内实验
在炎性大鼠模型中比较根据上述实施例8制备的具有变体1A的微囊泡与根据WO2012/020030(实施例6)制备的具有片段1(Fr-1)的微囊泡。通过注射脂多糖(LPS,0.26:B6 Sigma L-8274,2.1mg/kg)在大鼠后肢中诱发炎症。在诱发炎症过程后24小时通过超声对比度成像评估被靶向微囊泡的有效结合。使用配备有在对比模式下运行的9L线性换能器(发送频率，4.0MHz(Res)；动态范围，48dB；深度，20mm；时间增益补偿(TGC)，线性)的LogiqE9超声扫描仪(General Electric Healthcare,Fairfield,Connecticut,USA)进行对比增强超声成像。在30秒的过程中以低机械指数(MI＝0.06)记录每秒一个图像，然后每15秒一个图像，记录10分钟。单剂量注射后10分钟，以4Hz的帧速率在10秒中获得对比增强信号。将对比增强图像记录为Dicom文件，并使用内部开发的专用软件(VueBox,Bracco Suisse SA,Geneva,Switzerland)进行分析。该软件允许在像素级的对数压缩视频序列线性化之后对回波描记信号进行定量分析，并在目标区域(AOI)内提供对比回波功率振幅(表示为任意单位A.U.)。将集成在于Bracco开发的软件(VueBox商业试剂盒)中并帮助检测结合的气泡的固定气泡成像(FBI)算法应用于在10分钟时记录的帧。FBI处理依赖于应用于图像子集的最小密度投影函数，其取决于窗口长度(40帧)。所得图像(图3)显示具有变体1A的微泡能够使大鼠发炎的爪中的炎症可视化，并且观察到的信号与对于具有Fr-1的微泡观察到的信号非常相似。
实施例11：用实施例7的缀合物制备荧光脂质体
将胆固醇(28.25mg-Merck#3672)溶解在1mL氯仿中。将DSPE-PEG2000(13.9mg-Genzyme#LP-R4-039)溶解在1mL氯仿中。将DiR(1,1'-二-十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物-分子探针#D12731)溶解在乙醇中，得到10mg/mL溶液。
将DSPC(79.7mg-101μmole-Genzyme#LP-04-013)在100mL圆形球囊中称重并溶解在30mL氯仿/甲醇混合物(2/1v/v)中。将胆固醇溶液(575μL-42μmole)、DSPEPEG2000溶液(290μL-1.5μmole)和DiR溶液(100μL-1μmole)的样品加入DSPC溶液中。将所得溶液在65℃下搅拌10分钟，减压除去溶剂，得到脂质混合物。将该混合物在65℃，20mmHg下干燥，然后在25℃，0.2mBar下过夜。
将干燥的脂质混合物在70℃下在搅拌(旋转蒸发仪)下再分散于10mL的20mM Tris缓冲液(pH 7.4)中20分钟。然后将所得悬浮液在Nuclepore过滤器(1x1μm,1x0.6μm和4x0.4μm)上于70℃下挤出数次。该挤出步骤可以调整的获得各种脂质体尺寸。然后将脂质体悬浮液冷却至室温并在黑暗中于4℃储存。
通过插入后方法进行变体缀合物的掺入。简言之，将500μL脂质体悬浮液与实施例7中制备的变体1A缀合物溶液1mL(22nmol)在室温下于黑暗中混合16小时。所得脂质体悬浮液无需纯化即用于体内实验。
使用与上述相同的方法，用Fr-1缀合物(如WO2012/020030，实施例6中所述制备的)替换变体1A缀合物获得Fr-1脂质体。表6中比较了这两种脂质体悬浮液的特征。
使用Nanosizer ZetaZSP(Malvern instruments)测定脂质体的尺寸和ζ电位。在脂质体洗涤(离心20000g/30分钟)后通过唾液酸测定法(根据实施例3.3)来测定每个脂质体的配体密度。
表5-对照，变体1A和Fr-1脂质体的特征
脂质体 尺寸(nm) ζ电位(mV) 配体分子/脂质体
无插入后 268 -6.4 -
变体1A缀合物插入后 278 -39.1 780
Fr-1缀合物插入后 291 -34.7 700
实施例12.在小鼠LPS模型中使用具有片段1(对比)和变体1A的脂质体的光学成像实验
将具有变体1A的脂质体与具有片段1的脂质体在具有后肢炎症的两组动物中进行比较。通过肌内注射脂多糖(LPS,0.26:B6Sigma L-8274)在小鼠后肢诱发炎症。使用临床前Fluobeam 700系统进行光学成像。将光学头置于动物上方，使得其后肢放置在摄像机视野的中心(鼠标与摄像机之间的距离为15cm)。诱发炎症过程后二十四小时，注射被靶向脂质体并随时间推移(长达24小时)跟踪荧光信号。将注射和早期阶段记录为序列，其中在16分钟的时期中每5秒钟一个图像(具有固定的曝光时间)，接着是在20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时和4小时时的单个图像。使用Image J软件分析图像。在所有捕获帧中，绘制相同的目标区域(AOI)以概述发炎爪和对侧爪。在每个图像的AOI中计算每毫秒的平均荧光强度。荧光图像示于图4中，并且表示为比率(发炎症爪除以对侧爪)的定量结果示于表7中。变体1A-脂质体-DIR注射后2小时记录的荧光图像显示发炎爪中的信号高于对侧爪的信号。在动物3的情况下，在发炎爪子中观察到的信号低可能是由于在该小鼠中由LPS诱发的低炎症造成的。相反，动物6呈现指示高炎症的高信号。与片段-1(Fr-1)相比，对于变体1A计算的发炎爪/对侧爪的比率较高，表明该试剂的良好特异性。
表6：注射变体A1-脂质体-DIR或Fr-1-脂质体-DIR后2小时LPS炎症小鼠模型中发炎爪与对侧爪的比率
实施例13.通过HA色谱法(阴性或阳性)优化纯化条件。
通过AE/HI和HA(阴性)的纯化
在0.22μm膜上过滤600mL条件培养基，并将其加载到用20mM TRIS pH 7.5平衡的AEX柱(Capto QTM,GE,2.6x 7cm,37mL)上。用30％和100％的20mM TRIS，1M NaCl，pH 7.5的2步洗脱来洗脱结合的蛋白质。靶蛋白在100％级分中洗脱。用1M NaOH清洗柱，并在4℃下储存在20％乙醇中。条件培养基的电导率低于10mS/cm。
将固体NaCl加入到来自AEX纯化的100％洗脱步骤的合并物中至终浓度为4μM。将样品分成两部分，以使柱不过载。然后将其加载到预先用20mM TRIS，4M NaCl，pH 7.5平衡的疏水相互作用色谱柱(Phenyl SepharoseTM,GE,1.6x 9cm,18mL体积)上。用50％和100％的20mM TRIS pH 7.5的2步洗脱来洗脱结合的蛋白质。靶蛋白被洗脱在50％级分中。
第二次运行后，用0.2M NaOH清洗柱子，并在4℃下于20％EtOH中储存。
将来自两次HIC运行中的第一次洗脱步骤的合并物组合，并通过加入500mM磷酸盐pH 6.8和1M CaCl2将磷酸盐/CaCl2浓度分别调节至10mM和0.3mM。然后在AmiconTM超滤搅拌池(Merck，用膜YM10组装，标称截留分子量为10kDa)中将所述混合物对10mM磷酸盐，0.3mMCaCl2，pH 6.8进行超滤。然后，将渗滤的混合物加载到预先用10mM磷酸盐，0.3mM CaCl2，pH6.8平衡的羟基磷灰石柱(BioRad,2.2x 5cm,19mL体积)上。PSGL变体1A被洗脱在FT级分中(阴性色谱法)。
根据制造商的说明，用AmiconTM离心过滤装置浓缩FT级分。将纯化的蛋白质在-40℃下冷冻。终浓度为0.89mg/mL，总产量为38.7mg(73％)，纯度为99.7％(图5)。
在每个色谱步骤后，通过DNA定量测定(DNA定量试剂盒，荧光测定，Sigma，检测限为2mg/L)和RP-HPLC(纯度对比其他蛋白质)分别测量残留的DNA和蛋白质污染物。
数值概述于下表中：
表7：3步色谱后的纯度和残留DNA含量
通过AE/HI和HA(阳性)纯化
在0.22μm膜上过滤1000mL条件培养基，然后将其加载到用20mM TRIS pH 7.5平衡的AE柱(Capto QTM,GE,2.6x 7cm,37mL)上。用30％和100％20mM TRIS,1M NaCl,pH 7.5的2步洗脱来洗脱结合的蛋白质。靶蛋白被洗脱在100％级分中。用1M NaOH清洗柱，并将其在4℃下于20％EtOH中储存。
将固体NaCl加入来自AE纯化的100％洗脱步骤的混合物中至终浓度为4M。将样品分成两部分以使柱不过载。然后将其加载到预先用20mM TRIS,4M NaCl,pH 7.5平衡的疏水相互作用色谱柱(Phenyl SepharoseTM,GE,1.6x 9cm,18mL体积)上。用50％和100％20mMTRIS pH 7.5的2步洗脱来洗脱结合的蛋白质。靶蛋白被洗脱在50％级分中。
第三次运行后，用0.2M NaOH清洗柱子，并将其在4℃下于20％EtOH中储存。
将来自每次HIC运行的第一洗脱步骤的合并物组合，并用水稀释4倍。然后，将稀释的合并物加载到预先用5mM磷酸盐，1mM MgCl2,pH 6.8平衡的羟基磷灰石柱(BioRad,2.2x5cm,19mL柱)上。用0％至12.5％的500mM磷酸盐缓冲液梯度洗脱结合的蛋白质。PSGL变体1A作为第一个峰被洗脱。
根据制造商的说明，用Amicon离心过滤装置(Ultracel-10膜，10kDa MWCO)浓缩含有靶蛋白的级分。
将纯化的蛋白质在-40℃下冷冻。终浓度为1.09mg/mL，总产量为25mg，对应于总靶蛋白质含量的约70％和98.7％的纯度。
序列表
<110> Bracco Suisse SA
<120> 用于选择素靶向的重组嵌合蛋白
<130> B0686
<150> EP16154868.0
<151> 2016-02-09
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDS
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<223> 变体1
<400> 1
atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
gtc cac tcc cag gcc acc gaa tat gag tac cta gat tat gat ttc ctg 96
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
cca gaa acg gag cct cca gaa atg ctg agg aac agc act gac acc act 144
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
cct ctg act ggg cct gga acc cct gag tct acc act gtg gag cct gct 192
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
gcg cgg ccg cac aca tgc cca ccg tgc cca ctg cag cag aga aga ggc 240
Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu Gln Gln Arg Arg Gly
65 70 75 80
ctg gaa gcc gag aga gcc aga ctg gcc gct cag ctg gat gcc ctg aga 288
Leu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Asp Ala Leu Arg
85 90 95
gct gaa gtg gcc cgg ctg gcc aga gag aga gat ctg tac ggc gga ggc 336
Ala Glu Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Gly
100 105 110
gga gct ggt ggc ggc gga gac tac aag gac gac gac gac aag tga 381
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
115 120 125
<210> 2
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu Gln Gln Arg Arg Gly
65 70 75 80
Leu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Asp Ala Leu Arg
85 90 95
Ala Glu Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
115 120 125
<210> 3
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白CDS
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(573)
<223> 变体2
<400> 3
atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
gtc cac tcc cag gcc acc gaa tat gag tac cta gat tat gat ttc ctg 96
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
cca gaa acg gag cct cca gaa atg ctg agg aac agc act gac acc act 144
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
cct ctg act ggg cct gga acc cct gag tct acc act gtg gag cct gct 192
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
gcg cgg ccg cac aca tgc cca ccg tgc cca ggg cag ccc cga gaa cca 240
Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro
65 70 75 80
cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc gct aac cag 288
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Ala Asn Gln
85 90 95
gtc agc ctg acc tgc ctg gtc gca ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 336
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Ala Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
100 105 110
gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac gct acc acg 384
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Ala Thr Thr
115 120 125
cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc gca ctc 432
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu
130 135 140
acc gtg gac gct agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 480
Thr Val Asp Ala Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
145 150 155 160
gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag gca agc ctc tcc 528
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ala Ser Leu Ser
165 170 175
ctg tct ccg ggt ggc gga gac tac aag gac gac gac gac aag tga 573
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
180 185 190
<210> 4
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro
65 70 75 80
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Ala Asn Gln
85 90 95
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Ala Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
100 105 110
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Ala Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu
130 135 140
Thr Val Asp Ala Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
145 150 155 160
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ala Ser Leu Ser
165 170 175
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
180 185 190
<210> 5
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白CDS
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(273)
<223> 变体3
<400> 5
atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
gtc cac tcc cag gcc acc gaa tat gag tac cta gat tat gat ttc ctg 96
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
cca gaa acg gag cct cca gaa atg ctg agg aac agc act gac acc act 144
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
cct ctg act ggg cct gga acc cct gag tct acc act gtg gag cct gct 192
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
gcg cgg tcc gtg gca cag tgc ctg ctg gcc atc ctg atc ctg gcc ctg 240
Ala Arg Ser Val Ala Gln Cys Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu
65 70 75 80
gtg gcc gac tac aag gac gac gac gac aag tga 273
Val Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
85 90
<210> 6
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
Ala Arg Ser Val Ala Gln Cys Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
85 90
<210> 7
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白CDS
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(294)
<223> 变体4
<400> 7
atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
gtc cac tcc cag gcc acc gaa tat gag tac cta gat tat gat ttc ctg 96
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
cca gaa acg gag cct cca gaa atg ctg agg aac agc act gac acc act 144
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
cct ctg act ggg cct gga acc cct gag tct acc act gtg gag cct gct 192
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
gcg cgg ccg cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc ctg ggg 240
Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly
65 70 75 80
gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca gat tac aag gat gac gac gat 288
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
85 90 95
aaa tga 294
Lys
<210> 8
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
85 90 95
Lys
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白CDS
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> 变体5
<400> 9
atg cct ctg caa ctc ctc ctg ttg ctg atc cta ctg ggc cct ggc aac 48
Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn
1 5 10 15
agc ttg cag ctg tgg gac acc tgg gca gat gaa gcc gag aaa gcc ttg 96
Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu
20 25 30
ggt ccc ctg ctt gcc cgg gac cgg aga cag gcc acc gaa tat gag tac 144
Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr
35 40 45
cta gat tat gat ttc ctg cca gaa acg gag cct cca gaa atg ctg agg 192
Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg
50 55 60
aac agc act gac acc act cct ctg act ggg cct gga acc cct gag tct 240
Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser
65 70 75 80
acc act gtg gag cct gct gcg cgg ccg cac aca tgc cca ccg tgc cca 288
Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
85 90 95
gca cct gaa gcc ctg ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca gat 336
Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Asp
100 105 110
tac aag gat gac gac gat aaa tga 360
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
115
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu
20 25 30
Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr
35 40 45
Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg
50 55 60
Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser
65 70 75 80
Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Asp
100 105 110
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
115
<210> 11
<211> 371
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (1)..(371)
<223> PSGL-1 GI:2498904. 成熟肽42-412
<400> 11
Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr
1 5 10 15
Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr
20 25 30
Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg
35 40 45
Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu
50 55 60
Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile
65 70 75 80
Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val
85 90 95
Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr
100 105 110
Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr
115 120 125
Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln
130 135 140
Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala
145 150 155 160
Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr
180 185 190
Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr
195 200 205
Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu
210 215 220
Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly
225 230 235 240
Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro
245 250 255
Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp
260 265 270
His Ile Ser Val Lys Gln Cys Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu
275 280 285
Val Ala Thr Ile Phe Phe Val Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu
290 295 300
Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu
305 310 315 320
Met Val Cys Ile Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser
325 330 335
Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr
340 345 350
Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser
355 360 365
Phe Leu Pro
370
<210> 12
<211> 237
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> NRL: GI:1709348. 亮氨酸拉链187-208
<400> 12
Met Ala Leu Pro Pro Ser Pro Leu Ala Met Glu Tyr Val Asn Asp Phe
1 5 10 15
Asp Leu Met Lys Phe Glu Val Lys Arg Glu Pro Ser Glu Gly Arg Pro
20 25 30
Gly Pro Pro Thr Ala Ser Leu Gly Ser Thr Pro Tyr Ser Ser Val Pro
35 40 45
Pro Ser Pro Thr Phe Ser Glu Pro Gly Met Val Gly Ala Thr Glu Gly
50 55 60
Thr Arg Pro Gly Leu Glu Glu Leu Tyr Trp Leu Ala Thr Leu Gln Gln
65 70 75 80
Gln Leu Gly Ala Gly Glu Ala Leu Gly Leu Ser Pro Glu Glu Ala Met
85 90 95
Glu Leu Leu Gln Gly Gln Gly Pro Val Pro Val Asp Gly Pro His Gly
100 105 110
Tyr Tyr Pro Gly Ser Pro Glu Glu Thr Gly Ala Gln His Val Gln Leu
115 120 125
Ala Glu Arg Phe Ser Asp Ala Ala Leu Val Ser Met Ser Val Arg Glu
130 135 140
Leu Asn Arg Gln Leu Arg Gly Cys Gly Arg Asp Glu Ala Leu Arg Leu
145 150 155 160
Lys Gln Arg Arg Arg Thr Leu Lys Asn Arg Gly Tyr Ala Gln Ala Cys
165 170 175
Arg Ser Lys Arg Leu Gln Gln Arg Arg Gly Leu Glu Ala Glu Arg Ala
180 185 190
Arg Leu Ala Ala Gln Leu Asp Ala Leu Arg Ala Glu Val Ala Arg Leu
195 200 205
Ala Arg Glu Arg Asp Leu Tyr Lys Ala Arg Cys Asp Arg Leu Thr Ser
210 215 220
Ser Gly Pro Gly Ser Gly Asp Pro Ser His Leu Phe Leu
225 230 235
<210> 13
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1029)
<223> FTVII
<400> 13
atg aat aat gct ggg cac ggc ccc acc cgg agg ctg cga ggc ttg gga 48
Met Asn Asn Ala Gly His Gly Pro Thr Arg Arg Leu Arg Gly Leu Gly
1 5 10 15
gtc ctg gcc ggg gtg gct ctg ctc gct gcc ctc tgg ctt ctg tgg ctg 96
Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Trp Leu Leu Trp Leu
20 25 30
ctg gga tca gca cct cgg ggt act ccg gca cct cag ccc acg atc acc 144
Leu Gly Ser Ala Pro Arg Gly Thr Pro Ala Pro Gln Pro Thr Ile Thr
35 40 45
atc ctt gtc tgg cac tgg ccc ttc act gac cag cct cca gag ctg ccc 192
Ile Leu Val Trp His Trp Pro Phe Thr Asp Gln Pro Pro Glu Leu Pro
50 55 60
agc gac acc tgc acc cgc tac ggc atc gcc cgc tgc cac ctg agt gcc 240
Ser Asp Thr Cys Thr Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Cys His Leu Ser Ala
65 70 75 80
aac cga agc ctg ctg gcc agc gcc gac gcc gtg gtc ttc cac cac cgc 288
Asn Arg Ser Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ala Val Val Phe His His Arg
85 90 95
gag ctt cag acc cga cgg tcc cac ctg ccc ctg gcc cag cga ccg cga 336
Glu Leu Gln Thr Arg Arg Ser His Leu Pro Leu Ala Gln Arg Pro Arg
100 105 110
ggg cag ccc tgg gtg tgg gcc tcc atg gag tct cct agc cac acc cac 384
Gly Gln Pro Trp Val Trp Ala Ser Met Glu Ser Pro Ser His Thr His
115 120 125
ggc ctc agc cac ctc cga ggc atc ttc aac tgg gtg ctg agc tac cgg 432
Gly Leu Ser His Leu Arg Gly Ile Phe Asn Trp Val Leu Ser Tyr Arg
130 135 140
cgc gac tcg gac atc ttt gtg ccc tat ggc cgc ctg gag cct cac tgg 480
Arg Asp Ser Asp Ile Phe Val Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Pro His Trp
145 150 155 160
gga ccc tcg cca ccg ctg cca gcc aag agc agg gtg gcc gcc tgg gtg 528
Gly Pro Ser Pro Pro Leu Pro Ala Lys Ser Arg Val Ala Ala Trp Val
165 170 175
gtc agc aac ttc cag gag cgg cag ctg cgt gcc agg ctg tac cgg cag 576
Val Ser Asn Phe Gln Glu Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Tyr Arg Gln
180 185 190
ctg gcg cct cat ctg cgg gtg gat gtc ttt ggc cgt gcc aat gga cgg 624
Leu Ala Pro His Leu Arg Val Asp Val Phe Gly Arg Ala Asn Gly Arg
195 200 205
cca ctg tgc gcc agc tgc ctg gtg ccc acc gtg gcc cag tac cgc ttc 672
Pro Leu Cys Ala Ser Cys Leu Val Pro Thr Val Ala Gln Tyr Arg Phe
210 215 220
tac ctg tcc ttt gag aac tct cag cac cgc gac tac att acg gag aaa 720
Tyr Leu Ser Phe Glu Asn Ser Gln His Arg Asp Tyr Ile Thr Glu Lys
225 230 235 240
ttc tgg cgc aac gca ctg gtg gct ggc act gtg cca gtg gtg ctg gga 768
Phe Trp Arg Asn Ala Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Leu Gly
245 250 255
cct cca cgg gcc acc tat gag gcc ttc gtg ccg gct gac gcc ttc gtg 816
Pro Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Val Pro Ala Asp Ala Phe Val
260 265 270
cat gtg gat gac ttt ggc tca gcc cga gag ctg gcg gct ttc ctc act 864
His Val Asp Asp Phe Gly Ser Ala Arg Glu Leu Ala Ala Phe Leu Thr
275 280 285
ggc atg aat gag agc cga tac caa cgc ttc ttt gcc tgg cgt gac agg 912
Gly Met Asn Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Phe Phe Ala Trp Arg Asp Arg
290 295 300
ctc cgc gtg cga ctg ttc acc gac tgg cgg gaa cgt ttc tgt gcc atc 960
Leu Arg Val Arg Leu Phe Thr Asp Trp Arg Glu Arg Phe Cys Ala Ile
305 310 315 320
tgt gac cgc tac cca cac cta cct cgc agc caa gtc tat gag gac ctt 1008
Cys Asp Arg Tyr Pro His Leu Pro Arg Ser Gln Val Tyr Glu Asp Leu
325 330 335
gag ggt tgg ttt cag gcc tga 1029
Glu Gly Trp Phe Gln Ala
340
<210> 14
<211> 342
<212> PRT
<213> 人
<400> 14
Met Asn Asn Ala Gly His Gly Pro Thr Arg Arg Leu Arg Gly Leu Gly
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Trp Leu Leu Trp Leu
20 25 30
Leu Gly Ser Ala Pro Arg Gly Thr Pro Ala Pro Gln Pro Thr Ile Thr
35 40 45
Ile Leu Val Trp His Trp Pro Phe Thr Asp Gln Pro Pro Glu Leu Pro
50 55 60
Ser Asp Thr Cys Thr Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Cys His Leu Ser Ala
65 70 75 80
Asn Arg Ser Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ala Val Val Phe His His Arg
85 90 95
Glu Leu Gln Thr Arg Arg Ser His Leu Pro Leu Ala Gln Arg Pro Arg
100 105 110
Gly Gln Pro Trp Val Trp Ala Ser Met Glu Ser Pro Ser His Thr His
115 120 125
Gly Leu Ser His Leu Arg Gly Ile Phe Asn Trp Val Leu Ser Tyr Arg
130 135 140
Arg Asp Ser Asp Ile Phe Val Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Pro His Trp
145 150 155 160
Gly Pro Ser Pro Pro Leu Pro Ala Lys Ser Arg Val Ala Ala Trp Val
165 170 175
Val Ser Asn Phe Gln Glu Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Tyr Arg Gln
180 185 190
Leu Ala Pro His Leu Arg Val Asp Val Phe Gly Arg Ala Asn Gly Arg
195 200 205
Pro Leu Cys Ala Ser Cys Leu Val Pro Thr Val Ala Gln Tyr Arg Phe
210 215 220
Tyr Leu Ser Phe Glu Asn Ser Gln His Arg Asp Tyr Ile Thr Glu Lys
225 230 235 240
Phe Trp Arg Asn Ala Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Leu Gly
245 250 255
Pro Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Val Pro Ala Asp Ala Phe Val
260 265 270
His Val Asp Asp Phe Gly Ser Ala Arg Glu Leu Ala Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Gly Met Asn Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Phe Phe Ala Trp Arg Asp Arg
290 295 300
Leu Arg Val Arg Leu Phe Thr Asp Trp Arg Glu Arg Phe Cys Ala Ile
305 310 315 320
Cys Asp Arg Tyr Pro His Leu Pro Arg Ser Gln Val Tyr Glu Asp Leu
325 330 335
Glu Gly Trp Phe Gln Ala
340
<210> 15
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1287)
<223> C2GnT
<400> 15
atg ctg agg acg ttg ctg cga agg aga ctt ttt tct tat ccc acc aaa 48
Met Leu Arg Thr Leu Leu Arg Arg Arg Leu Phe Ser Tyr Pro Thr Lys
1 5 10 15
tac tac ttt atg gtt ctt gtt tta tcc cta atc acc ttc tcc gtt tta 96
Tyr Tyr Phe Met Val Leu Val Leu Ser Leu Ile Thr Phe Ser Val Leu
20 25 30
agg att cat caa aag cct gaa ttt gta agt gtc aga cac ttg gag ctt 144
Arg Ile His Gln Lys Pro Glu Phe Val Ser Val Arg His Leu Glu Leu
35 40 45
gct ggg gag aat cct agt agt gat att aat tgc acc aaa gtt tta cag 192
Ala Gly Glu Asn Pro Ser Ser Asp Ile Asn Cys Thr Lys Val Leu Gln
50 55 60
ggt gat gta aat gaa atc caa aag gta aag ctt gag atc cta aca gtg 240
Gly Asp Val Asn Glu Ile Gln Lys Val Lys Leu Glu Ile Leu Thr Val
65 70 75 80
aaa ttt aaa aag cgc cct cgg tgg aca cct gac gac tat ata aac atg 288
Lys Phe Lys Lys Arg Pro Arg Trp Thr Pro Asp Asp Tyr Ile Asn Met
85 90 95
acc agt gac tgt tct tct ttc atc aag aga cgc aaa tat att gta gaa 336
Thr Ser Asp Cys Ser Ser Phe Ile Lys Arg Arg Lys Tyr Ile Val Glu
100 105 110
ccc ctt agt aaa gaa gag gcg gag ttt cca ata gca tat tct ata gtg 384
Pro Leu Ser Lys Glu Glu Ala Glu Phe Pro Ile Ala Tyr Ser Ile Val
115 120 125
gtt cat cac aag att gaa atg ctt gac agg ctg ctg agg gcc atc tat 432
Val His His Lys Ile Glu Met Leu Asp Arg Leu Leu Arg Ala Ile Tyr
130 135 140
atg cct cag aat ttc tat tgc att cat gtg gac aca aaa tcc gag gat 480
Met Pro Gln Asn Phe Tyr Cys Ile His Val Asp Thr Lys Ser Glu Asp
145 150 155 160
tcc tat tta gct gca gtg atg ggc atc gct tcc tgt ttt agt aat gtc 528
Ser Tyr Leu Ala Ala Val Met Gly Ile Ala Ser Cys Phe Ser Asn Val
165 170 175
ttt gtg gcc agc cga ttg gag agt gtg gtt tat gca tcg tgg agc cgg 576
Phe Val Ala Ser Arg Leu Glu Ser Val Val Tyr Ala Ser Trp Ser Arg
180 185 190
gtt cag gct gac ctc aac tgc atg aag gat ctc tat gca atg agt gca 624
Val Gln Ala Asp Leu Asn Cys Met Lys Asp Leu Tyr Ala Met Ser Ala
195 200 205
aac tgg aag tac ttg ata aat ctt tgt ggt atg gat ttt ccc att aaa 672
Asn Trp Lys Tyr Leu Ile Asn Leu Cys Gly Met Asp Phe Pro Ile Lys
210 215 220
acc aac cta gaa att gtc agg aag ctc aag ttg tta atg gga gaa aac 720
Thr Asn Leu Glu Ile Val Arg Lys Leu Lys Leu Leu Met Gly Glu Asn
225 230 235 240
aac ctg gaa acg gag agg atg cca tcc cat aaa gaa gaa agg tgg aag 768
Asn Leu Glu Thr Glu Arg Met Pro Ser His Lys Glu Glu Arg Trp Lys
245 250 255
aag cgg tat gag gtc gtt aat gga aag ctg aca aac aca ggg act gtc 816
Lys Arg Tyr Glu Val Val Asn Gly Lys Leu Thr Asn Thr Gly Thr Val
260 265 270
aaa atg ctt cct cca ctc gaa aca cct ctc ttt tct ggc agt gcc tac 864
Lys Met Leu Pro Pro Leu Glu Thr Pro Leu Phe Ser Gly Ser Ala Tyr
275 280 285
ttc gtg gtc agt agg gag tat gtg ggg tat gta cta cag aat gaa aaa 912
Phe Val Val Ser Arg Glu Tyr Val Gly Tyr Val Leu Gln Asn Glu Lys
290 295 300
atc caa aag ttg atg gag tgg gca caa gac aca tac agc cct gat gag 960
Ile Gln Lys Leu Met Glu Trp Ala Gln Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu
305 310 315 320
tat ctc tgg gcc acc atc caa agg att cct gaa gtc ccg ggc tca ctc 1008
Tyr Leu Trp Ala Thr Ile Gln Arg Ile Pro Glu Val Pro Gly Ser Leu
325 330 335
cct gcc agc cat aag tat gat cta tct gac atg caa gca gtt gcc agg 1056
Pro Ala Ser His Lys Tyr Asp Leu Ser Asp Met Gln Ala Val Ala Arg
340 345 350
ttt gtc aag tgg cag tac ttt gag ggt gat gtt tcc aag ggt gct ccc 1104
Phe Val Lys Trp Gln Tyr Phe Glu Gly Asp Val Ser Lys Gly Ala Pro
355 360 365
tac ccg ccc tgc gat gga gtc cat gtg cgc tca gtg tgc att ttc gga 1152
Tyr Pro Pro Cys Asp Gly Val His Val Arg Ser Val Cys Ile Phe Gly
370 375 380
gct ggt gac ttg aac tgg atg ctg cgc aaa cac cac ttg ttt gcc aat 1200
Ala Gly Asp Leu Asn Trp Met Leu Arg Lys His His Leu Phe Ala Asn
385 390 395 400
aag ttt gac gtg gat gtt gac ctc ttt gcc atc cag tgt ttg gat gag 1248
Lys Phe Asp Val Asp Val Asp Leu Phe Ala Ile Gln Cys Leu Asp Glu
405 410 415
cat ttg aga cac aaa gct ttg gag aca tta aaa cac tga 1287
His Leu Arg His Lys Ala Leu Glu Thr Leu Lys His
420 425
<210> 16
<211> 428
<212> PRT
<213> 人
<400> 16
Met Leu Arg Thr Leu Leu Arg Arg Arg Leu Phe Ser Tyr Pro Thr Lys
1 5 10 15
Tyr Tyr Phe Met Val Leu Val Leu Ser Leu Ile Thr Phe Ser Val Leu
20 25 30
Arg Ile His Gln Lys Pro Glu Phe Val Ser Val Arg His Leu Glu Leu
35 40 45
Ala Gly Glu Asn Pro Ser Ser Asp Ile Asn Cys Thr Lys Val Leu Gln
50 55 60
Gly Asp Val Asn Glu Ile Gln Lys Val Lys Leu Glu Ile Leu Thr Val
65 70 75 80
Lys Phe Lys Lys Arg Pro Arg Trp Thr Pro Asp Asp Tyr Ile Asn Met
85 90 95
Thr Ser Asp Cys Ser Ser Phe Ile Lys Arg Arg Lys Tyr Ile Val Glu
100 105 110
Pro Leu Ser Lys Glu Glu Ala Glu Phe Pro Ile Ala Tyr Ser Ile Val
115 120 125
Val His His Lys Ile Glu Met Leu Asp Arg Leu Leu Arg Ala Ile Tyr
130 135 140
Met Pro Gln Asn Phe Tyr Cys Ile His Val Asp Thr Lys Ser Glu Asp
145 150 155 160
Ser Tyr Leu Ala Ala Val Met Gly Ile Ala Ser Cys Phe Ser Asn Val
165 170 175
Phe Val Ala Ser Arg Leu Glu Ser Val Val Tyr Ala Ser Trp Ser Arg
180 185 190
Val Gln Ala Asp Leu Asn Cys Met Lys Asp Leu Tyr Ala Met Ser Ala
195 200 205
Asn Trp Lys Tyr Leu Ile Asn Leu Cys Gly Met Asp Phe Pro Ile Lys
210 215 220
Thr Asn Leu Glu Ile Val Arg Lys Leu Lys Leu Leu Met Gly Glu Asn
225 230 235 240
Asn Leu Glu Thr Glu Arg Met Pro Ser His Lys Glu Glu Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Arg Tyr Glu Val Val Asn Gly Lys Leu Thr Asn Thr Gly Thr Val
260 265 270
Lys Met Leu Pro Pro Leu Glu Thr Pro Leu Phe Ser Gly Ser Ala Tyr
275 280 285
Phe Val Val Ser Arg Glu Tyr Val Gly Tyr Val Leu Gln Asn Glu Lys
290 295 300
Ile Gln Lys Leu Met Glu Trp Ala Gln Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu
305 310 315 320
Tyr Leu Trp Ala Thr Ile Gln Arg Ile Pro Glu Val Pro Gly Ser Leu
325 330 335
Pro Ala Ser His Lys Tyr Asp Leu Ser Asp Met Gln Ala Val Ala Arg
340 345 350
Phe Val Lys Trp Gln Tyr Phe Glu Gly Asp Val Ser Lys Gly Ala Pro
355 360 365
Tyr Pro Pro Cys Asp Gly Val His Val Arg Ser Val Cys Ile Phe Gly
370 375 380
Ala Gly Asp Leu Asn Trp Met Leu Arg Lys His His Leu Phe Ala Asn
385 390 395 400
Lys Phe Asp Val Asp Val Asp Leu Phe Ala Ile Gln Cys Leu Asp Glu
405 410 415
His Leu Arg His Lys Ala Leu Glu Thr Leu Lys His
420 425
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<223> 间隔子
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Lys Gly
1 5 10
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(20)
<400> 18
Met Glu Trp Ser Trp Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr
1 5 10 15
Gly Val His Ser
20
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<223> 铰链区
<400> 19
ccg cac aca tgc cca ccg tgc cca 24
Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 20
Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 21
Met Ala Trp Thr Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Cys Ser Gly
1 5 10 15
Ala Ser Ser
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 22
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 23
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 23
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 24
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 25
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 26
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Asn Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 27
Met Gly Thr Val Ser Arg Ala Ala Leu Ile Leu Ala Cys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ser Ala
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 28
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 29
Met Asn Pro Ala Ile Ser Val Ala Leu Leu Leu Ser Val Leu Gln Val
1 5 10 15
Ser Arg Gly
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 30
Met Ala Leu Met Leu Val Leu Phe Phe Leu Ala Ala Val Leu Pro Pro
1 5 10 15
Ser Leu Leu
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 31
Met Gly Trp Ser Phe Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 32
Met Ile Leu Phe Asn Arg Val Gly Tyr Phe Val Ser Leu Phe Ala Thr
1 5 10 15
Val Ser Cys
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 33
Met Val Val Met Leu Arg Tyr Val Trp Pro Leu Leu Leu Cys Ser Pro
1 5 10 15
Cys Leu Leu
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
<400> 34
Met Gly Trp Arg Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Cys
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 标签序列
<220>
<221> 结合
<222> (1)..(7)
<400> 35
Asp Tyr Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 36
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白质1A
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<223> 变体1A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 信号肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(360)
<223> 编码无信号肽的变体1A的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(198)
<223> 编码PSGL-1 aa 1-47的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (199)..(222)
<223> 编码包含至少一个Cys的共价二聚化结构域的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (223)..(327)
<223> 编码包含至少NRL aa187-208的NRL亮氨酸拉链的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (328)..(360)
<223> 编码甘氨酸间隔子的序列
<400> 36
atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
gtc cac tcc cag gcc acc gaa tat gag tac cta gat tat gat ttc ctg 96
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
cca gaa acg gag cct cca gaa atg ctg agg aac agc act gac acc act 144
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
cct ctg act ggg cct gga acc cct gag tct acc act gtg gag cct gct 192
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
gcg cgg ccg cac aca tgc cca ccg tgc cca ctg cag cag aga aga ggc 240
Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu Gln Gln Arg Arg Gly
65 70 75 80
ctg gaa gcc gag aga gcc aga ctg gcc gct cag ctg gat gcc ctg aga 288
Leu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Asp Ala Leu Arg
85 90 95
gct gaa gtg gcc cgg ctg gcc aga gag aga gat ctg tac ggc gga ggc 336
Ala Glu Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Gly
100 105 110
gga gct ggt ggc ggc gga aag ggt tga 363
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Lys Gly
115 120
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu
20 25 30
Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr
35 40 45
Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala
50 55 60
Ala Arg Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu Gln Gln Arg Arg Gly
65 70 75 80
Leu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Asp Ala Leu Arg
85 90 95
Ala Glu Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Lys Gly
115 120
<210> 38
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟和加工后的变体1A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 硫酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 硫酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 硫酸化
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (16)..(16)
<223> Sialyl-Lewis -X (O-聚糖)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (90)..(90)
<223> 硫酸化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> 用于缀合的Lys或Cys
<400> 38
Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr
1 5 10 15
Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr
20 25 30
Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Pro
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu Gln Gln Arg Arg Gly Leu Glu Ala
50 55 60
Glu Arg Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Asp Ala Leu Arg Ala Glu Val
65 70 75 80
Ala Arg Leu Ala Arg Glu Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Gly Gly Ala Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Lys Gly
100
<210> 39
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合PSGL-1-NRL蛋白
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸或氨基酸序列(PSGL-1 aa 1-4)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(13)
<223> PSGL-1 aa 5-16 (选择素结合区)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> 任何氨基酸或氨基酸序列(PSGL-1 aa 17-47)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> 共价二聚化结构域侧翼区
<220>
<221> 二硫化
<222> (16)..(16)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> 共价二聚化结构域侧翼区
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> 任何氨基酸或氨基酸序列(来自NRL aa 181-186)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(40)
<223> NRL aa 187-208
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> 任何氨基酸或氨基酸序列(来自NRL aa 209-215)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> 间隔子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Lys或Cys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> any aa with exclusion of 除Cys或Lys外的任何氨基酸，优选Gly或Ala
<400> 39
Xaa Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Xaa Leu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Asp Ala
20 25 30
Leu Arg Ala Glu Val Ala Arg Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40

Claims (36)

1.一种重组嵌合P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)蛋白，其至少包含：选择素结合结构域，其包含SEQ ID NO:11(成熟PSGL-1序列)的至少aa 5-16，亮氨酸拉链结构域，其包含与SEQ ID NO:12(神经视网膜特异性亮氨酸拉链)的aa187-208具有至少90％同源性或同一性的氨基酸序列，和二硫键促进区。
2.根据权利要求1所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中所述选择素结合结构域包含SEQID NO:11(PSGL-1序列)的至少aa 1-47。
3.根据权利要求1所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中所述亮氨酸拉链包含与SEQ IDNO:12的aa 181-215具有至少90％同源性或同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中所述二硫键促进区包含由以下通式定义的氨基酸序列：
(X1)n-C(X2)m-(X3)
其中：
-X1、X2代表除半胱氨酸(Cys)外的任意氨基酸或氨基酸序列，
-C为Cys，
-X3为任意氨基酸，以及
-n、m为由1-6组成的整数。
5.根据权利要求4所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中：
-X1优选包含脯氨酸、组氨酸或苏氨酸；
-n最多为5；以及
-X2包含至少一个脯氨酸。
6.根据权利要求5所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中：
-X2为Pro-Pro；
-X3包含半胱氨酸和至少一个脯氨酸。
7.根据权利要求6所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中所述二硫键促进区为IgG1铰链区(SEQ ID NO:20)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其还包含聚甘氨酸间隔子，所述聚甘氨酸间隔子至少包含赖氨酸(Lys或K)或半胱氨酸(Cys或C)。
9.根据权利要求8所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中所述间隔子是SEQ ID NO:17。
10.一种二聚体蛋白，其包含通过至少一个二硫键彼此共价连接的两个根据权利要求1-9中任一项的重组嵌合PSGL-1蛋白。
11.根据权利要求10所述的二聚体蛋白质，其为同二聚体。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其还包含适于分泌并且在分泌前被切除的信号肽序列。
13.根据权利要求14的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中所述信号肽选自：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21-34。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的重组嵌合PSGL-1蛋白，其中所述信号肽是小鼠IgH信号肽(SEQINO:18)。
15.一种编码权利要求1-9和12-14中任一项所述的重组嵌合蛋白的DNA序列，其包含：选择素结合结构域，其包含SEQ ID NO:11(成熟PSGL-1序列)的至少aa 5-16，亮氨酸拉链结构域，其包含与SEQ ID NO:12(神经视网膜特异性亮氨酸拉链)的aa 187-208具有至少90％同源性或同一性的氨基酸序列，和二硫键促进区。
16.根据权利要求15所述的DNA序列，其中所述二硫键促进区包含由以下通式定义的氨基酸序列：
(X1)n-C(X2)m-(X3)
其中：
-X1、X2代表除半胱氨酸(Cys)外的任意氨基酸或氨基酸序列，
-C为Cys，
-X3为任意氨基酸，以及
-n、m为由1-6组成的整数。
17.一种真核表达载体，其包含权利要求15-16中任一项的DNA序列。
18.根据权利要求17的载体，其还包含分别编码糖基化酶β1,6N-乙酰葡糖胺基转移酶(C2GnT)和岩藻糖基转移酶VII(FTVII)的SEQ ID NO:13和/或15中的任一个或两者。
19.一种哺乳动物细胞，其已用根据权利要求15-18中任一项的DNA或载体进行了转化。
20.一种哺乳动物细胞，其已用根据权利要求17-18中任一项的DNA载体和用包含编码糖基化酶C2GnT和FTVII的核苷酸序列的真核表达载体进行了转化。
21.根据权利要求19-20中任一项的哺乳动物细胞，其是稳定转染的CHO细胞。
22.根据权利要求1-14中任一项的分离的蛋白质。
23.根据权利要求22所述的分离的蛋白质，其为同二聚体，至少在SEQ ID NO:11的第16位的Thr处被O-连接糖基化，并且至少在第5、7和10位的Tyr处被硫酸化。
24.一种缀合物化合物，其包含根据权利要求1-14或22-23中任一项的重组蛋白和诊断或治疗性部分。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述诊断上有用的部分选自：放射性标记物、酶、荧光标记物、发光标记物、金属螯合化合物、充气脂质微囊泡以及所述具有诊断活性的部分的组合。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述金属螯合化合物选自：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三氨基五乙酸(DTPA)、4-羧基-5,8,11-三(羧甲基)-1-苯基-2-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-酸(BOPTA)、AAZTA、DTPA-Glu、DTPA-Lys。
27.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述充气微囊泡的脂质是磷脂。
28.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述治疗活性部分选自：细胞因子、细胞抑制剂、毒素、抗炎剂、免疫调节剂、抗凝集剂、皮质类固醇、单克隆抗体、生长因子或包含金属螯合部分以携带放射性核素的放射治疗剂。
29.根据权利要求24-27中任一项的缀合物，其用于选自超声、磁共振、光声、闪烁照相术、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、正电子发射断层扫描(PET)、X射线、射频声学和光学的成像方法。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-14或22-23中任一项的重组嵌合蛋白或根据权利要求24-29的缀合物。
31.一种方法，其用于制备权利要求1-14或22-23中任一项的重组蛋白，所述方法包括用根据权利要求15-16中任一项的DNA序列或权利要求17-18中任一项的载体转化真核细胞，以获得稳定表达嵌合蛋白的重组系统，收获培养基并从所述培养基中纯化所述重组蛋白。
32.一种方法，其用于制备根据权利要求1-14或22-23中任一项的重组蛋白，所述方法包括生长根据权利要求19-21的哺乳动物细胞和收获包含所述重组可溶性嵌合PSGL-1蛋白的培养基。
33.一种方法，其用于纯化根据权利要求1-14或22-23中任一项的重组蛋白，所述方法包括羟基磷灰石色谱。
34.根据权利要求33的方法，其中所述羟基磷灰石层析之后进行强阴离子交换和疏水相互作用色谱。
35.一种用于特征在于选择素的过表达的病理状况进行诊断成像的方法，所述方法包括向受试者预施用根据权利要求24-29中任一项的缀合物或根据权利要求30的药物组合物，和通过选自下述的成像方法记录图像：超声、磁共振、光声、闪烁照相、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、正电子发射断层扫描(PET)，X射线、射频声学和光学。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述病理状况选自：急性冠脉综合征(ACS)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、与肿瘤相关的新血管生成、类风湿性关节炎、缺血再灌注损伤和移植排斥。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113747925A (zh) * 2019-03-21 2021-12-03 科迪亚克生物科学公司 胞外囊泡缀合物及其用途

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110536896A (zh) * 2017-02-09 2019-12-03 博莱科瑞士股份有限公司 可溶性psgl-1蛋白质变体的纯化方法
US20200230221A1 (en) * 2017-09-19 2020-07-23 Massachusetts Institute Of Technology Compositions for chimeric antigen receptor t cell therapy and uses thereof
AU2019243580A1 (en) * 2018-03-28 2020-11-12 Orionis Biosciences BV Bi-functional proteins and construction thereof
EP3897954B1 (en) * 2018-12-21 2024-05-01 Bracco Suisse SA Gas-filled microvesicles with ligand
JP2023532973A (ja) * 2020-07-03 2023-08-01 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 多官能直交タンパク質キメラ

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008131217A1 (en) * 2007-04-20 2008-10-30 Oregon Healty & Science University Ultrasound imaging with targeted microbubbles
CN103079599A (zh) * 2010-08-09 2013-05-01 博莱科瑞士股份有限公司 靶向气体填充微囊

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4276885A (en) 1979-05-04 1981-07-07 Rasor Associates, Inc Ultrasonic image enhancement
US5362476A (en) 1984-10-18 1994-11-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Alkyl phosphonate polyazamacrocyclic cheates for MRI
MX174467B (es) 1986-01-23 1994-05-17 Squibb & Sons Inc 1,4,7-triscarboximetil-1,4,7,10-tetraazaciclodo decano substituido en 1 y compuestos analogos
US5021556A (en) 1987-07-22 1991-06-04 Neorx Corporation Method of radiolabeling chelating compounds comprising sulfur atoms with metal radionuclides
IE61591B1 (en) 1987-12-29 1994-11-16 Molecular Biosystems Inc Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent and method of production
US5075099A (en) 1988-05-31 1991-12-24 Neorx Corporation Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics
US5364613A (en) 1989-04-07 1994-11-15 Sieving Paul F Polychelants containing macrocyclic chelant moieties
US5118797A (en) 1989-08-28 1992-06-02 E. R. Squibb & Sons, Inc. Rhenium tris dioxime complexes
CA2034042C (en) 1990-01-18 1999-08-17 Adrian D. Nunn Boronic acid adducts of rhenium dioxime and technetium-99m dioxime complexes containing a biochemically active group
US5556610A (en) 1992-01-24 1996-09-17 Bracco Research S.A. Gas mixtures useful as ultrasound contrast media, contrast agents containing the media and method
IN172208B (zh) 1990-04-02 1993-05-01 Sint Sa
US5445813A (en) 1992-11-02 1995-08-29 Bracco International B.V. Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography
US5183653A (en) 1990-04-13 1993-02-02 E. R. Squibb & Sons, Inc. Boronic acid adducts of metal dioxime complexes useful in labelling proteins and other amine-containing compounds
AU636481B2 (en) 1990-05-18 1993-04-29 Bracco International B.V. Polymeric gas or air filled microballoons usable as suspensions in liquid carriers for ultrasonic echography
US5367080A (en) 1990-11-08 1994-11-22 Sterling Winthrop Inc. Complexing agents and targeting radioactive immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic imaging compositions and methods
US5965107A (en) 1992-03-13 1999-10-12 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for imaging
US5808091A (en) 1991-10-29 1998-09-15 Bracco International B.V. Rhenium and technetium complexes containing a hypoxia localizing moiety
IL104084A (en) 1992-01-24 1996-09-12 Bracco Int Bv Sustainable aqueous suspensions of pressure-resistant and gas-filled blisters, their preparation, and contrast agents containing them
US6277975B1 (en) 1992-10-23 2001-08-21 Genetics Institute, Inc. Fusions of P-selectin ligand protein and polynucleotides encoding same
US5843707A (en) 1992-10-23 1998-12-01 Genetics Institute, Inc. Nucleic acid encoding a novel P-selectin ligand protein
US5608110A (en) 1993-06-15 1997-03-04 Bracco International B.V. Heteroatom-bearing ligands and metal complexes thereof
WO1995003280A1 (en) 1993-07-19 1995-02-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Hydrazino-type radionuclide chelators having an n3s configuration
US5409689A (en) 1993-08-13 1995-04-25 Concat, Ltd. MRI image enhancement using complexes of paramagnetic cations and amine ligands containing a mixture of phosphonate and non-phosphonate pendant arms
US5574140A (en) 1993-09-03 1996-11-12 Resolution Pharmaceutical Inc. Hydrazino-type N2 S2 chelators
US5662885A (en) 1994-07-22 1997-09-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Peptide derived radionuclide chelators
US6333021B1 (en) 1994-11-22 2001-12-25 Bracco Research S.A. Microcapsules, method of making and their use
IL116328A (en) 1994-12-16 1999-09-22 Bracco Research Sa Frozen suspension of gas microbubbles in frozen aqueous carrier for use as contrast agent in ultrasonic imaging
US5886142A (en) 1997-05-20 1999-03-23 Thomas Jefferson University Radiolabeled thrombus imaging agents
US6093382A (en) 1998-05-16 2000-07-25 Bracco Research Usa Inc. Metal complexes derivatized with folate for use in diagnostic and therapeutic applications
IT1315263B1 (it) 1999-12-21 2003-02-03 Bracco Spa Composti chelanti,loro chelati con ioni metallici paramagnetici, loropreparazione ed uso
EP1518931A1 (en) * 2000-03-31 2005-03-30 Genetics Institute, LLC Use of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) and fragments thereof for the inhibition of thrombosis
JP2005523235A (ja) 2001-07-17 2005-08-04 テラファルム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 新規のキレート化剤およびその接合体、該キレート化剤およびその接合体の診断剤および治療剤としての合成および使用
ITMI20011518A1 (it) 2001-07-17 2003-01-17 Bracco Imaging Spa Leganti azotati multidentati capaci di complessare ioni metallici e loro uso in diagnostica e in terapia
US9364569B2 (en) 2003-02-04 2016-06-14 Bracco Suisse S.A. Ultrasound contrast agents and process for the preparation thereof
WO2005062828A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Bracco Imaging S.P.A. New compounds useful as metal chelators
WO2005105840A2 (en) 2004-03-26 2005-11-10 Five Prime Therapeutics, Inc. Cd40 variants and uses thereof
WO2008071679A1 (en) 2006-12-11 2008-06-19 Bracco Imaging Spa Fibrin binding peptide conjugates for diagnostic and therapeutic applications.
GB201203071D0 (en) * 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
EP2639227A1 (en) 2012-03-14 2013-09-18 Bracco Imaging S.p.A A new class of diazepine derivative chelating agents and complexes with paramagnetic metals as MRI contrast agents
WO2014191467A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 Bracco Imaging Spa Fluorescent solid lipid nanoparticles composition and preparation thereof
US11129896B2 (en) 2015-07-20 2021-09-28 Trilogic Pharma Llc Topical formulations and treatments

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008131217A1 (en) * 2007-04-20 2008-10-30 Oregon Healty & Science University Ultrasound imaging with targeted microbubbles
US20100196284A1 (en) * 2007-04-20 2010-08-05 Lindner Jonathan R Ultrasound Imaging with Targeted Microbubbles
CN103079599A (zh) * 2010-08-09 2013-05-01 博莱科瑞士股份有限公司 靶向气体填充微囊

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SWAROOP ET AL.: "A conserved retina-specific gene encodes a basic motif/leucine zipper domain", 《PNAS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113747925A (zh) * 2019-03-21 2021-12-03 科迪亚克生物科学公司 胞外囊泡缀合物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
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