CN108697736A - 治疗性组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开描述了衔接NK细胞的工程化化合物和使用该化合物的方法。一般地，该化合物包括NK衔接结构域、选择性结合靶细胞的靶向结构域，以及可操作地连接NK衔接结构域和靶向结构域的NK激活结构域。

Description

治疗性组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年10月6日提交的美国临时专利申请No.62/237,835的优先权，通过引用将其并入本文。

政府资助

本发明在国立卫生研究院授予的CA111412和CA65493政府支持以及国立癌症研究所授予的CA36725、CA72669和CA197292政府支持下做出。政府在本发明中享有某些权利。

序列表

本申请包含通过EFS-Web向美国专利和商标局电子提交的作为ASCII文本文件的序列表，标题为“2016-10-6-SequenceListing_ST25.txt”，具有85千字节的大小，生成于2016年10月6日。将该序列表中包含的信息通过引用并入本文。

发明概述

本公开涉及三特异性杀伤衔接子(trispecific killer engager，TriKE)分子的设计、构建和使用。

在一方面，本公开描述了经工程化以具有NK衔接结构域(NK engaging domain)、可操作地连接至该NK衔接结构域的NK激活结构域，以及选择性结合靶细胞并可操作地连接至该NK激活结构域和该NK衔接结构域的靶向结构域的分子。

在一些实施方案中，该NK激活结构域可包括细胞因子的至少一部分。

在一些实施方案中，该NK衔接结构域可包括选择性结合NK细胞的模块(moiety)。选择性结合NK细胞的该模块可活化NK细胞和/或阻断对NK细胞的抑制。在一些实施方案中，该NK衔接结构域可包括抗体或其片段。

在一些实施方案中，该靶细胞可为肿瘤细胞或被病毒感染的细胞。在一些实施方案中，该靶向结构域可包括抗体或其片段。在其它实施方案中，该靶向结构域可包括选择性结合靶细胞的配体或小分子。

在一些实施方案中，该分子可以设计为包括第二靶向结构域、第二NK激活结构域或第二NK衔接结构域。

在另一方面，本公开描述了经工程化以包括T细胞衔接结构域、可操作地连接至该T细胞衔接结构域的T细胞激活结构域，以及选择性结合靶细胞并可操作地连接至该T细胞激活结构域和该T细胞衔接结构域的靶向结构域的分子。

在一些实施方案中，该T细胞激活结构域可包括细胞因子的至少一部分。

在一些实施方案中，该T细胞衔接结构域可包括选择性结合T细胞的模块。选择性结合T细胞的该模块可活化T细胞和/或阻断对T细胞的抑制。在一些实施方案中，该T接合结构域可包括抗体或其片段。

在一些实施方案中，该靶细胞可为肿瘤细胞或被病毒感染的细胞。在一些实施方案中，该靶向结构域可包括抗体或其片段。在其它实施方案中，该靶向结构域可包括选择性结合靶细胞的配体或小分子。

在一些实施方案中，该分子可以设计为包括第二靶向结构域、第二T细胞激活结构域或第二T细胞衔接结构域。

在任一方面的一些实施方案中，该分子可在上文刚刚概述的任何两个结构域之间包括侧翼序列。在一些情况下，该分子可具有不止一个侧翼序列。

在另一方面，本公开描述了一种方法，其涉及将上文概述的工程化分子的任何实施方案，以有效诱导NK介导的靶细胞杀伤或T细胞介导的靶细胞杀伤(视所施用的特定分子的情况)的量施用于受试者。

本发明的以上的总结无意描述本发明的每个公开的实施方案或者每种实践。以下的说明书更具体地例举了阐释性实施方案。在该申请的若干处，通过列出实施例来提供指导，这些实施例可以以各种组合使用。每种情形下，所给出的列表仅用作代表性组，而不应解释为排他性列表。

附图简要说明

图1.161533三特异性杀伤衔接子(trispecific killer engager,TriKE)(SEQ IDNO:1)引起比1633双特异性杀伤衔接子(bispecific killer engager，BiKE)(SEQ ID NO:2)更好的纯化性质。(A)BiK E(左)和TriKE(右)结构域在pET表达载体中的编码区布置示意图。(B)在采用三步骤洗脱方案的药物纯化中作为第一阶段从离子交换柱洗脱的1633 BiKE(左)的吸光度曲线。从柱子洗脱的第一峰代表了产物。至于161533 TriKE(右)，峰1的吸光度近乎加倍，表明较好的产量。相似量的包涵体被重折叠和纯化。从柱子中去除所有蛋白。(C)在大小排阻柱上第二步纯化后SDS-PAGE凝胶和考马斯亮蓝染色。密度测定分析表明该产物超过95％纯。

图2.161533 TriKE引起针对靶的更好的NK细胞功能。同位素铬-51(⁵¹Cr)的释放经常被用于测量NK细胞功能(杀伤)。(A)新分离的PBMC与负载铬的HL-60细胞以20:1、6.6:1和2:1的E:T比例一起培养4小时。所标注的试剂在共培养开始时以20nM浓度添加。数据显示为％NK细胞细胞溶解活性。考虑到条件的数量，仅在1633和161533之间注意到显著性。n＝3。(B)为了评价161533 TriKE的特异性，针对CD33^-EpCAM⁺HT29靶进行了⁵¹Cr释放测定。EpCAM1533 TriKE用作阳性对照。n＝2。(C)采用磁珠从正常供体PBMC富集NK细胞，并让它们与单独的HL-60靶(10:1)或1633 BiKE或161533 TriKE存在下一起温育24小时。温育结束时，从每种培养物获取上清液，冷冻，用于随后通过Luminex多重测定(n＝5)评估分泌的IFNγ、TNFα、GM-CSF和MIP1a。点和条代表均值±SEM。

图3.该161533 TriKE介导NK细胞增殖(proliferation)和扩增(expansion)。让移植后患者PBMC负载CELLTRACE增殖染料(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)，并在50nM 1633 BiKE或161533 TriKE存在下与HL-60靶以5:1(E:T)的比例共培养7天。温育结束时，通过Live/Dead近IR染色评估了CD56⁺CD3^-NK细胞的活力。经1633 BiKE(灰)或161533TriKE(黑)处理的NK细胞群中的活力的(A)单独直方图和(B)合并分析。(C)然后通过TriKE组中活CD56^-CD3⁺T细胞(灰)和CD56⁺CD3^-NK细胞(黑)中的CELLTRACE稀释度来评估增殖。(D)合并的分析展示％分裂的细胞(上)和扩增指数(下)，其是考虑CELLTRACE稀释度的量而对群体内倍数扩增的计算。单个的点代表独立的移植后样品(n＝8)。

图4.161533 TriKE在移植后样品中强力挽救NK细胞功能。解冻移植后患者PBMC并静止过夜。第二晚，将它们与无药物、1633 BiKE(50nM)或161533 TriKE(50nM)一起温育。第二天早上，洗涤它们并给予与前一晚相同的处理(以确保没有与分子内化有关的事件)。(A)有标注的处理组PBMC与负载铬的HL-60一起温育4小时并计算％细胞溶解性活性。点和条表示均值±SEM(n＝9)。(B)在与HL-60靶一起温育4小时后CD56⁺CD3^-NK细胞上CD107a(左插图)、IFNγ(中间插图)和TNFα(右插图)表达的代表性直方图(B)和合并数据(C)。点表示单个患者样品(n＝10)。

图5.与BiKE比较，161533 TriKE增强针对原发性AML母细胞(primary AML blast)的NK细胞功能。移植后患者PBMC经解冻并静止过夜。第二晚，将它们与1633 BiKE(50nM)或161533 TriKE(50nM)一起温育。第二天早上，洗涤它们并给予与前一晚相同的处理(以确保没有与分子内化有关的事件)。来自两独立患者的单采产物(apheresis product)的原发性AML母细胞经解冻并静止过夜。将经处理的移植后患者PBMC(n＝6)与此两种不同原发性AML母细胞(n＝12，总计)一起温育4小时，并通过流式细胞术评估NK细胞功能。可通过测量CD107a形式的溶解性脱粒来评估NK功能。(A)表示与原发性AML母细胞一起温育4小时后经1633 BiKE(灰)或161533 TriKE(黑)处理的移植后患者NK细胞上CD107a(左)、IFNγ(中间)和TNFα(右)表达的代表性直方图。(B)经1633 BiKE和161533 TriKE处理并与原发性AML母细胞一起温育的移植后患者NK细胞上CD107a(左)、IFNγ(中间)和TNFα(右)的合并数据。每个方框代表与两种独立患者AML母细胞靶温育的独立移植后患者样品，通过填充方框和空方框表示(n＝12，总计)。

图6.161533 TriKE在体内限制HL-60肿瘤生长优于1633 BiKE。将HL-60-luc细胞静脉注射(injected iv)(7.5×10⁵个细胞/小鼠)进NSG小鼠，3天后输注经IL-15活化过夜的1百万个人NK细胞。该1633 BiKE和161533 TriKE组接受HL-60-luc和NK细胞，而对照组仅接受HL-60-luc细胞。在整个研究中MWF施用药物(50μg/kg)。(A)在研究的第14天(上)和第21天(下)在2分钟暴露中的个体小鼠发光(photoluminscence)(每个处理n＝5(除非小鼠死亡)，代表两个独立实验)。(B)在第14天(左)和第21天(右)定量来自3个处理组的小鼠中的发光。每个点代表不同的小鼠，条表示均值±SEM(n＝5，代表两个独立实验)。(C)在第20天从实验处理组的每个小鼠收集血。通过流式细胞术定量循环CD56+CD3-人NK细胞。收集经过60秒的事件，并计算人NK细胞事件的数量。显示了代表性的点图，指出了CD45+门值(gate)内NK(CD56+.CD3-)细胞事件的数量。展示第20天每个处理组中人NK细胞事件数量的总计数据。各个点代表不同的小鼠，条表示均值SEM(对于HL-60-luc组，n＝3[两只小鼠死亡]，对于1633 BiKE和161533 TriKE组，n＝5)。

图7.TriKE分子的侧翼序列和定位(orientation)二者都影响其功能。为了测试侧翼序列的影响，构建了161533的变体(161533NL，SEQ ID NO:5)，其在161533构建体中IL-15结构域两侧缺乏侧翼序列(PSGQAGAAASESLFVSNHAY，SEQ ID NO:3；和EASGGPE，SEQ ID NO:4)。来自两个独立供体(PB1和PB2)的新分离PBMC(对于本实例，含有3.5％NK细胞)以20:1的E:T比例与负载铬的HL-60细胞一起培养。所标注的试剂在共培养开始时以20nM浓度添加。数据显示为％NK细胞细胞溶解活性。161533反映包括带有完好侧翼序列的经修饰IL-15NK激活结构域的构建体。数据表明该带有侧翼序列的IL-15NK激活结构域增强TriKE功能。为了研究定位的影响，合成了IL-15位于N末端(151633；SEQ ID NO:6)或C末端(163315；SEQID NO:7)的构建体，并与具有作为交联物的IL-15的野生型161533比较。IL-15在分子中间产生的数据优化了NK细胞溶解活性。

图8.1615EpCAM TriKE(SEQ ID NO:8)引起比EpCAM16BiKE更好的纯化性质。(A)TriKE(1615EpCAM)结构域的编码区在pET表达载体中的布置示意图。(B)BiKE(16EpCAM)结构域的编码区在pET表达载体中的布置示意图。(C)在采用三步骤洗脱方案的药物纯化中作为第一阶段从离子交换柱洗脱的TriKE(1615EpCAM)的吸光度曲线。从柱子洗脱的第一峰代表了产物。(D)在采用三步骤洗脱方案的药物纯化中作为第一阶段从离子交换柱洗脱的BiKE(16EpCAM)的吸光度曲线。从柱子洗脱的第一峰代表产物，回收产量低于该TriKE。(F)在大小排阻柱上第二步纯化(E)后的SDS-PAGE凝胶和考马斯亮蓝染色。密度测定分析表明该产物超过95％纯。

图9.在铬释放测定中评价1615EpCAM TriKE(SEQ ID NO:8)的活性。按标注的各个效应细胞:靶(effector:target)比例将新分离的自然杀伤(NK)细胞添加至HT-29细胞(人结直肠癌细胞系)。选择天然具有不同水平循环NK细胞的供体(A)具有3.8％NK细胞的外周血单核细胞(PBMC)，(B)具有6.4％NK细胞的PBMC，(C)15％以及(D)从PBMC富集的>80％NK细胞。(E)1615EpCAM较高水平的杀伤与天然具有较高水平的NK杀伤的供体有关。在(E)中，仅针对4个供体比较了1615EpCAM的曲线，强调NK存在与药物诱导的细胞溶解活性直接相关。(F)显示，对于16EpCAM，不存在这种相关性。

图10.不同的表达EpCAM的靶癌细胞系中的溶解性脱粒。如所提到的，NK功能可通过作为对溶解性脱粒的衡量的CD107a表达的定量来测量。在CD56⁺CD3^-设定门值的NK细胞群内评价表达CD107a的细胞。将效应细胞PBMC与不同的带有EpCAM的靶细胞系一起温育，包括(A)BT-474、(B)SK-BR-3、(C)PC-3、(D)DU145、(E)UMSCC-11B、(F)NA和(G)SKOV-1。与对照以及与双特异性16EpCAM相比，添加至效应细胞和靶细胞的TriKE诱导了较高百分比的表达CD107a的细胞。用单因素ANOVA评价了P值，并与SD一起显示。*针对对照的评价；#1615EpCAM针对EpCAM16的评价。

图11.1615EpCAM TriKE的增殖能力。(A)为了评价NK细胞扩增，用1615EpCAMTriKE或EpCAM16BiKE处理外周血单核细胞。直方图中分立的峰表示细胞分裂(导致荧光强度反复轻微降低)后一代代的NK细胞。尽管NK细胞显示了典型的增殖模式，但T细胞没有。显示了五个独立实验的代表。(B)让PBMC细胞与该TriKE和BiKE共培养，并评价NK细胞增殖。显示了五个独立实验的代表。(C)让PBMC细胞与该TriKE、该BiKE、抗CD16scFv[CD16]、白细胞介素(IL)-15、抗EpCAM scFv[EpCAM]和DT2219(由连接至抗CD22和抗CD19scFv的白喉毒素构成的靶向毒素)一起温育。对NK细胞扩增指数的评价显示1615EpCAM构建体和单独IL-15中显著(p<0.001)增加的指数，用*标记，(n＝5)。(D)将纯化的NK细胞暴露于该TriKE和BiKE。7天后，将反应性染料用于区分活的和死亡细胞。该反应性染料透过死亡细胞的损伤膜，导致更强染色(右峰)，而未能透过活细胞膜导致较弱染色(左峰)。

图12.HT-29细胞中的溶解性脱粒和IFN-表达。为了研究NK细胞活性，在CD56⁺/CD3^-设定门值的NK细胞群内评价表达CD107a的细胞。(A)经1615EpCAM TriKE(SEQ ID NO:8)处理的细胞显示表达EpCAM的HT-29靶细胞的陡峭升高的脱粒，而对照并非如此。单独E:T、E:T加抗EpCAM scFv但无1615、E:T加单独抗CD16，以及E:T加IL-12和IL-18的组合(其不增强溶解性脱粒)没有任何效果。(B)分析该相同CD56⁺/CD3^-NK细胞群的IFN-γ产生。仅1615EpCAM显示了升高百分比的表达IFN-γ的细胞。数值与IL12+IL18组合(已知在超生理水平上刺激细胞因子产生)中看到的数值不接近。(C)当研究与EpCAM-HL-60髓系白血病细胞靶一起温育的NK细胞时，没有观察到表达CD107a的细胞。(D)仅IL12+IL18处理的E:T对照显示陡峭的IFN-γ表达。

图13.编码1615EpCAM133(SEQ ID NO:9)结构域的多核苷酸在pET表达载体中的布置示意图。采用DNA改组和DNA连接技术完成编码1615EpCAM133的杂交多核苷酸的合成和组装。从5'末端到3'末端，该完全组装的编码区具有NcoI限制性位点；ATG起始密码子；编码衍生自噬菌体展示库的人CD16(NM3E2)的V_H和V_L区的编码区、20个氨基酸的节段(PSGQAGAAASESLFVSNHAY；SEQ ID NO:3)、经修饰的IL-15、7氨基酸节段(EASGGPE；SEQ IDNO:4)、来自抗体MOC-31的人源化的抗EPCAM scFv、15个氨基酸的突变人IgG1铰链区，以及来自克隆7的CD133scFv；以及最后的NotI限制性位点。将所得的2715bp NcoI/NotI片段多核苷酸拼接进pET28c表达载体，处于异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(FischerBiotech,Fair Lawn,NJ)诱导型T7启动子的控制下。使用DNA测序分析(Biomedical Genomics Center,University of Minnesota,MN,USA)来核实该多核苷酸在序列中正确并且为同框克隆。

图14.1615EpCAM133的活性。将识别癌干细胞上表达的CD133的额外scFv添加至1615EpCAM以制备1615EpCAM133 TetraKE。(A)和(B)显示了用⁵¹Cr释放测定评价的1615EpCAM133活性。将来自两个供体(PT 1和PT 2)的新分离NK细胞添加至人结直肠癌细胞系Caco-2(CD133⁺，EpCAM⁺)。让细胞与靶以标明的效应细胞与靶(E:T)比例共培养4小时，然后评价⁵¹Cr释放。在(C)和(D)中，将来自供体的NK细胞暴露于人结直肠癌细胞系HT-29(EpCAM⁺,CD133^-)，并以与上文描述相同方式测量⁵¹Cr释放。

图15.正如1615EpCAM，由于IL-15的存在，1615EpCAM133显示了增强的扩增。采用与过量未标记的标注scFvs(1000nM)竞争的FITC标记的1615EpCAM133 TetraKE(200nM)进行对HT-29细胞(A)和Caco-2细胞(B)的结合测定。用200nM 1615EpCAM133和较低阻断的500nM scFv重复实验。结果是可重复的。(C)将纯化的NK细胞用CELLTRACE(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)染色以测量增殖，并与抗CD16 scFv[CD16]、抗CD133scFv[CD133]、1615EpCAM133 TetraKE、DT2219(连接至抗CD22和抗CD19scFv的突变的白喉毒素)、抗EpCAM scFv[EpCAM]、EpCAM16BiKE或IL-15[IL15]一起共培养7天(n＝5)。图显示每个组的扩增指数合并数据。(D)经CELLTRACE染料染色并与30nM 1615EpCAM133TetraKE或EpCAM16BiKE共培养7天的PBMC的代表性直方图。(E)比较CD56⁺CD3^-NK细胞和CD56^-CD3⁺T细胞增殖的代表性直方图。(F)显示纯化的NK细胞暴露于1615EpCAM133TetraKE或EpCAM16BiKE 7天后的存活(借助Live/Dead染料排除)的代表性直方图。死亡细胞显示摄入染料(高峰)，而活细胞将其排除(低峰)。用单因素ANOVA评价了P值，并与标准差一起显示。

图16.1615133(SEQ ID NO:10)的编码区在pET表达载体中的布置示意图。采用DNA改组和DNA连接技术合成编码1615133的杂交多核苷酸。从5'末端到3'末端，该完全组装的多核苷酸具有NcoI限制性位点；ATG起始密码子；编码抗CD16 scFv的编码区、20个氨基酸的节段(PSGQAGAAASESLFVSNHAY；SEQ ID NO:3)、突变的人IL-15、7氨基酸接头(EASGGPE；SEQID NO:4)，以及抗CD133scFv；以及NotI限制性位点。将所得的1884碱基对NcoI/NotI片段多核苷酸拼接进pET28c表达载体，处于异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导型T7启动子的控制下。

图17.⁵¹铬释放和TriKE 1615133的结合。(A,B)为了评价活性，采用两个供体进行了⁵¹铬释放测定。将1615133 TriKE、16133 BiKE、抗CD16 scFv[CD16]或抗CD133scFv[CD133]与标记的E:T比例的CD133⁺Caco-2细胞和PBMC共培养。(C)将PBMC和Caco-2细胞暴露于不同的TriKE浓度(1nM、5nM、10nM)并按它们的E:T比例(20:1、6.6:1、2.2:1、0.75:1、0.23:1、0.08:1)进行滴定。(D)将FITC标记1615133 TriKE以标记的浓度与Caco-2细胞一起温育。在该相同实验中，添加相同量的FITC标记1615133，但含有用于阻断的200nM单体CD133scFv。

图18.扩增和存活。(A)将纯化的NK细胞暴露于抗CD16 scFv(CD16)、抗CD133scFv(CD133)、16133 BiKE、1615133 TriKE、DT2219(由连接至白喉毒素的抗CD22和抗CD19scFv构成的靶向毒素)或NCI衍生的IL-15。仅TriKE和IL-15显著增加增殖(n＝5)。图显示在Flowjo软件中计算的每个组的扩增指数合并数据。(B)将纯化的NK细胞暴露于1615133TriKE和16133 BiKE，并温育7天。代表性的直方图显示与没有IL-15模块的该BiKE构建体相比该TriKE伴有较高量的活细胞。用单因素ANOVA评价了显著性，并与标准差一起显示。

图19.用几种不同的新TriKE进行了⁵¹铬释放测定，以显示靶向癌细胞的任何scFv都可并入功能性TriKE中。(A)将EpCAM+CD133+NG2+非小细胞肺癌NCI-H460细胞加NK细胞与1615EPCAM133 TriKE或1615NG2TriKE(神经胶质细胞抗原2或CSPG4)一起温育。1615NG2和1615EpCAM133在几个不同的E:T比例(20:1、10:1和5:1)都具有活性。(B)将间皮素+EpCAM-CD133-NG2MDA-435A黑素瘤细胞与1615EPCAM TriKE(SEQ ID NO:8)或1615Meso TriKE(SEQID NO:11)TriKE一起温育。仅1615Meso具有活性。(C)将间皮素+NG2+卵巢癌细胞(Ovcar3细胞)与1615NG2TriKE或1615SS1TriKE一起温育。1615Meso和1615NG2具有活性。(D)Raji细胞与NK一起培养并在⁵¹Cr释放测定中研究。TriKE 16152219(SEQ ID NO:12)同时靶向B细胞标志物CD19和CD22。仅16152219、162219和利妥昔单抗杀伤CD22+CD19+靶。对照不杀伤。

图20.合成了与IL-2一起起作用并刺激T细胞而不是NK细胞增殖的TriKE。为了确定其它细胞因子是否代替IL-15起作用，在IL-2两侧采用与NK激活TriKE构建体中IL-15结构域两侧所使用的相同侧翼序列构建了CD3-IL-2-EpCAM(SEQ ID NO:13)。用CELLTRACE(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)标记PBMC，并将它们在无处理(阴性对照)、1615EpCAM TriKE(阳性对照)、CD3EpCAM BiTE、CD3-IL-2-EpCAM TriKE、10ng/ml IL-2或100ng/ml IL-2下培养。该CD3-IL2-EpCAM TriKE比1615EpCAM TriKE、CD3EpCAM BiTE或IL-2更强地刺激CD3+T细胞，无论是10ng/ml还是100ng/ml。

图21.测试了CD3-IL2-EpCAM的CD3部分，其为完好的。(A)和(B):将该相同抗CD3scFv拼接进白喉毒素并与CD3+HPBMLT靶细胞一起温育。添加CD3-IL2-EpCAM以观察其是否阻断DT3(CD3靶向毒素)杀伤HPB-MLT的能力。在0.1nM DT3(A)和1.0nM DT3(B)存在下，CD3-IL-2-EpCAM的阻断活性为剂量依赖的，表明CD3-IL2-EpCAM的CD3模块是完好的。(C)和(D):CD3-IL2-EpCAM阻断DT2219(抗CD22和CD19靶向毒素)对阴性对照CD3-Raji细胞杀伤的能力。

图22.CD16纳米抗体衍生自公开的美洲驼纳米抗体(GeneBank序列EF561291)。将该CD16纳米抗体拼接至CD19，以测试这种CD16衔接子驱动NK细胞杀伤的能力。(A)在以CD19+Raji靶进行的铬释放测定中，该CD16纳米抗体显示了与利妥昔单抗介导的杀伤类似的细胞溶解NK活性。(B)将该CD16 CDR克隆进人源化的骆驼科动物骨架中，以生成HuEF91，一种人源化的CD16衔接子。HuEF91结合相当于CD16scFv结合，表明该人源化HuEF91不阻碍该分子的特异性。(C)该美洲驼161533 TriKE(SEQ ID NO:14)能够扩增NK细胞。

具体实施方式

自然杀伤(natural killer，NK)细胞为有免疫监视能力的先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞。如同细胞毒性T细胞，NK细胞递送许多穿膜和凋亡诱导性粒酶(granzyme)和穿孔素颗粒。不同于T细胞，NK细胞不需要抗原致敏(antigen priming)并且在不存在MHC识别情况下通过接合激活受体来识别靶。

NK细胞表达CD16，一种活化受体，其结合IgG抗体的Fc部分并且参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。NK细胞由IL-15调节，其可诱导增加的抗原依赖的细胞毒性、淋巴因子活化的杀伤活性，和/或介导干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)和/或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)应答。这些IL-15被激活的功能都有助于改善的癌症防御。

在治疗上，当与刺激NK细胞存活和体内扩增的淋巴消耗化学疗法(lymphodepleting chemotherapy)和IL-2联合时，NK细胞的过继转移可例如在患有难治性急性髓系白血病(AML)的患者中诱导缓解。这种治疗可受限于缺乏抗原特异性和IL-2介导的对抑制NK细胞增殖和功能的调节性T(Treg)细胞的诱导。制成在绕过Treg抑制的负面作用的同时驱动NK细胞抗原特异性、扩增，和/或持续的试剂可增强基于NK细胞的免疫治疗。

本公开描述生成三特异性分子(tri-specific molecule)，其包括两个能够驱动NK细胞介导的肿瘤细胞(例如，CD33⁺肿瘤细胞和/或EpCAM⁺肿瘤细胞)杀伤的结构域和能够生成NK细胞自我维持信号(self-sustaining signal)的分子内NK激活结构域。该三特异性分子可驱动NK细胞增殖和/或增强NK细胞驱动的针对例如HL-60靶、癌症细胞或癌症细胞衍生细胞系的细胞毒性。

已制备了双特异性融合蛋白，其包含衍生自人噬菌体展示库技术的抗人抗CD16scFv(McCall等,1999.Mol Immunol.36:433-445)。NK细胞通过CD16(FcγRIII)受体介导抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)。经由CD16受体的信号转导诱导钙流入和ITAM的磷酸化，触发了裂解性颗粒(lytic granule)以及诸如干扰素(IFNγ)和肿瘤坏死因子(TNFα)的细胞因子的释放。双特异性分子已被设计来触发该CD16受体连同其它靶向分子(Gleasonet al.Blood.2014(19):3016-26)，即所谓的双特异性杀伤衔接子(bispecific killerengager,BiKE)。带有一个识别NK细胞的scFv和另一个识别肿瘤抗原的scFv，BiKE可在各种人类癌症中明显增强细胞毒性杀伤。一个示例性BiKE靶向CD33并增强针对急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)的NK细胞应答。MDS为克隆性异质性干细胞病症，特征为正常的或细胞过多的骨髓(BM)和外周血(PB)细胞减少以及增加的进展至AML的风险。

NK细胞应答于各种细胞因子，包括例如IL-15，其参与了NK细胞动态平衡(homeostasis)、增殖、存活、活化和/或发育。IL-15和IL-2共享几个信号转导组分，包括IL-2/IL-15Rβ(CD122)和共同的γ链(CD132)。与IL-2不同，IL-15不刺激Treg，使得能够在绕过免疫应答的Treg抑制时让NK细胞活化。除了促进NK细胞平衡和增殖之外，IL-15可挽救移植后环境中可能发生的NK细胞功能缺陷。IL-15还刺激CD8⁺T细胞功能，进一步增强了其免疫治疗潜能。此外，基于临床前研究，在低剂量时IL-15的毒性情况可能比IL-2更有利。

IL-15在NK细胞发育平衡、增殖、存活和活化中起作用。IL-15和IL-2共享几个信号转导组分，包括IL-2/IL-15Rβ(CD122)和共同的γ链(CD132)。IL-15还活化NK细胞，并且在造血干细胞移植(HSCT)后在植入的NK细胞中恢复功能缺陷。

在一方面，本公开描述了三特异性杀伤衔接子(TriKE)分子，其通常包括一个或更多个NK细胞衔接子结构域(例如，CD16、CD16+CD2、CD16+DNAM、CD16+NKp46)，一个或更多个靶向结构域(其靶向例如肿瘤细胞或被病毒感染的细胞)，以及一个或更多个细胞因子NK激活结构域(例如，IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其它NK细胞增强细胞因子、趋化因子，和/或激活分子)，每个结构域可操作地连接至其它结构域。用在本文时，术语“可操作地连接”指直接或间接的共价连接。因此，可操作地连接的两个结构域可以直接共价地彼此偶联。相反地，两个可操作地连接的结构域可以通过与居间模块(例如，和侧翼序列)的共同共价连接而连接。两个结构域可以被认为是可操作地连接的，如果例如它们通过第三结构域分隔开，存在或不存在一个或更多个居间侧翼序列。

NK衔接结构域可包括结合和/或活化NK细胞的任何模块和/或阻断对NK细胞的抑制的任何模块。在一些实施方案中，该NK衔接结构域可包括选择性结合NK细胞表面组分的抗体。在其它实施方案中，该NK衔接结构域可包括选择性结合NK细胞表面组分的配体或小分子。用在本文时，术语“选择性结合”指在两个或更多个备选者之间进行区分的能力，例如，对特定靶具有任何程度的差异性亲和力。用在本文时，“抗体”一般指免疫球蛋白或其片段，因此涵盖了单克隆抗体、其片段(例如，scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv或其它修饰形式)、单克隆抗体和/或其片段的组合，和/或多克隆抗体的组合。因此，为了简洁，对选择性结合NK细胞的表面组分的抗体的提及包括显示出所描述的结合特征的任何抗体片段。类似地，对选择性结合NK细胞的表面组分的配体的提及包括显示出所描述的结合特征的任何配体片段。

在一些实施方案中，该NK衔接结构域可选择性结合至少部分地位于NK细胞表面的受体。在某些实施方案中，该NK衔接结构域可提供结合NK细胞的功能，因此让NK与靶向结构域(在下文有更详细描述)选择性结合的靶在空间上临近。但是，在某些实施方案中，该NK衔接结构域可选择性结合活化NK细胞的受体，并因此还具有激活功能。如上文所描述的，CD16受体的活化可引起抗体依赖的细胞介导的细胞毒性。因此，在某些实施方案中，该NK衔接结构域可包括有效选择性结合该CD16受体的抗CD16受体抗体的至少一部分。在其它实施方案中，该NK衔接子细胞结构域可中断抑制NK细胞的机制。在这样的实施方案中，该NK衔接子结构域可包括例如抗PD1/PDL1、抗NKG2A、抗TIGIT、抗杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)，和/或任何其它抑制阻断性结构域。

可将NK衔接结构域设计为具有期望程度的NK选择性，以及由此而来的期望的免疫接合特征。例如，CD16已被鉴定为Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。这些受体结合IgG抗体的Fc部分，它们接着可活化NK细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性。抗CD16抗体选择性结合NK细胞，但也可结合中性粒细胞。抗CD16a抗体选择性结合NK细胞，但不结合中性粒细胞。包括包含抗CD16a抗体的NK衔接结构域的TriKE实施方案可结合NK细胞，但不结合中性粒细胞。因此，在可能需要接合NK细胞但不接合中性粒细胞的情况下，可将该TriKE的NK衔接结构域设计为包括抗CD16a抗体。

尽管在NK衔接结构域包括抗CD16受体scFv的各种实施方案上下文中有本文的描述，但该NK衔接结构域可包括选择性结合CD16受体的任何抗体或其它配体。此外，该NK衔接结构域可包括选择性结合任何NK细胞受体的抗体或配体，所述NK细胞受体例如为细胞毒性受体2B4、低亲和力Fc受体CD16、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD2、NKG2A、TIGIT、NKG2C、LIR-1，和/或DNAM-1。

靶向结构域可包括选择性结合预期靶的任何模块，所述预期靶例如为肿瘤细胞、癌间质中的靶、诸如CD33+骨髓衍生的抑制细胞的抑制性细胞上的靶或被病毒感染的细胞上的靶。因此，靶向结构域可包括例如抗肿瘤抗体，例如利妥昔单抗(rituximab，抗CD20)，阿夫土珠单抗(afutuzumab，抗CD20)、曲妥珠单抗(trastuzumab，抗HER2/neu)、帕妥珠单抗(pertuzumab，抗HER2/neu)、拉贝珠单抗(labetuzumab，抗CEA)、阿德木单抗(adecatumumab，抗EpCAM)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox，抗EpCAM)、依决洛单抗(edrecolomab，抗EpCAM)、阿西莫单抗(arcitumomab，抗CEA)、贝伐珠单抗(bevacizumab，抗VEGF-A)、西妥昔单抗(cetuximab，抗EGFR)、尼妥珠单抗(nimotuzumab，抗EGFR)、帕尼单抗(panitumumab，抗EGFR)、扎鲁木单抗(zalutumumab，抗EGFR)、吉妥单抗(gemtuzumabozogamicin，抗CD33)、林妥珠单抗(lintuzumab，抗CD33)、埃达珠单抗(etaracizumab，抗整合素α_vβ₃)、英妥木单抗(intetumumab，抗CD51)、伊匹单抗(ipilimumab，抗CD152)、oregovomab(抗CA-125)、伏妥莫单抗(votumumab，抗肿瘤抗原CTAA16.88)，或pemtumumab(抗MUC1)、抗CD19、抗CD22、抗CD133、抗CD38抗间皮素、抗ROR1、CSPG4、SS1，或IGFR1。

在其它实施方案中，该靶向结构域可选择性结合被病毒(例如，腺病毒、HIV、CMV，和/或HPV)感染的细胞上的靶。

在某些特定实施方案中，该靶向结构域可包括抗CD33抗体。在其它特定实施方案中，该靶向结构域可包括抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体。

该NK激活结构域可包括活化NK细胞、促进NK细胞维持或以其它方式促进NK细胞活性的氨基酸序列。该NK激活结构域可以是或可衍生自能活化和/或维持NK细胞的一种或更多种细胞因子。用在此处时，术语“衍生自”指细胞因子(例如，IL-15)的足以提供NK细胞激活和/或维持活性的氨基酸片段。在包括不止一个NK激活结构域的实施方案中，该NK激活结构域可以以序列形式或任何其它组合的形式提供。此外，每个基于细胞因子的NK激活结构域可包括细胞因子的全氨基酸序列或可以为氨基酸片段，与包括在该TriKE分子中的其它NK激活结构域的性质无关。NK激活结构域可以以其为基础的示例性细胞因子包括例如IL-15、IL-18、IL-12和IL-21。因此，尽管在本文关于NK激活结构域衍生自IL-15的示例性模型实施方案的上下文中有详细描述，但可以采用NK激活结构域是任何适合的细胞因子或衍生自任何适合的细胞因子来设计TriKE。

在本说明书中，为了简洁，通过辨识NK激活结构域所基于的细胞因子而对NK激活结构域的提及包括该细胞因子的全氨基酸序列、该细胞因子的任何适合的氨基酸片段，和/或包括一个或更多个氨基酸替换的该细胞因子的修饰版本。因此，对“IL-15”NK激活结构域的提及包括包含IL-15的全氨基酸序列的NK激活结构域，包含IL-15的片段的NK激活结构域，或例如与野生型IL-15氨基酸序列相比包含氨基酸替换的NK激活结构域，例如IL-15N72D或IL-15N72A。

在TriKE中使用IL-15NK激活结构域可提供持续的NK细胞活性(甚至在3周之后)，如通过在小鼠模型中显示出人NK细胞显著升高和癌症减小所证实的。NK细胞在小鼠中被活化以产生一批抗癌因子和细胞因子。另外，图1显示，IL-15NK激活结构域以某种方式改变了这些分子的化学性质，以便它们能够更容易地重折叠和/或以更高的产量回收，因此使得该TriKE分子更适合于临床放大。

在一些实施方案中，该分子还可包括可连接两个上述结构域的侧翼序列。在一些实施方案中，该侧翼序列的存在还可增加NK细胞活化。一个示例性侧翼序列包括SEQ IDNO:3的20个氨基酸。另一个示例性侧翼序列包括SEQ ID NO:4的7个氨基酸。某些实施方案(例如，161533 TriKE，SEQ ID NO:1)可包括不止一个侧翼序列。作为一个实例，SEQ ID NO:1包括SEQ ID NO:3的侧翼序列以将NK衔接结构域(例如，抗CD16受体scFv)与NK激活结构域(例如，IL-15)连接。SEQ ID NO:1还包括SEQ ID NO:4的侧翼序列以将NK激活结构域与靶向结构域(例如，抗CD33svFv)连接。图7显示了证实缺乏侧翼序列的构建体与具有侧翼序列的构建体相比表现出降低的活性的数据。

161533 TriKE的合成和纯化

为了产生抗原特异性的和自我维持针对白血病的NK细胞应答的示例性模型治疗性TriKE，将修饰的人IL-15交联物引入1633 BiKE中以产生161533 TriKE(图1A)。该TriKE的FPLC图显示了来自细菌表达系统的需要重折叠的高产量产物(图1B)。该IL-15NK激活结构域降低等电点两个pH单位，产生了对于纯化和增加产量更有利的条件。尽管从相同量的包涵体开始纯化，161533 TriKE的最终产量为可比较的BiKE(1633，没有IL-15NK激活结构域)的产量的两倍，表明更有利的纯化动力学。通过SDS-PAGE凝胶分析和考马斯亮蓝染色，产物为>95％纯的(图1C)。为了核实结合和特异性在该新TriKE分子中完好保留，通过直接结合和针对CD33⁺EpCAM^-HL-60细胞和CD33^-EpCAM⁺HT-29细胞的阻断性流式细胞测定来测量选择性(表1和表2)。

表1.通过流式细胞术测量的BiKE和TriKE的结合

表2.通过抗原阻断确定的特异性

161533 TriKE增加NK细胞功能

为了确定对IL-15的包纳是否保留了生物工程化的1633的介导ADCC的能力，在4小时的铬释放测定中比较了1633和161533，其中对来自健康供体的PBMC试验了它们杀伤CD33⁺HL-60靶的能力(图2A)。161533 TriKE诱导了比BiKE更高的NK细胞介导的杀伤，特别是在20:1的比例时(58.3±2.3％对比33±4％，P＝0.0184)。与未处理对照相比抗CD16和抗CD33的对照样品不加强应答，显示这种单独的组分没有活性。为了在细胞毒性测定中试验特异性，将161533 TriKE与NK细胞和CD33^-HT-29靶细胞一起温育(图2B)。与未处理对照相比，该161533 TriKE在杀伤HT-29细胞方面没有显示显著增加。为了确保HT-29靶细胞不是仅仅更有抵抗力而作为对特异性的解释，将HT-29与含有替代抗CD33的抗EpCAM scFv的新IL-15TriKE一起温育。这种TriKE强力地杀伤EpCAM⁺HT-29细胞，突出了IL-15NK激活结构域TriKE平台针对血液系统恶性肿瘤和实体瘤恶性肿瘤的多用途。

除了重定向的细胞毒性，NK细胞的另一功能是在靶细胞识别后产生细胞因子和趋化因子。为了测试该TriKE是否增强该过程，将NK细胞和HL-60靶在不存在分子、存在1633BiKE或存在161533 TriKE下一起温育，24小时后收集上清液并分析炎性细胞因子和趋化因子(图2C)。当与无药物或BiKE比较时，TriKE显著诱导了IFNγ、TNFα、GM-CSF和MIP-1α分泌。这些数据表明，该TriKE中的IL-15分子可诱导促炎细胞因子和趋化因子分泌，这可以增强NK细胞的抗肿瘤活性。

161533 TriKE诱导移植后NK细胞的存活和扩增

IL-15的一个治疗性优点在于其参与了NK细胞的动态平衡和扩增。因此，对161533TriKE进行测试以评价这些生物学功能是否在TriKE分子内保留活性。为了在生理学相关背景下对此进行测试，使用了移植后早期患者样品。这些样品提供了这样的环境，其中需要NK细胞重建(reconstitution)来介导抗肿瘤的移植物抗白血病(GvL)应答。移植后早期的评价时间点特别令人感兴趣，因为NK细胞缺陷在这些相同的时间点介导靶细胞诱导的细胞因子产生，这可能导致早期复发(Foley等,2014.Immunol Rev 258(1):45-63)。将移植后患者PBMC(移植后100天[n＝5]或较早的20-44天[n＝5])用CELLTRACE染料(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)标记以测量增殖，与HL-60靶和1633 BiKE或161533TriKE一起温育7天，然后用Live/Dead染料标记以测量NK细胞存活。在与1633 BiKE一起温育的PBMC内，大多数NK细胞摄入了Live/Dead染料，表明为存活不佳。相比之下，与161533TriKE一起温育的患者PBMC支持了极好的NK细胞存活(图3A和3B；96.9±0.5％对比21±5.4％；P<0.0001)。为了了解161533 TriKE中的IL-15模块是否还驱动增殖，评价了CELLTRACE染料在活NK细胞群中的稀释度。出人意料地，该161533 TriKE在移植后患者样品中诱导了强劲的和特异的NK细胞增殖，而相同样品中具有最低的T细胞增殖(图3C和3D)(分离的NK细胞79.1±2.5％对比T细胞2.3±1.1％，P<0.0001)。与全部T细胞相比，该NK细胞还具有显著更高的扩增指数(expansion index)(7.2±0.8％对比1.1±0.1％，P<0.0001)，这代表了总的倍数扩增。这提示，作为在构建体中位于scFv分子侧翼的结果，IL-15在161533TriKE中的活性可以为更加NK细胞特异性的。另外，将NK细胞与161533 TriKE一起温育产生强劲增殖，其反映了饱和浓度的IL-15介导的扩增。因此，TriKE中的IL-15NK激活结构域在功能上有活性，并能够将自身维持信号递送至健康供体Nk细胞和/或可驱动移植后患者NK细胞的存活和增殖(NK细胞重建有缺陷的环境)。

161533 TriKE挽救移植后早期缺陷的NK细胞功能

在同种异体造血干细胞移植后，NK细胞在数量上增加并应答IL-12和IL-18刺激，但暴露于癌细胞系靶时表现出应答不足超过6个月。在这种情况下，短期暴露于与IL-15一起温育过夜可挽救针对K562靶的NK细胞功能(Foley等,2011,Blood 118(10):2784-2792)。鉴于示例性TriKE 161533分子作为移植后免疫治疗的潜在临床开发，将该TriKE和可比的BiKE(1633)分子在来自同种异体的同胞(sibling)造血干细胞移植接受者的移植后PBMC上进行测试(图4)。将1633 BiKE或161533 TriKE与NK细胞一起温育过夜，允许功能恢复，并在第二天早上让细胞与HL-60靶一起温育并分析功能。尽管与仅有NK细胞针对HL-60靶相比，与1633 BiKE一起温育导致了HL-60靶的加倍杀伤(18.9±2.1％对比9±1.5％，P<0.0001)，但是与BiKE相比，与161533 TriKE温育有力地挽救NK细胞介导的细胞毒性功能至更高程度(52.1±3.5％)(图4A)。细胞毒性的增加与通过CD107a表达测量的增加的脱粒很好地相关(图4B和4C左插图)。与BiKE相比，该TriKE有力地挽救了IFNγ(BiKE＝2.6±0.5％对比TriKE＝21.7±4.4％，P＝0.0012)和TNFα(BiKE＝6.1±1％对比TriKE＝29.9±3.8％，P<0.0001)产生(图4B和4C中间和右侧插图)。在全部测定中，与该BiKE相比，该TriKE诱导了增加的功能性。这些变化的量级清楚地阐释了161533 TriKE在移植后早期环境中的免疫治疗潜力。

161533 TriKE增加了针对原发性AML母细胞的NK细胞功能

为了比较1633 BiKE和161533 TriKE针对原发性AML母细胞的活性，将来自移植后患者的PBMC与来自两不同患者的原发性AML母细胞(AML1和AML2)一起温育。与HL-60靶相比，针对原发性母细胞的CD107a、IFNγ和TNFα诱导减弱(图5对比图4)。该功能上的降低可能部分地归于原发性母细胞上降低的CD33表达，但抑制性配体的表达或缺乏激活受体配体也可能有助于该降低的功能。尽管相同条件下在AML1和AML2之间未看到NK细胞活化方面的显著差异，但与161533 TriKE一起温育的来自移植后患者样品的PBMC显著(p<0.05)诱导了比与1633 BiKE一起温育的PBMC更高的脱粒(CD107a)和细胞因子产生(IFNγ和TNFα)(图5A和图5B)，提示与IL-15组合的活化联合对原发性AML靶是有效的。合起来，这些体外数据表明，该161533 TriKE可让NK细胞抗原特异性的针对原发性肿瘤细胞。

161533 TriKE诱导增强的体内NK细胞存活和功能

BiKE和TriKE的体内活性比较需要开发鼠异种移植模型，其同时容纳CD33⁺白血病进展和人NK细胞。静脉内注射含有荧光素酶报告基因的HL-60细胞(7.5×10⁵个细胞/小鼠)，接着在3天后输注经IL-15活化过夜的1百万个人NK细胞。图6显示了成像数据，描绘了处理组的每一个中的HL-60-luc肿瘤负荷。在对照组仅接受HL-60-luc细胞但无药物或NK细胞时，1633BiKE和161533 TriKE组接受HL-60-luc细胞和NK细胞。在整个研究中MTWThF施用药物(50μg/kg)。在第14天(图6B)，BiKE和TriKE组显著不同于对照组(p<0.05)，但彼此之间不是，表明在早期时间点BiKE和TriKE类似地影响肿瘤进展。但是，在第21天，发现在存活方面无药物组和BiKE组之间无显著差异，尽管在该时间点之前来自无药物组的两只小鼠死亡。另一方面，TriKE组显著不同于对照组(p<0.05)，并且在该时间点也不同于BiKE组，表明用161533 TriKE治疗在稍晚阶段对HL-60肿瘤负荷的较好控制。

鉴于来自图3体外实验中注意到的NK细胞存活和增殖结果，通过TriKE产生的在体内对HL-60-luc肿瘤的增加的控制可能至少部分地由所转移的NK细胞群通过161533 TriKE分子中IL-15模块而增加的维持和扩增所介导。因此，在第20天对小鼠取血(20μL)，并评价在固定的获取时间期间(60sec)获得的NK细胞(CD56⁺CD3^-)事件的数量。对照和1633 BiKE处理的动物都没有显示循环CD56⁺CD3^-人NK细胞的明显证据，显示了在这些条件下不佳的存活和扩增(图6C和6D)。鲜明对比的是，全部的161533-TriKE处理动物显示了高水平的人NK细胞(4261±410.6个事件)。经161533-TriKE处理的小鼠具有大约比BiKE NK水平高200倍的NK细胞水平，表明该TriKE分子内作为NK激活结构域的IL-15分子的强力生物学贡献。因此，在TriKE中使用IL-15NK激活结构域可减少治疗所需求的包括提供外源IL-15来维持NK细胞数量。

侧翼序列和定位影响TriKE活性

设计了161533构建体的变体，其在IL-15的两侧没有侧翼序列，以便测试侧翼序列对该分子功能性的影响。将该新的变体，本文中称为161533NL(SEQ ID NO:5)，与161533构建体(SEQ ID NO:1)在铬释放杀伤试验中进行比较。图7显示了在两个独立供体(PB-1和PB2)中侧翼序列影响TriKE的活性。也构建了IL-15位于N末端(151633；SEQ ID NO:6)和C末端(163315；SEQ ID NO:7)位置的定位变体。图7也显示了161533构建体(其在中间位置包括作为交联物的IL-15并具有侧翼序列)产生更强的NK细胞细胞溶解活性。与亲本野生型161533(57％)相比，没有侧翼序列的161533NL在20:1的E:T比例时显示了25％细胞毒性，证实侧翼序列通常增加TriKE构建体诱导的NK细胞细胞溶解活性。

1615EpCAM TriKE

为了构建自我维持杂交免疫衔接子，通过将人IL-15并入EpCAM16BiKE(图8B)而组装了1615EpCAM TriKE(图8A，SEQ ID NO:8)。该TriKE构建体含有编码抗CD16 scFv的V_H和V_L区的DNA片段，拼接至IL-15，接着拼接至抗EpCAM scFv的V_H和V_L区。在该IL-15DNA片段两侧分别有20个氨基酸(aa)节段(SEQ ID NO:3)和EASGGPE(SEQ ID NO:4)。在采用三步骤洗脱方案的药物纯化中作为第一阶段从FFQ离子交换柱洗脱的1615EpCAM TriKE和EpCAM16BiKE的吸光度描记图分别显示在图8C和8D中。从柱子洗脱的第一峰代表了目的产物(productof interest)。当相似量的包涵体被重折叠和纯化时，IL-15交联物的加入出人意料地改善了产量。当与EpCAM16BiKE比较时，1615EpCAM TriKE中的吸光度几乎是3倍，表明更好的产量。SDS-PAGE凝胶和考马斯亮蓝染色显示了离子交换和大小排阻柱纯化后的纯度(图8E和8F)，得到超过90％纯的产物，大小约68860kDa。因此，与缺乏IL-15的相应BiKE(本例中，EpCAM16)相比，犹如在161533 TriKE(SEQ ID NO:1)中观察到的，将IL-15直接并入杂交TriKE赋予了更好了纯化性质。

1615EpCAM TriKE诱导铬-51释放

为了确定1615EpCAM的功能活性，在标准⁵¹铬释放测定中测量了其杀伤能力(图9)。为了确定将IL-15并入EpCAM16骨架的效果，在具有不同NK细胞含量的各种各样的供体中评价了NK细胞介导的细胞毒性。以20:1、6.6:1和2.2:1的效应细胞(E):靶(T)比例将新分离的PBMC添加至HT-29细胞，产生细胞溶解曲线。将工程化试剂以30nM的浓度(滴定实验后的最大有效剂量)添加。具有3.8％、6.4％、15％，以及富集NK细胞>80％(如通过流式细胞术确定的)的供体显示，IL-15组分普遍地改善NK细胞的杀伤能力(分别为图9A、9B、9C和9D)。在图9E中，仅绘出了针对1615EpCAM的供体曲线，强调了增加的NK存在与细胞溶解活性之间的直接相关性。图9F显示了针对EpCAM16的供体曲线，不存在这种相关性。由于基线波动，通过以不同供体重复来确保可重复性。合起来，数据表明，测定中NK细胞的数量越多，则观察到的NK细胞溶解活性越强。

1615EpCAM TriKE在各种细胞系中诱导溶解性脱粒(lytic degranulation)和IFN-γ表达

为了确定其它表达EpCAM的靶细胞系是否如同HT-29靶细胞系诱导类似的1615EpCAM TriKE介导的NK细胞活化，在各种靶上结合不同的药物处理测试了NK细胞功能。研究了乳腺癌(图10A和10B)、前列腺癌(图10C和10D)、头颈癌(图10E和10F)，以及卵巢癌细胞系(图10G)。与包括单独E:T、E:T加IL-15、E:T加CD16CD133(无关BiKE)，以及E加IL-12/IL-18在内的各种对照相比时，所有的经1615EpCAM(SEQ ID NO:8)处理的EpCAM⁺癌细胞系都诱导了显著升高的NK细胞脱粒(p<0.001)。E:T加EpCAM16BiKE也显示出明显百分比的表达CD107a的细胞和细胞毒性活性，因为该BiKE具有细胞毒性活性，但缺乏扩增能力。因此，采用EpCAM16BiKE观察到的值显著小于对1615EpCAM观察到的值(p<0.001)。

1615EpCAM TriKE诱导NK细胞增殖

1615EpCAM TriKE(SEQ ID NO:8)诱导NK细胞增殖的能力显示在图11中。当供体PBMC细胞暴露于该TriKE时，是NK细胞而不是T细胞显示了增殖特异性模式，如通过流式细胞术测量的(图11A)。该结果在4个供体的3个中是相同的。当暴露于该TriKE时，NK细胞经历比T细胞更强力的增殖。图11B显示了EpCAM16BiKE和1615EpCAM TriKE诱导的NK增殖的直接比较。该TriKE诱导增殖和扩增，但BiKE并非如此。为了排除诱导NK细胞增殖的其它因素的可能性，将PMBC暴露于TriKE、BiKE、单独的抗CD16 scFv、单独的IL-15、单独的抗EpCAMscFv或DT2219(包括连接至抗CD22scFv和抗CD19scFva的白喉毒素的靶向毒素)。仅TriKE处理组和IL-15处理组展现了显著的NK细胞增殖，如扩增指数的变化所指出的(图11C)，其反映了细胞的加倍扩增。以TriKE刺激的组显示了较高的NK细胞存活，而暴露于BiKE的组主要含有死亡细胞，如用前向/侧向散射流式细胞术(图11D)和台盼蓝染色所证实的。这些数据表明，除了增加对细胞的致敏(priming)之外，1615EpCAM TriKE中的IL-15模块还诱导了NK细胞的扩增和维持。

1615EpCAM TriKE诱导针对HT-29靶细胞的溶解性脱粒和IFN-γ表达

为了研究作为NK细胞活性的参数的溶解性脱粒，在与表达EpCAM的HT-29靶一起温育的CD56⁺/CD3^-NK细胞群内测量了CD107a表达。当与单独的效应细胞、效应细胞加靶无药物或效应细胞加靶和抗EpCAM scFv相比时，与EpCAM16BiKE一起温育的细胞显示了升高的CD107a表达。1615EpCAM TriKE诱导了比该BiKE显著更高的CD107a表达(图12A)。当与没有任何效果的各种各样的对照(包括单独E:T、E:T加抗EpCAM scFv但无1615、E:T加单独抗CD16 ScFv、CD2219，以及E:T加IL-12和IL-18的组合)相比时，该1615EpCAM还诱导显著升高的脱粒。两种不同来源的独立IL-15，当与E:T组合时，也不能增强溶解性脱粒(IL-15自身，连接蛋白(linker protein)；IL-15NCI，NCI衍生的)。当与经单独BiKE处理或经BiKE加IL-15处理的NK细胞相比时，在1615EpCAM TriKE处理的NK细胞中IFN-γ的产生也增强了，表明该TriKE内的IL-15模块诱导致敏用于细胞因子分泌的生物学能力。如前所述，各种各样的对照相对于该TriKE进行了测试，其中仅IL-12/IL-18超生理刺激(supraphysiologicstimulation)胜过该TriKE。

在图12C中，当NK细胞与对照EpCAM^-HL-60髓系白血病细胞一起温育时，没有观察到CD107a表达。除了用IL-12/IL-18处理的对照细胞外(显示该IFN-γ测定正常工作)，如所预期的，用阴性对照HL-60靶没有观察到IFN-γ表达的升高。

1615EpCAM133诱导铬-51释放

工程化的四特异性1615EpCAM133(SEQ ID NO:9)的设计显示在图13中。为了测量NK细胞杀伤，用铬释放测定评价1615EpCAM133活性。采用Caco-2(CD133⁺，EpCAM^-)和HT-29(CD133^-，EpCAM⁺)靶以及用于每种癌细胞系的新分离的两个供体(PT1和PT2)的NK细胞进行该测定，将无抗体(无Ab)、抗CD16 scFv、抗CD133scFv、抗EpCAM scFv、单独的IL-15，以及EpCAM16BiKE作为对照进行。在全部供体以及在两种癌细胞类型中，1615EpCAM133在逐渐增加的E:T比例时都显示出较好的杀伤(图14A-D)。对照显示了最低活性。这些数据表明，靶向癌细胞上的两个不同部分是可能的。在本例中，一个为较广泛的上皮标志物靶(EpCAM)，另一个为更特异的抗癌肝干细胞靶CD133。

1615EpCAM133诱导NK细胞增殖

1615EpCAM133选择性结合的能力显示在图15A和15B中。该分子内IL-15模块诱导增殖和存活的能力显示在图15C-F中。将纯化的NK细胞暴露于CD16 scFv、抗CD133scFv、1615EpCAM133、DT2219(连接至抗CD22和抗CD19scFv的突变白喉毒素)、抗EpCAM scFv、EpCAM16BiKE或单独IL-15(NCI)。确定培养物的总体扩增的扩增指数显示了1615EpCAM133组和IL-15组中显著增强的扩增(p<0.001)，(图15C)。为了比较IL-15接头(linker)诱导增殖的能力，将PBMC或纯化的NK细胞在用反应性染料染色后培养并暴露于EpCAM16BiKE或1615EpCAM133四特异性分子。温育后，进行流式细胞术，对设定门值的(gated)CD56⁺CD3^-细胞以评价NK细胞，对设定门值的(gated)CD56^-CD3⁺细胞以评价T细胞。在图15D中，仅经1615EpCAM133处理的NK细胞显示了明显的增殖。用EpCAM16BiKE处理的没有增殖。诱导NK细胞特异增殖的能力显示在图15E中；T细胞在暴露于1615EpCAM133后不增殖。

为了研究1615EpCAM133增强NK细胞存活的能力，将纯化的NK细胞共培养7天，并用with1615EpCAM133或EpCAM16BiKE处理。在死-活染色(live-dead staining)后通过流式细胞术，在1615EpCAM133组看到高得多百分比的活NK细胞(图15F)。

1615133诱导铬-51释放

工程化的1615133的设计显示在图16中。为了评价该1615133 TriKE的功能活性，进行了标准⁵¹铬释放测定。为了确定将IL-15并入该16133骨架的效果，采用两个独立供体的NK细胞和Caco-2肿瘤靶以不同的E:T比例(20:1、10:1和5:1)评价了细胞毒性，并比较了1615133TriKE、16133 BiKE、抗CD16 scFv、抗CD133scFv，以及无药物处理之间的活性(图17A和17B)。与对照相比在该TriKE中对Caco-2靶的杀伤升高。用较大范围的E:T比例(20:1、6.6:1、2.2:1、0.7:1、0.23:1和0.08:1)进行的1615133 TriKE(1nM、5nM和10nM)剂量依赖性滴定显示在较高的剂量有最高的药物活性影响(图17C)。为了评价结合的特异性，在Caco-2细胞与不同浓度(1nM、5nM、10nM、50nM、00nM、200nM或500nM)的FITC标记的1615133TriKE温育后测量了基于流式细胞术的荧光密度。当未标记的抗CD133scFv(200nM)与该1615133TriKE一起添加时，结合明显降低(图17D)，表明该1615133 TriKE特异地通过与CD133相互作用而结合靶细胞。合起来，这些数据表明通过该TriKE介导的ADCC为抗原定向的。

1615133诱导NK细胞增殖

1615133(SEQ ID NO:10)诱导的增殖通过活NK和T细胞群中的CELLTRACE染料稀释度来测量。当供体PBMC暴露于1615133 TriKE或16133 BiKE，仅该TriKE组诱导增殖(图18A)。重要的是，当与包括抗CD16 scFv、抗CD133scFv、DT2219(由连接至白喉毒素的抗CD22和抗CD19scFva构成的靶向毒素)，以及NCI衍生的IL-15在内的其它对照试剂比较时，显示仅该1615133 TriKE和NCI IL-15诱导增殖。为了显示1615133 TriKE诱导存活延长的潜力，将纯化的NK细胞与1615133或16133 BiKE一起温育7天。将反应性染料用于在不同的处理组中定量细胞死亡。相对于该BiKE，该TriKE组显示较大量的活细胞，这些细胞不摄入反应性染料(图18B)。合起来，结果表明存在于1615133 TriKE中的IL-15诱导了NK细胞增殖和并延长了它们的存活。

TriKE普遍诱导铬-51释放

用几种不同的TriKE进行了⁵¹铬释放测定，以显示靶向癌细胞的任何scFv都可并入功能性TriKE中。将非小细胞肺癌细胞(NCI-H460)与1615EPCAM133 TriKE(SEQ ID NO:9)或1615NG2TriKE一起温育。1615NG2和1615EpCAM133在几个不同的E:T比例(20:1、10:1和5:1)都具有活性。图19B显示黑素瘤细胞与该1615EPCAM133 TriKE一起温育。将间皮素+EpCAM-NG2MDA-435A黑素瘤细胞与1615EPCAM TriKE或1615Meso TriKE(SEQ ID NO:11)一起温育。仅1615Meso具有活性。将卵巢癌细胞(Ovcar3细胞)与1615NG2TriKE或该1615Meso TriKE一起温育。两种TriKE都诱导NK细胞溶解活性。还制备了识别白血病标志物CD19和CD22的抗白血病TriKE。将16152219TriKE在CD22+CD19+Raji细胞上进行测试，并很好地杀死它们(如同利妥昔单抗一样好)。合起来，这些数据显示，可将任何scFv插入该一般化的1615X TriKE结构平台，所得到的TriKE可将NK细胞导向为应答该scFv靶并扩增。其它的示例性TriKE分子列在表3中。

表3.示例性TriKE分子

TriKE分子	靶	ADCC*	扩增**	活化***
					161533	CD33	+	+	+
1615EpCAM	EpCAM	+	+	+
					1615EpCAM133	EpCAM/CD133	+/+	+/+	+/+
1615133	CD133	+	+	+
					1615NG2	NG2	+	+	+
1615Meso	间皮素	+	+	+
					1615ROR-1	ROR-1	+	+	+
16a1538	CD38	+	+	+
					1615IGF-1	IGF1	+	+	+
1615Her2	Her2/neu	+	+	+
					16152219	CD22/CD19	+/+	+/+	+/+
美洲驼161533	CD33	+	+	+
					1615HIV	HIV	+	+	+

*通过TriKE平台ADCC或细胞毒性活性增强超过30％

**扩增：TriKE增强NK细胞扩增，BiKE不增强。

***活化：TriKE增强各种抗癌细胞因子的产生，包括INFγ和TNFα。

已经产生了几种TriKE，并用相同方式但靶向不同癌标志物进行了测试。CD33或Siglec-3(唾液酸结合性Ig样凝集素3、SIGLEC3、SIGLEC-3、gp67、p67)为在骨髓细胞系细胞上表达的跨膜受体。它们通常被认为是骨髓特异的。上皮细胞粘附分子EpCAM为跨膜糖蛋白，在上皮中介导不依赖于Ca²⁺的同型细胞之间的粘附。CD133也称prominin-1，为糖蛋白，其在人体内由PROM1基因编码，为特异定位至细胞突起(cellular protrusion)的五次跨膜糖蛋白(5-跨膜，5-TM)的成员。NG2为硫酸软骨素蛋白聚糖4，也称为黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)或神经元-胶质细胞抗原2(NG2)。其代表了由人恶性黑素瘤细胞表达的整合膜硫酸软骨素蛋白聚糖。间皮素为存在于正常间皮细胞上的40kDa蛋白，并在包括间皮瘤、卵巢和胰腺腺癌的几种人肿瘤中过表达。ROR-1为调节神经突生长的受体酪氨酸激酶。其为属于细胞表面受体的ROR亚族的I型膜蛋白，对其在癌细胞转移中的角色目前处于研究中。HER2为人表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员。CD38(分化簇38)，也称为环ADP核糖水解酶，为在很多免疫细胞表面上发现的糖蛋白。IGF-1为胰岛素样生长因子1(IGF-1)，也称为生长调节素C。IGF-1为在人体中由IGF1基因编码并与乳腺癌相关的蛋白。人免疫缺陷病毒(HIV)为慢病毒(逆转录病毒的亚群)，其引起HIV感染，并随时间引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和卡波西氏肉瘤。

CD3-IL2-EpCAM TriKE选择性促进T细胞增殖

已合成了用IL-2替换IL-15起作用的具有相同侧翼序列的TriKE。这些刺激T细胞而不是NK的扩增。合成了T细胞定向的TriKE CD3-IL-2-EpCAM(SEQ ID NO:13)，并测试了其刺激T细胞而不是NK细胞的能力(图20)。已知IL-2为比IL-15更好的T细胞增殖刺激物。将PBMC细胞用CELLTRACE(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)标记并进行培养。直方图显示CD3-IL-2-EpCAM驱动T细胞而不是NK细胞强劲增殖。CD3-IL-2-EpCAM显示比任何其它测试的试剂(包括1615EpCAM TriKE(阳性对照)、CD3EpCAM BiTE、CD3-IL-2-EpCAM、IL-2或无处理)更好的刺激。这些数据表明，当在该平台上用作交联物时，IL-2以与IL-15相同的方式起作用。

因此，本公开描述了能够在NK细胞和靶之间产生免疫学突触(immunologicsynapses)的三特异性杀伤衔接子(TriKE)的设计和使用。将CD33⁺髓系靶用作模型TriKE的模型靶，该模型TriKE包括作为模型NK衔接结构域的抗CD16抗体、作为模型靶向结构域的靶向该CD33⁺髓系靶的抗CD33抗体、基于IL-15的模型NK激活结构域，以及在该NK激活结构域的两侧将该NK激活结构域连接至其余结构域的侧翼序列。这些侧翼序列为该NK激活结构域上游的PSGQAGAAASESLFVSNHAY(SEQ ID NO:3)和该NK激活结构域下游的EASGGPE(SEQ IDNO:4)。这些侧翼序列影响TriKE分子的功能活性并代表了完全未预料到的发现。

在NK细胞介导的针对HL-60靶的应答的细胞毒性、CD107a脱粒和细胞因子产生测定方面，一个示例性模型TriKE(161533，SEQ ID NO:1)展示了比可比的双特异性杀伤衔接子(1633 BiKE，SEQ ID NO:2)增加的功能。采用在同种异体干细胞移植后早期收集的患者NK细胞(NK细胞功能有缺陷的环境下)，评价了该示例性模型TriKE在生理学方面的活性。与该1633 BiKE相比，含有IL-15NK激活结构域的该TriKE诱导NK细胞而不是T细胞的存活和增殖。该示例性模型TriKE分子还诱导低反应性患者NK细胞介导针对原发性急性髓系白血病靶的强力应答。最后，该示例性模型TriKE分子与可比的BiKE相比展现了更佳的抗肿瘤活性，并在采用HL-60-Luc和人NK细胞的异种模型中在体内诱导了人NK细胞的持续和存活至少3周。

本文展示的这些数据确认了示例性TriKE分子的功用，并为设计和构建可选的TriKE分子提供了基础。如上文详细描述的，TriKE分子可以采用任何适合的NK衔接结构域和/或任何适合的靶向结构域来设计。

该示例性161533 TriKE(SEQ ID NO:1)被用作模型是因为CD16在NK细胞的表面表达。因此，选择性结合NK细胞的scFv可用作NK细胞接合结构域。CD33在AML急性髓系白血病细胞(常见形式的成人白血病)上表达，但也在骨髓异常增生细胞上被发现，这可能是倾向AML的信号。因此，抗CD33scFv可用作靶向结构域。

但是，在可选的实施方案中，抗EpCAM抗体可用在TriKE的靶向结构域中。EpCAM为在大多数类型的癌(carcinoma)上表达的上皮癌标志物，例如，肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、GI、肾癌，以及卵巢癌。显示包括抗EpCAM scFv的TriKE(1615EpCAM，SEQ IDNO:8)增强结直肠癌细胞杀伤的数据表明，任何适合的靶向结构域(例如，任何适合的scFv)可包括进基于抗CD16/IL15平台的TriKE中，具有类似的成功。该1615EpCAM TriKE包括作为NK衔接结构域的抗CD16 scFv、IL-15NK激活结构域和作为靶向结构域的抗EpCAM scFv。

在另一可选的实施方案中，已知CD38在多种骨髓瘤细胞上表达。显示包括抗CD38scFv的TriKE(16a1538，SEQ ID NO:16)在体外增强多种骨髓瘤细胞杀伤的数据进一步表明了该TriKE平台的一般模块性(general modularity)。该16a1538TriKE包括作为NK衔接结构域的抗CD16a scFv、IL-15NK激活结构域和作为靶向结构域的抗D38scFv。最终，通过设计该分子以包括第二靶向结构域可生成TetraKE(四聚体)。例如，可设计TetraKE以将CD133scFv(SEQ ID NO:17)包括至例如1615EpCAM TriKE(SEQ ID NO:8)，以形成示例性TetraKE(1615EpCAM133，SEQ ID NO:9)。CD133为在癌干细胞上确认的标志物。癌干细胞代表肿瘤中的小群干细胞，它们负责肿瘤起始(initiation)、更新(renewal)，以及化学疗法耐药。

在一些实施方案中，本公开描述了同时介导ADCC并提供诱导NK效应细胞扩增和维持的自我维持信号的免疫衔接子。尽管包括拼接至抗EpCAM scFv的抗CD16 scFv的BiKE促进了NK效应细胞和表达EpCAM的癌细胞之间的免疫突触的形成，这导致在靶细胞的ADCC中细胞毒性脱粒达到顶峰，但细胞毒性活性和NK寿命二者可受益于共刺激信号的添加，该共刺激信号直接在免疫接合位点增强效应细胞扩增。在一些实施方案中，这种共刺激信号通过添加非常适合于扩增NK细胞的试剂来提供。例如，为了有利于选择性NK扩增，将IL-15交联进EpCAM16BiKE。如实施例2中所显示的，IL-15向免疫衔接子的分子添加可介导NK增殖，可产生持续的ADCC活性，并且可改善该免疫衔接子的溶解性脱粒和细胞因子分泌。

在一些实施方案中，该NK细胞衔接子可涉及使用衍生自动物纳米抗体(nanobody)的人源化CD16衔接子。尽管scFv具有通过接头连接的重链可变组分和轻链可变组分，但纳米抗体由能够特异地接合靶的单条单体可变链即可变重链或可变轻链构成。纳米抗体可以衍生自任何适合动物的抗体，例如骆驼科动物(camelid)(例如，美洲驼(llama)或骆驼(camel))或软骨鱼类(cartilaginous fish)。与较长的抗体片段相比，纳米抗体可提供较好的物理稳定性，结合深沟(deep groove)的能力，以及增加的生产产量。

在一个示例性实施方案中，基于纳米抗体的NK衔接子分子可包括衍生自公开的称为EF91的美洲驼纳米抗体(GeneBank序列EF561291；Behar等,2008.Protein Eng DesSel.21(1):1-10)的人源化CD16纳米抗体。首先将美洲驼EF91构建进含有CD19的BiKE中，以测试这种CD16衔接子驱动NK细胞活化的能力。在以Raji靶进行的铬释放测定中，其显示了类似于利妥昔单抗介导的杀伤的功能性(图22A)。在确认了该分子的功能性后，将CDR克隆进人源化骆驼科动物骨架中以人源化该CD16衔接子，现在称为HuEF91。HuEF91的结合显示在图22B中，与采用标准CD16 scFv所观察到的结合相等，表明将该美洲驼纳米抗体可变重链并入人源化骨架中没有妨碍该分子的特异性。将HuEF91用作本文描述的TriKE分子中的NK衔接子可增加药物产量、增加稳定性，和/或增加NK细胞介导的ADCC功效。

在一些实施方案中，本文描述的免疫衔接子可用于刺激患者自身的免疫系统以消除肿瘤。尽管有研究显示T细胞(经遗传修饰以表达嵌合抗原受体)为强大的抗肿瘤活性的临床调节物，但T-CAR的生产是昂贵并复杂的。其它的缺点包括细胞因子毒性风险以及T-CAR的长期持续导致与健康组织的相互作用或者致瘤性转化。如本文所描述的，三特异性杀伤衔接子可用作ADCC调节物并且可扩展NK细胞，而无需体外遗传修饰和基因治疗，提供了优于该T-CAR系统的潜在优点。因为该免疫衔接子被快速清除，应答不能无限期持续，也许与T-CAR相比会降低该免疫衔接子的细胞因子毒性风险。

在一些实施方案中，三特异性杀伤衔接子包括细胞因子。在一些实施方案中，三特异性杀伤衔接子优选包括IL-15。IL-15不诱导T_reg并且IL-15为NK细胞的调节物。除了改善活化和细胞毒性，IL-15还可调节和启动NK细胞上的抗凋亡和增殖性信号，导致增强的NK细胞扩增和存活。这些特征在抗癌处理中使用该三特异性杀伤衔接子期间是有益的。在一些实施方案中，在该三特异性杀伤衔接子中包括进IL-15可介导该TriKE向NK/靶细胞突触的递送，相比比全身性IL-15潜在地引起IL-15更有效地在肿瘤位点积累。

在一些实施方案中，三特异性杀伤衔接子优选包括IL-15、抗CD16 scFv，以及抗EpCAM scFv(1615EpCAM TriKE)。在一些实施方案中，IL-15用作该抗CD16 scFv和该抗EpCAM scFv之间的交联物。

在一些实施方案中，该免疫衔接子增加免疫细胞介导的细胞因子的分泌。在一些实施方案中，该细胞因子分泌优选为抗原特异的。在一些实施方案中，这种细胞因子可包括IFN-γ、GM-CSF、IL-6、IL-8，和/或TNF-α。在一些实施方案中，该细胞因子产生优选为生理学水平。在一些实施方案中，该细胞因子产生的水平低于在IL-12/IL-18刺激的NK细胞中观察到的水平。如实施例2所显示的，使用细胞因子Luminex分析对包括GM-CSF、IL-6、IL-8、TNF-α在内的标志性炎性细胞因子的测量证实了BiKE和TriKE之间GM-CSF分泌的统计学显著差异，但在其它细胞因子的分泌方面没有差异。

在一些实施方案中，该免疫衔接子增加淋巴细胞增殖。该淋巴细胞可例如包括NK细胞、γδ-T细胞，和/或CD8 T细胞。

正如1615EpCAM133 TetraKE分子包括不止一个靶向结构域，可设计包括不止一个NK细胞衔接子结构域和/或不止一个NK激活结构域的TetraKE或更大分子。

在另一方面，本公开描述了在受试者中杀伤靶细胞的方法。一般地，该方法包括以有效诱导NK介导的靶细胞杀伤的量的TriKE分子施用于该受试者。“处理(treat)”或其变型指任何程度上的减弱、限制进展、缓解或消退与状况(condition)的症状或体征。用在本文时，“缓解(ameliorate)”指特定状况特征性的症状或临床体征的程度、严重性、频率，和/或可能性的任何降低；“症状(symptom)”指疾病或患者状况的任何主观证据；以及“体征(sign)”或“临床体征(clinical sign)”指涉及特定状况的能够被不同于患者的其它人发现的客观身体发现结果。

“处理(treatment)”可以为治疗性的或者预防性的。“治疗性的(therapeutic)”及其变型指缓解一种或更多种与状况有关的症状或临床体征的处理。“预防性的(prophylactic)”及其变型指在任何程度上限制状况的症状或临床体征的发生和/或出现的处理。通常，“治疗性”处理在受试者中状况显现后开始，而“预防性”处理在受试者中状况显现前开始。因此，在一些实施方案中，该方法可涉及对有发生状况风险的受试者的预防性处理。“有......风险(at risk)”指受试者可以实际上具有或没有所描述的风险。因此，例如，有发生特定状况的风险的受试者为具有一种或更多种患有或发生特定状况的增加的风险的迹象(indicia)的受试者(与缺乏该一种或更多种迹象的个体相比)，无论该受试者是否显现了患有或发生该状况的任何症状或临床体征。状况的示例性迹象可例如包括遗传素质(genetic predisposition)、血统(ancestry)、年龄、性别、地理位置、生活方式或病史。处理还可以是在症状消退后持续的，例如以防止或延迟它们的复发。

在一些情况下，该处理可涉及以该TriKE分子施用于受试者，以使得该TriKE分子可在体内刺激内生NK细胞。将TriKE分子用作体内一部分可让NK细胞在可能为抗原特异的同时共刺激、存活增强，以及扩增方面为抗原特异的。在其它情况下，该TriKE可在体外用作NK细胞过继转移治疗的佐剂。

在另一方面，该TriKE可设计为活化T细胞而不是NK细胞。在这方面，该TriKE可通常包括一个或更多个T细胞衔接结构域、一个或更多个T细胞激活结构域、一个或更多个靶向结构域(其靶向例如肿瘤细胞或被病毒感染的细胞)，以及一个或更多个T细胞激活结构域(例如，IL-2或其它T细胞增强细胞因子、趋化因子，和/或激活分子)，每个结构域可操作地连接至其它结构域。

该T细胞衔接结构域可包括结合和/或活化T细胞的任何模块和/或阻断对T细胞的抑制的任何模块。在一些实施方案中，该T细胞衔接结构域可包括选择性结合T细胞表面组分的抗体或其片段。在其它实施方案中，该T细胞衔接结构域可包括选择性结合T细胞表面组分的配体或小分子。

在一些实施方案中，该T细胞衔接结构域可选择性结合至少部分地位于T细胞表面的受体。在某些实施方案中，该T细胞衔接结构域可提供结合T细胞的功能，因此让T细胞与靶向结构域(在下文有更详细描述)选择性结合的靶在空间上临近。但是，在某些实施方案中，该T细胞衔接结构域可选择性结合活化T细胞的受体，并因此还具有激活功能。

尽管在T细胞衔接结构域包括抗CD13受体scFv的各种实施方案上下文中有本文的描述，但该T细胞衔接结构域可包括选择性结合CD13受体的任何抗体或其它配体。此外，该T细胞衔接结构域可包括选择性结合任何T细胞受体的抗体或配体，例如，抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗LFA-1抗体、抗LFA-2抗体、抗CTLA4抗体、抗TCR抗体、抗CD28抗体、抗CD25抗体、抗PD1抗体、PD-1L、B7-1、B7-2、MHC分子、CD80、CD86、B7H、抗SLAM抗体或抗BTLA抗体。

靶向结构域可包括选择性结合预期靶的任何模块，所述预期靶例如为肿瘤细胞、癌间质中的靶、诸如CD33+骨髓衍生的抑制细胞的抑制性细胞上的靶或被病毒感染的细胞上的靶。因此，靶向结构域可包括例如上文在NK激活TriKE分子上下文中描述的任何一个靶向结构域。

该T细胞激活结构域可包括活化T细胞、促进T细胞维持或以其它方式促进T细胞活性的氨基酸序列。该T细胞激活结构域可以是或可衍生自能活化和/或维持T细胞的一种或更多种细胞因子。用在此处时，术语“衍生自”指细胞因子(例如，IL-2)的足以提供T细胞激活和/或维持活性的氨基酸片段。在包括不止一个T细胞激活结构域的实施方案中，该T激活结构域可以以序列形式或任何其它组合的形式提供。此外，每个基于细胞因子的T激活结构域可包括细胞因子的全氨基酸序列或可以为氨基酸片段，与包括在该TriKE分子中的其它T细胞激活结构域的性质无关。T细胞激活结构域可以以其为基础的示例性细胞因子包括例如IL-2或共享IL-2受体的链的IL-2家族的任何细胞因子，例如IL-15、IL-4、IL-7、IL-9、IL-21，以及IL-13。因此，尽管在本文关于T细胞激活结构域衍生自IL-2的示例性模型实施方案的上下文中有详细描述，但可以采用T细胞激活结构域是任何适合的细胞因子或衍生自任何适合的细胞因子来设计TriKE。

在本说明书中，为了简洁，通过辨识T细胞激活结构域所基于的细胞因子而对T细胞激活结构域的提及包括该细胞因子的全氨基酸序列和该细胞因子的任何适合的氨基酸片段。因此，对“IL-2”T细胞激活结构域的提及包括包含IL-2的全氨基酸序列的T细胞激活结构域或包含IL-2片段的T细胞激活结构域。因此，在一些实施方案中，该T细胞激活结构域可包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

在另一方面，本公开描述了在受试者中杀伤靶细胞的方法。一般地，该方法包括以有效诱导T细胞介导的靶细胞杀伤的量的TriKE分子施用于该受试者。这里再次地，该处理可以为治疗性的或预防性的，如上文在涉及使用NK激活TriKE的方法上下文中所描述的。

因此，TriKE分子，无论是NK激活TriKE或T细胞激活TriKE，可以在该受试者首次出现该状况的症状或临床体征之前、期间或之后给药。在该受试者首次出现与该状况相关的症状或临床体征之前起始的处理可以导致该受试者与未以该TriKE分子给药的受试者相比经历该状况的临床实证(clinical evidence)可能性的降低，该状况的症状和/或临床体征严重性的降低，和/或完全解除该状况。在该受试者首次出现与该状况相关的症状或临床体征之后起始的处理可以导致与未以该组合物给药的受试者相比该状况的症状和/或临床体征严重性的降低，和/或完全解除该状况。

该TriKE分子可以为上文描述的具有选择性结合适当的靶细胞群的靶向结构域的TriKE分子的任何实施方案。在一些情况下，该靶细胞可包括肿瘤细胞，以使得该方法可涉及处理与该肿瘤细胞相关的癌症。因此，在一些实施方案中，该方法可包括缓解该肿瘤的至少一个症状或临床体征。

在靶细胞包括肿瘤细胞的实施方案中，该方法还可包括手术切除该肿瘤和/或通过化学(例如，化学治疗的)和/或放射疗法减小该肿瘤的大小。可以处理的示例性肿瘤包括与前列腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、黑素瘤、肾癌(kidney cancer)、肾脏的癌症(renal cancer)、口腔癌、咽癌、胰腺癌、子宫癌、甲状腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌和/或造血系统癌症(hematopoietic cancers)相关的肿瘤。

在各种实施方案中，该TriKE靶向结构域可包括选择性结合例如EGFR、HER2/neuEpCAM、CSPG4、HSPG2、IGF-1、CD38、CD19、CD20、CD22、CD30、CD52、CD33、ROR-1、UPAR、VEGFR、CD33、LIV-1、SGN-CD70A、CD70、IL-3、IL-4R、CD133、间皮素、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、TRAIL、CD38、CD45、CD74、CD23或癌症病毒标志物如HIV的多肽。

用在本文时，“受试者”可以是任何动物，例如哺乳动物(例如，狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猴等)。在某些实施方案中，该受试者可以是人。

本文描述的TriKE分子可以与药学上可接受的载体一起配制。用在本文时，“载体”包括任何溶剂、分散介质、媒介、包衣、稀释剂、抗菌剂，和/或抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。将这些介质和/或试剂用于药学上有活性的物质在本领域内是公知的。考虑将其用在治疗性组合物中，但如任何常规媒介或试剂与该活性成分不相容则属例外。补充性活性成分也可掺入到该组合物中。用在本文时，“药学上可接受的”指不是生物学上或其它方面不利的物质，即，该物质可以与TriKE分子一起施用于个体，而不引起任何不希望的生物效果或与其所在的药物组合物中的任何其它组分以有害方式相互作用。

TriKE分子因此可以配制成药物组合物。该药物组合物可以配制为适合于首选施用途径的各种形式。由此，组合物可通过已知途径施用，例如包括口服、胃肠外(例如，皮内、经皮、皮下、肌内、静脉内、腹膜内，等等)或局部施用(例如，鼻内、肺内、乳房内、引道内、子宫内、皮内、经皮、直肠施用，等等)。药物组合物可例如通过施用至例如鼻粘膜或呼吸粘膜(例如，通过喷雾或气溶胶)而施用至粘膜表面。组合物也可通过持续或延缓释放施用。

因此，TriKE分子可以以任何适合的形式提供，包括但不限于溶液、混悬液、乳剂、喷雾剂、气溶胶或任何形式的混合物。该组合物可以在制剂中与任何药学上可接受的赋形剂、载体或媒介一起递送。例如，该制剂可以以传统的局部剂型递送，例如乳膏、软膏、气溶胶制剂、非气溶胶喷雾、凝胶、洗剂等。该制剂还可以包括一种或更多种添加剂，例如，佐剂、皮肤渗透促进剂、着色剂、芳香剂、风味剂、湿润剂、增稠剂，等等。

制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域公知的方法制备。以药学上可接受的载体制备组合物的方法包括让TriKE分子与构成一种或更多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，可以通过让活性分子均匀和/或紧密结合液体载体、细碎的固体载体或二者，并且将产物成形为期望的制剂，来制备制剂。

所施用的TriKE分子的量可以随各种因素变化，包括但不限于，所用的具体TriKE分子、体重、身体状况，和/或受试者年龄，和/或施用途径。因此，包括在给定单位剂型中的TriKE分子的绝对重量可大范围变动，并取决于一些因素，例如受试者的物种、年龄、体重和身体状况，以及施用方法。相应地，普遍性地阐述构成对所有可能应用有效的TriKE分子的量的量是不实际的。然而，本领域普通技术人员通过适当考虑这些因素可容易地确定合适的量。

在一些实施方案中，该方法可包括以足够的TriKE分子施用以便向受试者提供例如从约100ng/kg至约50mg/kg的剂量，尽管在一些实施方案中，该方法可以通过以超出此范围的剂量的TriKE分子实施该方法。在这些实施方案的一些中，该方法包括以足够的TriKE分子施用以向受试者提供从约10μg/kg至约5mg/kg的剂量，例如从约100μg/kg至约1mg/kg的剂量。

或者，可以采用在处理过程开始前获得的实际体重来计算该剂量。对于以此方式计算的剂量，在处理过程开始之前采用Dubois法计算身体表面积(m²)：m²＝(wt kg^0.425×身高cm^0.725)×0.007184。

在一些实施方案中，该方法包括以足够的TriKE分子施用以提供例如从约0.01mg/m²至约10mg/m²的剂量。

在一些实施方案中，TriKE分子可以例如每周单剂量至施用多剂量，尽管在一些实施方案中可通过以超出该范围的频率用TriKE分子施用来实施该方法。在某些实施方案中，TriKE分子可以约每月施用一次至每周约给药5次。

在一些实施方案中，该方法还包括以一种或更多种另外的治疗剂施用。该一种或更多种另外的治疗剂可以在TriKE分子施用之前、之后和/或同时施用。TriKE分子和该另外的治疗剂可以共施用。用在本文时，“共施用”指两种或更多种组分的组合施用，以使得该组合的治疗性或预防性效果可高于任一组分单独施用的治疗性或预防性效果。两组分可以同时或依序共施用。同时共施用的组分可以提供在一种或更多种药物组合物中。两种或更多种组分的依序共施用包括这样的情况，即其中以药物组分施用使得每种组分同时存在于处理位点处。或者，两种组分的依序共施用可包括这样的情况，即其中至少一种组分已从处理位点清除，但该组分施用的至少一种细胞效应(例如，细胞因子产生、某些细胞群的活化，等)在该处理位点持续，直至一种或更多种另外的组分被施用至该处理位点。因此，共施用的组合可在某些情形下包括彼此从不以化学混合物的形式存在的组分。在其它实施方案中，该TriKE分子和该另外的治疗剂可以作为混合物(mixture)或混合剂(cocktail)的一部分施用。在一些方面，与其它治疗剂(一种或更多种)单独施用相比，TriKE分子的施用可以允许较低剂量的其它治疗模式的有效性，由此降低在较高剂量的该其它治疗剂(一种或更多种)施用时观察到的毒性的可能性、严重性，和/或程度。

示例性的另外治疗剂包括六甲蜜胺(altretamine)、安吖啶(amsacrine)、L-天冬酰胺酶、左旋天冬酰胺酶、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡氯芥(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环形磷酰胺(cytophosphane)、阿糖胞苷()、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多烯紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟达拉滨(fludarabine)、福莫司汀(fotemustine)、更昔洛韦(ganciclovir)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、依达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamaide)、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(lomustine)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、丝裂霉素C(mitomycin C)、尼莫司汀(nimustine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、甲基苄肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、塞替派(thiotepa)、托泊替康(topotecan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)，以及长春瑞滨(vinorelbine)。

在一些实施方案中，该方法可包括以本文描述的足够的TriKE分子施用和以证实了治疗协同效应的该至少一种另外的治疗剂给药。在本发明方法的一些方面，在本文描述的TriKE分子和该另外的治疗剂二者施用后观察到的对处理的应答测量值相对于在该TriKE分子或该另外的治疗剂单独施用后观察到的对处理的应答的相同测量值得到改善。在一些实施方案中，另外的治疗剂可包括靶向EpCAM的另外的治疗剂，包括例如EpCAM特异性单克隆抗体，例如卡妥索单抗(Catumaxomab)，一种靶向EpCAM和CD3的单克隆杂交抗体。

在前文描述和所附的权利要求书中，术语“和/或(and/or)”指所列出的元素的一个或全部或所列出的元素的任意两个或更多个的组合；当出现在说明书和权利要求书中时，术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”及其变型应理解为开放式的，即，另外的元素或不足是可选的并且可以存在或不存在；除非另有指出，“a”、“an”、“the”以及“atleast one”可互换使用，指一个或一个以上；通过用端点对数值范围进行描述包括含纳在该范围内的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5，等等)。

在前面的描述中，为了清楚起见，可以孤立地描述特定实施方案。除非另有明确指明特定实施方案的特征与另一实施方案的特征不相容之外，否则某些实施方案可包括本文结合一个或多个实施方案而描述的相容特征的组合。

对于本文公开的包括分开步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进行。视情况，两个或更多个步骤的任意组合可以同时进行。

通过以下实施例阐述本发明。应当理解，特定的实例、物质、量以及程序应根据本文描述的发明的范围和精神在广义上解释。

实施例

实施例1

细胞分离、患者和样品

通过使用Histopaque梯度的离心，从获得自Memorial Blood Center(Minneapolis,MN)的成人血液分离来自年龄匹配的正常供体的PBMC，并冷冻保存。对于移植后患者样品研究，从免疫重建组织库(immune reconstitution tissue bank)使用匹配的同胞供体(sibling donor)同种异体造血细胞移植样品。在移植后100天[n＝5]或较早(20-44天)[n＝5]时收集受体PBMC，冷冻保存用于将来使用。所有的样品都在知情同意后获得，采用与赫尔辛基宣言一致的明尼苏达大学研究中人受试者使用委员会(the Committeeon the Use of Human Subjects in Research at the University of Minnesota)批准的原则。

细胞系

将HL-60，一种CD33⁺人急性早幼粒细胞白血病细胞系(ATCC,Manassas,VA)，在补加了20％FBS(Gibco-Invitrogen)、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的Iscove培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中于37℃和5％CO₂下培养。将对照人结直肠癌细胞系HT-29(ATCC)在补加了10％FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的杜氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM))和高葡萄糖(Invitrogen,Carlsbad,CA)中于37℃和5％CO₂下培养。

BiKE和TriKE的构建、表达和纯化

编码161533(SEQ ID NO:1)的杂交多核苷酸采用DNA改组(DNA shuffling)和DNA连接技术(Vallera等,2013Cancer Biother Radiopharm 4:274-482；Vallera等,2009.Leuk Res33(9):1233-1242)合成。每个scFv的V_L和V_H的编码区通过编码G4S接头的片段连接。在其最终配置中，该161533NcoI/XhoI多核苷酸具有起始密码子，其次是抗人CD16scFv(McCall et al.,1999.Mol Immunol.7:433-445)的编码区、20个氨基酸的侧翼多肽(PSGQAGAAASESLFVSNHAY；SEQ ID NO:3)、人IL-15N72D、7个氨基酸侧翼多肽(EASGGPE；SEQID NO:4)，然后是抗CD33scFv的编码区。将该多核苷酸拼接进pET28c表达载体，并表达包涵体。使用DNA测序分析(Biomedical Genomics Center,University of Minnesota)来核实该多核苷酸在序列中正确并且为同框克隆。

将该相同的组分用于构建编码163315(SEQ ID NO:7)的杂交多核苷酸，只是组分的顺序为CD16scFv、侧翼多肽PSGQAGAAASESLFVSNHAY(SEQ ID NO:3)、抗CD33scFv、侧翼多肽EASGGPE(SEQ ID NO:4)，然后是人IL-15。

将质粒转化进大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)(EMD,Madison WI)。在37℃和摇动下，让细菌在2L烧瓶内补加了100μg/ml卡那霉素的600ml Luria肉汤中生长。通过添加异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,FisherBiotech Fair Lawn,NJ)诱导杂交多核苷酸的表达。诱导2小时后，通过离心收集细菌。悬浮细胞沉淀物并采用polytron匀浆机匀浆。在超声和离心后，用0.3％脱氧胆酸钠、5％Triton X-100、10％甘油、50mM Tris、50mM NaCl、5mM EDTA，pH 8.0抽提该沉淀物，并充分洗涤包涵体以除去内毒素。

采用从之前报道的用于分离scFv的操作改进的N-月桂酰肌氨酸钠(SLS)空气氧化法重折叠蛋白(Vallera等,2005.Leuk Res 29(3):331-341)。采用超过4个柱体积的20mMTris-HCl，

pH 9.0中从0.2M至0.5M NaCl的分级梯度，通过FPLC离子交换色谱(Q SepharoseFast Flow,Sigma,St.Louis,MO)纯化重折叠的161533。

流式细胞术

用以下的针对：PE-Cy7缀合的CD56(HCD56；BioLegend,Inc.,San Diego,CA)、ECD/PE-CF594缀合的CD3(UCHT1；Beckman Coulter,Brea,CA)、APC-Cy7缀合的CD16(3G8；BioLegend,Inc.)、太平洋蓝(pacific blue)缀合的CD45(HI30；BioLegend,Inc.)、PerCP-Cy5.5/FITC缀合的抗人CD107a(LAMP-1)(H4A3；BioLegend,Inc.)、太平洋蓝/BV421缀合的抗人IFN-γ(4S.B3；BioLegend,Inc.)、FITC/Alexa Fluor 647缀合的TNF-α(MAb11；

BioLegend,Inc.)、FITC/PE缀合的CD33(P67.6；BD Biosciences)，以及APC缀合的CD45(HI30；BioLegend,Inc.)、FITC缀合的EpCAM；(BioLegend,Inc.)的荧光标记单克隆抗体(mAb)对细胞免疫分型。在LSRII(BD Biosciences)上进行细胞的表型获取，并用FlowJo软件(Tree Star Inc.,Ashland,OR)分析。

CD107a和IFNγ/TNFα功能性流式测定

将移植后患者PBMC或原发性AML母细胞解冻并置于RPMI-10中过夜。第二晚，将PBMC与50nM 1633 BiKE或161533 TriKE一起温育。第二天早上洗涤细胞，并添加另一轮的50nM 1633 BiKE或161533 TriKE以处理任何可能的与分子内化有关的事件。随后立即添加HL-60靶或原发性AML母细胞，以产生5:1的效应细胞与靶的比例。让PBMC、HL-60靶或原发性AML母细胞和BiKE或TriKE分子共培养4小时，按之前描述的评价CD107a表达和细胞内IFN-γ和TNF-α的产生(Vallera等,2013Cancer Biother Radiopharm 4:274-282)。

增殖测定

按照制造商的方法，用CELLTRACE Violet Cell Proliferation Dye(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)标记来自移植后患者(100天或较早[20-44天])的PBMC，以5:1(E:T)比例将它们置于含有HL-60靶细胞的培养基中，并用50nM 1633 BiKE或161533TriKE处理。7天后收集细胞，并通过Live/Dead染色分析活力，通过NK细胞(CD56⁺CD3^-)群中CELLTRACE稀释度分析增殖。

51-铬释放细胞毒性测定

通过4小时⁵¹Cr-释放测定评价细胞毒性。简而言之，将经1633 BiKE(10μg/mL)、scFvCD16对照试剂(10μg/mL)或无试剂处理的来自正常供体的静息PBMC与⁵¹Cr标记的HL-60靶以不同E:T比例共培养4小时。对于移植后研究，在50nM 1633 BiKE或50nM 161533TriKE存在下，让PBMC细胞与HL-60靶以20:1(E:T)的比例一起。通过γ闪烁计数器(PerkinElmer,Walthman,MA)测量⁵¹Cr释放，并确定特异的靶溶解(Vallera等,2013.CancerBiother Radiopharm 4:274-282)。

体内小鼠研究和成像

用275cGy调理NSG小鼠(n＝5/组)，并用S4传代培养的0.75×10⁵HL-60-luc IV注射，用于肿瘤侵袭。在第3天开始药物处理。单疗程的处理由腹膜内(IP)注射20μg的药物，每天给予一次持续一周(MTWThF)构成，小鼠被处理3周。对照组不接受NK细胞，而1633 BiKE和161533 TriKE组在注射HL-60-luc细胞后3天接受1×10⁶NK细胞(从CD3/CD19磁耗尽产物计算的)。该HL-60-luc细胞含有荧光素酶报告基因，使得能够每周对小鼠成像以确定它们的生物发光活性并监测癌症白血病进展，如之前所描述的(Waldron等,2011.Mol CancerTher 10(10):1829-1838)。简而言之，在成像前10分钟向小鼠注射30mg/ml荧光素底物，然后通过吸入异氟醚气体麻醉。接着采用Xenogen Ivis 100成像系统对小鼠成像，用LivingImage 2.5软件(Xenogen Corporation,Hopkington MA)分析。在第20天，对全部动物取血，暴露2分钟，用于目的区域(ROI)的单位表示为光子数/sec/cm2/sr。通过流式细胞术分析血液的人CD45⁺CD56⁺CD3^-NK细胞的存在。进行另一实验以核实数据的可重复性。

统计分析

分组的数据表示为均值±均值标准误(SEM)。两组之间的差异通过Student t检验分析。多重比较通过带有Tukey校正的配对单因素ANOVA进行分析。在Graphpad Prism软件中进行分析。

实施例2

1615EpCAM TriKE的构建

采用DNA改组和连接技术完成编码1615EpCAM TriKE(SEQ ID NO:8)的杂交多核苷酸的合成和组装。从5末端至3’末端，完全组装的1615EpCAM多核苷酸具有NcoI限制性位点；ATG起始密码子；编码衍生自McCall等(Mol Immunol.,1999,36:433-445)产生的噬菌体展示库的人CD16(NM3E2)的V_H和V_L区的编码区，20个氨基酸的节段(PSGQAGAAASESLFVSNHAY；SEQ ID NO:3)，经修饰的IL-15N72D，7氨基酸接头(EASGGPE；SEQ ID NO:4)，以及来自抗体MOC-31的人源化抗EPCAM scFv；以及最后的XhoI限制性位点。将所得的1914bp NcoI/XhoI多核苷酸拼接进pET21c表达载体，处于异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导型T7启动子的控制下。使用DNA测序分析(Biomedical Genomics Center,University ofMinnesota,MN,USA)来核实该多核苷酸在序列中正确并且为同框克隆。本研究中使用的其它构建体以类似方式生成，但包括用于单特异性抗CD16 scFv和抗EpCAM scFv的编码区。

包涵体分离

通过质粒转化用大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen,Madison,WI,USA)进行细菌蛋白表达。在过夜培养后，让细菌在800ml含有50mg/ml卡那霉素的Luria肉汤中生长。当培养基达到0.65的光密度(OD)600时，通过添加IPTG(FischerBiotech,Fair Lawn,NJ,USA)发生基因表达的诱导。诱导后2小时，收集细菌(从5升培养基分离了43g细菌沉淀物)。接着，将细胞沉淀物在缓冲溶液(50mM Tris,50mM NaCl,和5mM EDTA pH 8.0)中匀浆、超声并离心。用0.3％脱氧胆酸钠、5％Triton X-100、10％甘油、50mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、5mmol/LEDTA(pH 8.0)提取沉淀物，并洗涤(最终沉淀物重量:12.5g)。

重折叠和纯化

按之前描述的进行重折叠和纯化(Schmohl等,2016.Target Oncol.11(3):353-361)。简而言之，为了重折叠，将来自包涵体(IB)的蛋白以20:1(mg湿重/mL)溶解在增溶缓冲液(solubilization buffer)(7M盐酸胍、50mM Tris、50mM NaCl、5mM EDTA和50mM DTT，

pH 8.0)中。在37℃温育1小时后，通过离心去除沉淀物。在4℃下用重折叠缓冲液(50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.8mM L-精氨酸、20％甘油、5mM EDTA和1mM GSSG，pH 8.0)稀释上清液2天。通过在20mM Tris-HCl,pH 9.0中进行超过4个柱体积的针对20mM Tris-HCl，pH 9.0的10倍透析以除去该缓冲液。进行SDS-PAGE分析以评价纯度。用Simply Blue lifeStain(Invitrogen,Carlsbad,CA)对融合蛋白染色。该TriKE的大小为约68860Da。

NK细胞分离和纯化

将histopaque梯度(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和SEPMATE管(StemcellTechnologies,Inc.,Vancouver,Canada)用于从健康志愿者的成人血(Memorial BloodCenter,Minneapolis,MN,USA)分离外周血单核细胞(PBMC)，并按照制造商的方法(Stemcell Technologies,Inc.,Vancouver,Canada)采用磁珠通过阴性选择获得富集的NK细胞。在知情同意后，根据明尼苏达大学人受试者审查委员会(human subjectsInstitutional Review Board)和赫尔辛基宣言，获得样品。

组织培养

以下的细胞系从美国典型培养物保藏中心获得：乳腺癌细胞系BT-474、SK-BR-3；前列腺癌细胞系PC-3、DU145；头颈癌细胞系UMSCC-11B、NA；卵巢癌细胞系SKOV-1；结肠癌细胞系HT-29；肺癌细胞系Calu-3；伯基特淋巴瘤细胞系Daudi；急性髓系白血病细胞系HL-60；人胶质母细胞瘤细胞系U87。癌和胶质母细胞瘤细胞系采用组织培养瓶单层生长(Fogh等,1977.J Natl Cancer Inst 59:221-226)，HL-60和Daudi细胞系(Klein等,1968.CancerRes 28:1300-1310)在悬浮液中生长。将细胞维持在补加了10％胎牛血清和2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI 1640(BT-474、SK-BR-3、PC-3、DU-145、HT-29、Daudi、HL60、Calu-3)或DMEM(UMSCC-11B、NA、SK-OV-3、U87)中。除了前述的补加物，BT-474培养基含有10IU/mL胰岛素。让细胞温育在加湿的含有5％CO₂的恒定37℃空气中。当细胞90％汇合时，使用胰蛋白酶-EDTA解离将它们传代。采用标准血细胞计数器进行细胞计数。仅细胞活力>95％(如通过台盼蓝排除(trypan blue exclusion)确定的)被用于实验。

结合/阻断测定

为了评价结合，洗涤4×10⁵个各种癌细胞(BT-474、PC-3、UMSCC-11B、Calu-3、Daudi、U87)，将它们在4℃与10nM异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗EpCAM scFv一起温育30分钟。对于阻断测定，将200nM FITC标记的1615EpCAM TriKE添加至500nM的抗EpCAM scFv或抗CD22-CD19scFv构建体，并在4℃与HT-29结肠癌细胞一起温育30分钟。洗涤后，用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)评价染色强度。

CD107a脱粒测定

按之前的报道(Gleason等,2012.Mol Cancer Ther 11:2674-2684)，进行通过CD107a表达和IFN-γ的存在来测量细胞溶解性脱粒的流式细胞术测定。将PBMC细胞在补加有10％胎牛血清、重组IL-12 10ng/ml(PeproTech,Rocky Hill,NJ)和IL-18 100ng/ml(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN,USA)的RPMI 1640中温育过夜(37℃,5％CO₂)，作为阳性对照。将细胞在1X PBS中洗涤，用30nM 1615EpCAM TriKE或其它药物处理，并在37°C和5％CO₂下温育10分钟。添加FITC缀合的抗人CD107a单克隆抗体(mAb)(LAMP-1)(BD Biosciences,San Jose,CA)，并再与各种靶细胞(BT-474、SK-BR-3、PC-3、DU-145、HT-29、HL60、UMSCC-11B、NA、SK-OV-3)一起温育1小时。添加GolgiStop(1:1500)(BD Biosciences,San Jose,CA)和GolgiPlug(1:1000)(BD Biosciences,San Jose,CA)，并将细胞再温育3小时。将细胞在1X PBS中洗涤，用PE/Cy7缀合的抗CD56mAb、APC/Cy 7缀合的抗CD16 mAb和PE-CF594缀合的抗CD3mAb(BioLegend,Inc.,San Diego,CA)染色，温育15分钟，然后在2％多聚甲醛中固定。然后采用透化缓冲液(permeabilization buffer)(BD Biosciences,San Jose,CA)准备细胞，用于细胞内染色。将细胞与太平洋蓝缀合的抗人IFN-γ(BioLegend,Inc.,SanDiego,CA)一起温育，洗涤，并采用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA)通过FACS评价。为了补偿，使用CompBead Plus Anti-Mouse Ig,κ/Negative Control(BSA)Compensation Plus(7.5μm)颗粒(BD Biosciences,San Jose,CA)。

铬-51释放细胞毒性测定

在37℃和5％CO₂下，用1μCi的⁵¹Cr/1×10⁵个靶细胞标记HT-29靶细胞1小时。进行洗涤操作以除去过量的⁵¹Cr。将标记的靶细胞添加至96孔圆底板的孔(5×10³个细胞)中。向板添加经1615EpCAM TriKE、EpCAM16BiKE或阴性对照处理的静息效应NK细胞。E:T比例在20:1和0.08:1的范围。对应于靶细胞死亡的所释放的⁵¹Cr的量通过γ闪烁计数器测量，并如下计算靶细胞溶解百分比：[(实验溶解-自发溶解)/(最大溶解-自发溶解)]×100。为了确定最大溶解，用3％Triton X处理⁵¹Cr标记的靶细胞4小时。

Luminex

为了分析趋化因子和细胞因子，在37℃和5％CO₂下，将来自6个健康志愿者的纯化NK细胞在96孔板中与2:1E:T比例的HT-29结肠癌细胞以及浓度50nM的各种药物一起温育24小时。在24小时温育时间后，离心细胞并收集上清液，在-80℃保存，直至被分析。采用Luminex系统(MAGPIX,Luminex,Austin,TX)分析GM-CSF、IL-6、IL-8和TNF-α(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)。数值代表pg/ml，并通过使用Xponent 4.2软件(Luminex,Austin,TX)从重组人蛋白的标准曲线进行内插。

增殖和活力测定

用CELLTRACE Violet Cell Proliferation Dye(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)按照制造商的方法标记来自健康供体的PBMC或富集的NK细胞。标记后，用50nM浓度的各种药物培养细胞。在7天后收集细胞，用Live/Dead试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)进行活力染色，为抗CD56PE/Cy7(BioLegend,Inc.,San Diego,CA,USA)和抗CD3PE-CF594(BD Biosciences,San Jose,CA)表面染色，以对活的CD3^-CD56⁺群设定门值。用FlowJo软件版本7.6.5.(FlowJo,LLC,Ashland,OR,USA)分析数据。

统计分析

数据表示为均值+/-标准差。两组之间的差异通过Student t检验或单因素ANOVA分析。分析和数据表示用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)完成。

实施例3

EF91(美洲驼抗人IL16)-IL15-CD33的构建

采用DNA改组和连接技术完成编码TriKE EF91(美洲驼抗人IL16)-IL15-CD33(SEQID NO:14)的杂交多核苷酸的合成和组装。从5末端至3’末端，该完全组装的多核苷酸具有NcoI限制性位点；ATG起始密码子；编码EF91(美洲驼抗人IL16)的V_H和V_L区的编码区，20个氨基酸的节段(PSGQAGAAASESLFVSNHAY；SEQ ID NO:3)，经修饰的IL-15，7氨基酸接头(EASGGPE；SEQ ID NO:4)，以及人源化抗CD33scFv；以及最后的XhoI限制性位点。将所得的NcoI/XhoI多核苷酸拼接进pET21d表达载体，处于异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导型T7启动子的控制下。

实施例4

1615antiHIV的构建

既然1615x为平台技术，则也可能使用与癌症发生相关或不相关的抗病毒scFv。采用DNA改组和连接技术完成编码TriKE 1615antiHIV(SEQ ID NO:19)的杂交多核苷酸的合成和组装。从5末端至3’末端，该完全组装的多核苷酸具有NcoI限制性位点；ATG起始密码子；抗CD16 scFv的V_H和V_L区，20个氨基酸的节段(PSGQAGAAASESLFVSNHAY；SEQ ID NO:3)，经修饰的IL-15，7氨基酸接头(EASGGPE；SEQ ID NO:4)，以及抗HIV scFv；以及最后的XhoI限制性位点。

将本文提及的所有专利、专利申请和出版物以及以电子方式提供的材料(例如，包括例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中氨基酸序列提交，以及GenBank和RefSeq中来自注释编码区域的翻译)的完整公开通过引用以其全文并入。如果本申请的公开与通过引用并入本文的任何文献的公开之间存在任何不一致，则适用本申请的公开。仅出于清楚理解的目的给出了前文的详细说明和实施例。不应从中理解不必要的限制。本发明不限于所示和所描述的精确细节，因为本领域技术人员显而易见的变化将被包括在由权利要求书所定义的发明内。

除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示组分数量、分子量等的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反说明，在说明书和权利要求书中列出的数值参数为近似值，它们可以随本发明所寻求获得的期望性能而变化。最起码，并且并非试图将等同原则的应用限于权利要求的范围，每一数值参数应至少按照所报告的有效数以及应用普通舍入法来理解。

尽管陈述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中列出的数值为尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地包含由其各自测量中发现的标准偏差所必然产生的范围。

除非另有说明，所有的标题都是为了方便阅读者，而不应用于限制该标题后文本的含义。

序列表自由文本

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:3

PSGQAGAAAS ESLFVSNHAYSEQ ID NO:4

EASGGPE

SEQ ID NO:5

SEQ ID NO:6

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:8

SEQ ID NO:9

SEQ ID NO:10

SEQ ID NO:11

SEQ ID NO:12

SEQ ID NO:13

SEQ ID NO:14

SEQ ID NO:15

SEQ ID NO:16

SEQ ID NO:17

SEQ ID NO:18

SEQ ID NO:19

SEQ ID NO:20

Claims (69)

1.一种化合物，包括：

NK衔接结构域；

可操作地连接至所述NK衔接结构域的NK激活结构域；以及

选择性结合靶细胞并可操作地连接至所述NK激活结构域和所述NK衔接结构域的靶向结构域。

2.权利要求1的化合物，其中所述NK激活结构域包括细胞因子或其片段。

3.权利要求2的化合物，其中所述细胞因子包括IL-15。

4.权利要求3的化合物，其中IL-15的部分包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其功能变体。

5.前述权利要求中任一项的化合物，其中所述NK衔接结构域包括选择性结合NK细胞的模块。

6.权利要求5的化合物，其中所述NK衔接结构域活化NK细胞。

7.权利要求6的化合物，其中所述NK衔接结构域模块选择性结合CD16的一部分。

8.权利要求7的化合物，其中所述CD16包括CD16a。

9.权利要求5的化合物，其中所述NK衔接结构域阻断对NK细胞的抑制。

10.前述权利要求中任一项的化合物，其中所述NK衔接结构域模块包括抗体或其结合片段。

11.权利要求10的化合物，其中所述抗体片段包括scFv、F(ab)₂或Fab。

12.前述权利要求中任一项的化合物，其中所述靶向结构域包括选择性结合肿瘤细胞的模块。

13.权利要求12的化合物，其中所述靶向结构域模块选择性结合CD33的一部分。

14.权利要求12的化合物，其中所述靶向结构域模块选择性结合EpCAM的一部分。

15.权利要求12的化合物，其中所述靶向结构域模块选择性结合CD133、CD20、HER2、CEA、EpCAM、VEGF-A、EGFR、CD33、整合素α_Vβ₃、CD51、CD152、CD125、CTAA16.88、MUC1、CD19、CD22、CD38、间皮素、ROR1、CSPG4、SS1或IGFR1、HIV癌。

16.前述权利要求中任一项的化合物，其中所述靶向结构域包括选择性结合被病毒感染的细胞的模块。

17.权利要求16的化合物，其中所述病毒包括腺病毒、HIC、CMV或HPV。

18.权利要求12至17中任一项的化合物，其中所述靶向结构域模块包括抗体或其片段。

19.权利要求18的化合物，其中所述抗体片段包括scFv。

20.前述权利要求中任一项的化合物，包括连接两个所述结构域的至少一个侧翼序列。

21.权利要求20的化合物，还包括将两个相连的结构域连接至第三结构域的第二侧翼序列。

22.权利要求21的化合物，其中所述侧翼序列位于所述NK激活结构域侧边。

23.权利要求21的化合物，其中第一侧翼序列位于抗NK scFv的C末端，并且其中第二侧翼序列位于抗癌scFv序列的N末端。

24.前述权利要求中任一项的化合物，还包括第二靶向结构域。

25.权利要求1至23中任一项的化合物，还包括第二NK衔接结构域。

26.权利要求1至23中任一项的化合物，还包括第二NK激活结构域。

27.一种化合物，包括：

T细胞衔接结构域；

可操作地连接至所述T细胞衔接结构域的T细胞激活结构域；以及

选择性结合靶细胞并可操作地连接至所述T细胞激活结构域和所述T细胞衔接结构域的靶向结构域。

28.权利要求27的化合物，其中所述T细胞激活结构域包括细胞因子或其片段。

29.权利要求28的化合物，其中所述细胞因子包括IL-2。

30.权利要求29的化合物，其中IL-2包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

31.权利要求27至30中任一项的化合物，其中所述T细胞衔接结构域包括选择性结合T细胞的模块。

32.权利要求31的化合物，其中所述T细胞衔接结构域活化T细胞。

33.权利要求31的化合物，其中所述T细胞衔接结构域模块选择性结合CD3。

34.权利要求31的化合物，其中所述T细胞衔接结构域阻断对T细胞的抑制。

35.权利要求27至34中任一项的化合物，其中所述T细胞衔接结构域模块包括抗体或其结合片段。

36.权利要求35的化合物，其中所述抗体片段包括scFv、F(ab)₂或Fab。

37.权利要求27至36中任一项的化合物，其中所述靶向结构域包括选择性结合肿瘤细胞的模块。

38.权利要求37的化合物，其中所述靶向结构域模块选择性结合肿瘤标志物。

39.权利要求38的化合物，其中所述肿瘤标志物为CD133、CD20、HERer2、CEA、EpCAM、VEGF-A、EGFR、CD33、整合素αVβ3、CD51、CD152、CD125、CTAA16.88、MUC1、CD19、CD22、CD38、间皮素、ROR1、CSPG4、SS1或IGFR1。

40.权利要求27至39中任一项的化合物，还包括连接两个所述结构域的至少一个侧翼序列。

41.权利要求40的化合物，还包括将两个相连的结构域连接至第三结构域的第二侧翼序列。

42.权利要求41的化合物，其中所述侧翼序列位于所述T细胞衔接结构域侧边。

43.权利要求27至42中任一项的化合物，还包括第二靶向结构域。

44.权利要求27至42中任一项的化合物，还包括第二T细胞衔接结构域。

45.权利要求27至42中任一项的化合物，还包括第二T细胞激活结构域。

46.包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的化合物。

47.包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列的化合物。

48.一种组合物，包括：

前述权利要求中任一项的化合物；以及

药学上可接受的载体。

49.一种方法，包括：

将权利要求1至26中任一项的化合物以有效诱导NK介导的靶细胞杀伤的量施用于受试者。

50.权利要求49的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:1。

51.权利要求49的方法，其中所述靶细胞为癌细胞。

52.一种体内刺激NK细胞扩增的方法，所述方法包括：

以有效刺激受试者内NK细胞扩增的量的权利要求1至26任一项的化合物施用于所述受试者。

53.权利要求52的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

54.一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

以有效治疗所述癌症的量的权利要求1至26中任一项的化合物施用于所述受试者。

55.权利要求54的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

56.权利要求54的方法，其中所述癌症包括前列腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、黑素瘤、肾癌、肾脏的癌症、口腔癌、咽癌、胰腺癌、子宫癌、甲状腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌或造血系统癌症。

57.权利要求54的方法，还包括在化学疗法、手术切除肿瘤或放射疗法之前、同时或之后施用组合物。

58.权利要求57的方法，其中所述化学疗法包括六甲蜜胺、安吖啶、L-天冬酰胺酶、左旋天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡氯芥、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、环形磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多烯紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、福莫司汀、更昔洛韦、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、丝裂霉素C、尼莫司汀、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、甲基苄肼、雷替曲塞、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、托泊替康、长春碱、长春新碱、长春地辛，以及长春瑞滨。

59.一种方法，包括：

将权利要求27至47中任一项的化合物以有效诱导T细胞介导的靶细胞杀伤的量施用于受试者。

60.权利要求59的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:13。

61.权利要求59的方法，其中所述靶细胞为癌细胞。

62.一种体内刺激T细胞扩增的方法，所述方法包括：

以有效刺激受试者内T细胞扩增的量的权利要求27至47中任一项的化合物施用于所述受试者。

63.权利要求62的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

64.一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

以有效治疗所述癌症的量的权利要求27至47中任一项的化合物施用于所述受试者。

65.权利要求64的方法，其中所述化合物包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

66.权利要求64的方法，其中所述癌症包括前列腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、黑素瘤、肾癌、肾脏的癌症、口腔癌、咽癌、胰腺癌、子宫癌、甲状腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌或造血系统癌症。

67.权利要求64的方法，还包括在化学疗法、手术切除肿瘤或放射疗法之前、同时或之后施用组合物。

68.权利要求67的方法，其中所述化学疗法包括六甲蜜胺、安吖啶、L-天冬酰胺酶、左旋天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡氯芥、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、环形磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多烯紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、福莫司汀、更昔洛韦、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、丝裂霉素C、尼莫司汀、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、甲基苄肼、雷替曲塞、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、托泊替康、长春碱、长春新碱、长春地辛，以及长春瑞滨。

69.权利要求4的化合物，其中所述IL-15功能变体与SEQ ID NO:15相比包括N72D或N72A氨基酸替换。