JP2022549494A - ウイルス抗原に結合するｎｋエンゲージャー化合物および使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、ＮＫ細胞にエンゲージングする化合物、および前記化合物の使用方法を記載する。全体として、前記化合物は、ＮＫエンゲージングドメインと、標的細胞に選択的に結合するターゲティングドメインと、前記ＮＫエンゲージングドメインおよび前記ターゲティングドメインを作動可能に連結するＮＫ活性化ドメインとを含む。例示的な実施形態では、前記ターゲティングドメインは、ＨＩＶ抗原に選択的に結合する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月２６日に出願された米国特許出願第６２／９０６，６６０号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

政府支援の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与されたＣＡ１１１４１２およびＣＡ０６５４９３の下、ならびに米国国立がん研究所によって付与されたＣＡ０３６７２５、ＣＡ０７２６６９、ＣＡ０７７５９８およびＣＡ１９７２９２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

配列表の組み込み
添付の配列表の資料は、参照により本出願に組み込まれる。添付の配列表テキストファイル、名称ＧＴＢＩＯ２１３０＿１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔは、２０２０年９月２５日に作成され、９６ｋｂである。ファイルには、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用しているコンピュータのＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセス可能である。

背景情報
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫監視が可能な先天性免疫系の細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合しかつ抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する活性化受容体であるＣＤ１６を発現する。ＮＫ細胞はＩＬ－１５によって調節される。ＩＬ－１５は、抗原依存性細胞傷害、リンホカイン活性化キラー活性の増加を誘導し、および／またはサイトカイン応答を媒介することができる。ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞に基づく免疫療法としてがんおよび感染症を治療するために免疫応答を刺激するように活性化されることができる。

抗レトロウイルス薬の有効性および使用の進歩は、ＨＩＶ感染者の健康および寿命を実質的に改善したが、これらの薬物は、ＡＩＤＳへの進行を防止し、ウイルスのさらなる伝播を制限するための一時しのぎに過ぎない。ＨＩＶの複製を抑制するために抗ウイルス剤を使用したにもかかわらず、感染者は、ＨＩＶに潜伏感染した細胞のリザーバーを保持しており、抗レトロウイルス療法を中止すると、活性感染を再活性化し、再確立する可能性がある。治癒的解決策は、これらの潜伏感染した細胞の再活性化およびその後の破壊を必要とする。ＨＩＶ感染に対する抗体応答は、存在しているが、ウイルスの変異率が高く、生成された抗体によって認識されるエピトープを迅速に排除することができるため、一般に効果がない。しかしながら、近年、強い中和作用を有するが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する能力が低い様々なＨＩＶ特異的抗体が、感染者において同定されている。

本発明は、がんおよびウイルス感染症を治療するために免疫応答を刺激するようにＮＫ細胞を活性化するための化合物を提供する。本発明者らは、ＩＬ－１５分子によって連結されたＣＤ１６エンゲージャーから構成される二重および三重特異的キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥ（商標））を設計した。本明細書で使用される場合、本発明の化合物は、１６／１５／Ｘ ＴｒｉＫＥと称される場合があり、Ｘはターゲティングドメインを表す。Ｘターゲティングドメインは、例として、ウイルス抗原、がん細胞抗原などを対象とし得る。

特定の実施形態では、抗体コンストラクトは、これらの抗体の広特異性を利用してＨＩＶを標的とすると同時に、膜に発現したＥｎｖのその認識を介してＮＫ細胞の殺傷を活発に複製している感染細胞に特異的にリダイレクトし、低親和性Ｆｃ受容体、ＣＤ１６を介してＮＫ細胞の脱顆粒化を引き起こすように構築された。リンカーとしてのＩＬ－１５の付加は、ＮＫ細胞をさらに活性化し、それによって、それらの応答を増強させる。ＩＬ－１５は、潜伏感染細胞の潜在的な再活性化因子（ｒｅａｃｔｉｖａｔｏｒ）としても同定されている。初期研究は、本発明のＨＩＶ特異的コンストラクトとインキュベートしたときに、ＮＫ細胞サイトカイン産生およびＨＩＶ－Ｅｎｖを発現する感染標的の殺傷が増強されたことを示している。

一実施形態では、本発明は、ＣＤ１６またはＮＫＧ２ｃに選択的に結合する部分を含むＮＫエンゲージングドメインと、ＩＬ－１５またはその機能的断片を含む、ＮＫエンゲージングドメインに作動可能に連結されたＮＫ活性化ドメインと、ウイルス抗原に選択的に結合し、ＮＫ活性化ドメインおよびＮＫエンゲージングドメインに作動可能に連結されている、ターゲティングドメインとを含む、化合物を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａである。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、感染細胞上に存在する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ由来である。いくつかの実施形態では、ＮＫエンゲージングドメイン部分は、抗体もしくはその結合断片、またはナノボディを含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む。いくつかの実施形態では、抗体もしくはその結合断片、またはナノボディは、ヒトのものである。いくつかの実施形態では、抗体もしくはその結合断片、またはナノボディは、ラクダ科動物のものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５の機能的変異体は、配列番号４と比較して、Ｎ７２ＤまたはＮ７２Ａアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメイン部分は、抗体、もしくはその結合断片、またはナノボディを含む。いくつかの実施形態では、抗体結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインはＣＤ１６を含み、ＮＫ活性化ドメインはＩＬ－１５を含み、ターゲティングドメインは、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインはＣＤ１６ａを含み、ＮＫ活性化ドメインはＩＬ－１５を含み、ターゲティングドメインは、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインはＮＫＧ２ｃを含み、ＮＫ活性化ドメインはＩＬ－１５を含み、ターゲティングドメインは、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、ドメインのうちの２つを連結する少なくとも１つの隣接配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、連結された２つのドメインを第３のドメインと連結する第２の隣接配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、隣接配列は、ＮＫ活性化ドメインに隣接する。いくつかの実施形態では、第１の隣接配列は、ＮＫエンゲージングドメインに対してＣ末端側にあり、第２の隣接配列は、抗ウイルスターゲティングドメインに対してＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、第２のターゲティングドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、第２のＮＫエンゲージングドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、第２のＮＫ活性化ドメインをさらに含む。

本明細書に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む、組成物も提供される。

さらに、いくつかの実施形態では、標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量で、本明細書に記載の化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ウイルスに感染している。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶである。

いくつかの実施形態では、インビボでのＮＫ細胞の増大を刺激するための方法が提供され、本方法は対象におけるＮＫ細胞の増大を刺激するのに有効な量の本明細書に記載の化合物を、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ウイルスに感染している。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスである。一態様では、ウイルスはＨＩＶである。

いくつかの実施形態では、対象におけるウイルス感染症を治療する方法が本明細書で提供され、本方法は、ウイルス感染症を治療するのに有効な量の本明細書に記載の化合物を、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスに感染している。一実施形態では、対象はＨＩＶに感染している。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３に選択的に結合する部分を有するＴ細胞エンゲージングドメインと、ＩＬ－２ファミリーまたはその機能的断片のサイトカインを含む、Ｔ細胞エンゲージングドメインに作動可能に連結されたＴ細胞活性化ドメインと、ウイルス抗原に選択的に結合し、Ｔ細胞活性化ドメインおよびＴ細胞エンゲージングドメインに作動可能に連結されている、ターゲティングドメインとを含む化合物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、感染細胞上に存在する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ由来である。

いくつかの実施形態では、標的細胞のＴ細胞媒介性殺傷を誘導するのに有効な量で、本明細書に記載の化合物を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ウイルスに感染している。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスである。一実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶであり、標的は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質（例えば、ｇｐ１２０）である。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の増大をインビボで刺激する方法が本明細書で提供され、本方法は、対象におけるＴ細胞の増大を刺激するのに有効な量の本明細書に記載の化合物を、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ウイルスに感染している。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶである。

一実施形態では、本発明は、中皮腫を治療する方法であって、メソセリンを発現する標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量で、配列番号３３の標的ドメインを含む配列番号３２または３６のアミノ酸配列を含む化合物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、（ｉ）免疫グロブリン重鎖を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチドと、免疫グロブリン軽鎖を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチドとを、哺乳動物細胞にコトランスフェクションすること、および（ｉｉ）哺乳動物細胞から上清を収集することを含む、本明細書に記載の化合物を作製する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ由来である。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、Ｅｎｖである。例えば、抗ＨＩＶ抗体の軽鎖および重鎖は、それぞれ、配列番号２１および２２、３１および３０、２６および２５、ならびに４０および３９を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードする単離されたＤＮＡ配列が本明細書で提供される。

本発明はまた、本明細書に記載されるＴｒｉＫＥ化合物を含む、薬学的組成物を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容される担体中に配列番号５、７、２４、２９、３２、３４、３６または３７を含む、薬学的組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中に配列番号５、７、２４、２９、３２、３４、３６または３７を含む薬学的組成物を投与することによる、対象を治療する方法を提供する。

一実施形態では、本開示は、本発明の化合物を作製する方法を提供し、前記方法は、配列番号２２、２５、３０または３９の免疫グロブリン重鎖を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドと、配列番号２１、２６、３１または４０の免疫グロブリン軽鎖を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドとをそれぞれ、哺乳動物細胞にコトランスフェクションすること、および、哺乳動物細胞から上清を収集することを含み、得られた化合物は、ウイルス抗原に結合する。一態様では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ抗原である。

一態様では、本発明は、配列番号２１、２２、２５、２６、３０、３１、３９、または４０のアミノ酸配列をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体中に配列番号５、７、２４、２９、３２、３４、３６および３７を含む、薬学的組成物を提供する。さらなる態様では、本発明は、対象を治療する方法であって、薬学的に許容される担体中に配列番号５、７、２４、２９、３２、３４、３６および３７を含む薬学的組成物を、対象に投与することを含む、方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、ＡＩＤＳを有するかまたはＡＩＤＳを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、配列番号５、７、２４、２９、および３７を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

本発明の上記の概要は、開示された各実施形態または本発明のあらゆる実施態様を記載することを意図するものではない。以下の説明は、より具体的に例示的な実施形態を示す。本出願の全体のいくつかの場所において、実施例のリストを通じてガイダンスが提供され、これらの例を様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合においても、列挙されたリストは、代表的なグループとしてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

ＣＤ１６ナノボディは、公開されているラマナノボディ（ＧｅｎｅＢａｎｋ配列ＥＦ５６１２９１）に由来するものであった。ＣＤ１６ナノボディをＣＤ１９にスプライシングして、このＣＤ１６エンゲージャーがＮＫ細胞の殺傷を駆動する能力を試験した。（Ａ）ＣＤ１６ナノボディは、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ標的を用いたクロムリリースアッセイにおいて、リツキシマブ媒介性殺傷と同様の細胞溶解性ＮＫ活性を示した。 ＣＤ１６ナノボディは、公開されているラマナノボディ（ＧｅｎｅＢａｎｋ配列ＥＦ５６１２９１）に由来するものであった。ＣＤ１６ナノボディをＣＤ１９にスプライシングして、このＣＤ１６エンゲージャーがＮＫ細胞の殺傷を駆動する能力を試験した。（Ｂ）ＣＤ１６ ＣＤＲを、ヒト化ＣＤ１６エンゲージャーであるＨｕＥＦ９１を生成するために、ヒト化ラクダ科動物足場にクローニングした。ＨｕＥＦ９１結合は、ＣＤ１６ｓｃＦｖ結合と同等であり、ヒト化ＨｕＥＦ９１が分子の特異性を妨げなかったことを示した。 ＣＤ１６ナノボディは、公開されているラマナノボディ（ＧｅｎｅＢａｎｋ配列ＥＦ５６１２９１）に由来するものであった。ＣＤ１６ナノボディをＣＤ１９にスプライシングして、このＣＤ１６エンゲージャーがＮＫ細胞の殺傷を駆動する能力を試験した。（Ｃ）ラマ１６１５３３ ＴｒｉＫＥ（配列番号３）は、ＮＫ細胞を増大させることができる。 ＣＡＭ１６１５ＰＧＴ１２１（配列番号６～７）のマップ。 ＣＡＭ１６１５ＰＧＴ１２１ヌクレオチド配列（配列番号６）。図４にさらに示されるように、小文字および大文字は、核酸配列のドメイン構造を示すために使用される。 ＣＡＭ１６１５ＰＧＴ１２１ヌクレオチド配列（配列番号６）のＣＡＭ１６、ｈｍａリンカー、ＩＬ１５ ＷＴ、ＥＡＳＧＧＰＥリンカー、ＰＧＴ１２１、および終止配列。小文字および大文字は、核酸配列のドメイン構造を示すために使用される。 ＣＡＭ１６１５ＰＧＴ１２１アミノ酸配列（配列番号７）。ＰＧＴ１２１アミノ酸配列（配列番号８）を示す。 ２つのプラスミドを哺乳動物細胞にコトランスフェクションし、Ｆａｂベースの抗体を産生した。ヒト化ラクダ科動物抗ＣＤ１６を含むプラスミド１から生成されたタンパク質のアミノ酸配列。（配列番号１６、１７）。 ２Ａ自己切断ペプチドを使用して、単一のプラスミドから発現された２つのタンパク質の配列。（配列番号１９）。 ＣＡＭ１６＿ＩＬ１５＿１２Ａ１２ｓｃＦｖ（ＨＩＶ ＴｒｉＫＥ）のアミノ酸配列（配列番号３７～４０）。 ＣＡＭ１６＿ＩＬ１５＿ＶＬＣ０１＿ｓｃＦＶ＿ＴｒｉＫＥのアミノ酸配列（配列番号２４）。 ＣＡＭ１６＿ＩＬ１５＿１０Ｅ８＿ｓｃＦＶ＿ＴｒｉＫＥのアミノ酸配列（配列番号２９）。 ＨＩＶ特異的ＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥの構造および機能。図１１（Ａ）は、ＨＩＶ広域中和抗体（ｂｎＡｂ）ＶＲＣ０１に由来するＦａｂに連結された抗ＣＤ１６短鎖可変断片から構成される最初の二重特異的ＨＩＶターゲティングコンストラクトの構成要素の起源を示す概略図である。 ＨＩＶ特異的ＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥの構造および機能。図１１（Ｂ）ＨＩＶ二重特異的および三重特異的キラーエンゲージャー（それぞれＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥ）の概略および提案された機能。 ＨＩＶ－Ｅｎｖ特異的ＢｉＫＥは、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞、ＨＩＶ感染細胞株に結合し、ＨＩＶ特異的ＮＫ細胞応答を誘導する。図１２（Ａ）健常なドナー精製末梢血ＮＫ細胞を、ＣＤ１６、ストレプトアビジン対照、またはＨｉｓタグ付きＢｉＫＥについて、ビオチン化抗Ｈｉｓおよび蛍光色素コンジュゲートストレプトアビジンで染色した。ＢｉＫＥは、ＣＤ１６発現を反映するＮＫ細胞に結合する。 ＨＩＶ－Ｅｎｖ特異的ＢｉＫＥは、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞、ＨＩＶ感染細胞株に結合し、ＨＩＶ特異的ＮＫ細胞応答を誘導する。図１２（Ｂ）未感染のＣＤ４発現ＨｅＬａ細胞またはＨＩＶに感染したＨｅＬａ－ＣＤ４をＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥで染色した。ＢｉＫＥは、感染したＨｅＬａ－ＣＤ４に特異的に結合したが、未感染のＨｅＬａ－ＣＤ４には結合せず、ＨＩＶエンベロープを発現する細胞に対するＢｉＫＥの特異性を示した。 ＨＩＶ－Ｅｎｖ特異的ＢｉＫＥは、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞、ＨＩＶ感染細胞株に結合し、ＨＩＶ特異的ＮＫ細胞応答を誘導する。図１２（Ｃ）精製された健常なドナーＮＫ細胞を、ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥありもしくはなしで、感染または未感染のＨｅＬａ－ＣＤ４細胞とともにインキュベートした。リツキシン（Ｒｉｔｕｘｉｎ）を有するＫ５６２細胞およびＲａｊｉを対照として使用した。 ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥは、初感染Ｔ細胞株に特異的に結合し、ＮＫ細胞の殺傷を媒介する。図１３（Ａ）２つのＨＩＶに感染したＴ細胞株、Ｈ９ ＨＩＶ－ＩＩＩＢおよびＡＣＨ－２、またはそれらの未感染対応物、Ｈ９およびＣＥＭ ＣＤ４を、ＨＩＶキャプシドタンパク質について細胞内染色して、活性なＨＩＶ複製を確認した。 ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥは、初感染Ｔ細胞株に特異的に結合し、ＮＫ細胞の殺傷を媒介する。図１３（Ｂ）同じ感染および未感染のＴ細胞株を、Ｈｉｓタグ付きＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥおよびビオチン化抗Ｈｉｓ＋ストレプトアビジンで、または二次のみで染色した。ＢｉＫＥは、未感染Ｔ細胞株への結合を示さなかったが、両方の感染クローンに結合し、活性な感染Ｔ細胞に対する特異性を示した。 ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥは、初感染Ｔ細胞株に特異的に結合し、ＮＫ細胞の殺傷を媒介する。図１３（Ｃ）健常なドナーからの精製されたＮＫ細胞を、ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥありもしくはなしで、未感染のまたはＨＩＶ感染Ｔ細胞株と共培養し、ＮＫ脱顆粒化（ＣＤ１０７ａ）およびＩＦＮγ産生について評価した。 図１４Ａ～１４Ｃ。ＩＬ－１５含有ＨＩＶ－ＴｒｉＫＥは、免疫サブセットを活性化し、潜伏感染した初代細胞株およびＴ細胞株においてウイルス転写を誘導する。（Ａ）末梢血単核細胞を、等モルのｒｈＩＬ－１５またはＩＬ－１５含有ＨＩＶ－ＴｒｉＫＥとともに１６時間インキュベートした。ＮＫおよびＴ細胞サブセットを、ＣＤ６９発現による活性化についてフローサイトメトリーによって評価した。図１４（Ｂ）潜伏感染したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞株、ＡＣＨ－２を、１０ｎＭのＰＭＡ、１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１５、または等モルのＩＬ－１５含有ＴｒｉＫＥの存在下で４８時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＨＩＶ－ｇａｇ（ｐ２４）について細胞内染色した。ＩＬ－１５単独およびＴｒｉＫＥの両方は、ｐ２４発現によって示されるように、著しいウイルス再活性化を誘導した。図１４（Ｃ）精製されたＣＤ４＋記憶Ｔ細胞を、抗レトロウイルス処置されたＨＩＶ感染患者から単離し、ｒｈＩＬ－１５、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト、Ｎａｎｔ－８０３、またはＩＬ－１５含有ＴｒｉＫＥとともに培養した。各状態を、ＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡのありまたはなしで、７２時間インキュベートした。次いで、細胞を採取し、ネステッドＰＣＲ反応を行って、ＨＩＶ ｍＲＮＡを同定した。 いくつかの抗原を介した第２世代のＴｒｉＫＥ分子による固形腫瘍ターゲティング。ＮＣＩ－Ｈ４６０：肺がん（大細胞肺がん）、ＮＣＩ－Ｈ３２２：細気管支肺胞細胞がん（Ｂｒｏｎｃｈｏａｖｅｌｏａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（頸部リンパ節転移）、ＣＳＰＧ４：コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４、ＳＳ１：メソセリン。 図１６Ａ～１６Ｄ。５１クロムリリースアッセイを、いくつかの異なる新しいＴｒｉＫＥを用いて実行し、がん細胞を標的とする任意のｓｃＦｖを、機能的ＴｒｉＫＥにすることができることを示した。（Ａ）ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ１３３＋ＮＧ２＋非小細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ４６０細胞＋ＮＫ細胞を、１６１５ＥＰＣＡＭ１３３ ＴｒｉＫＥまたは１６１５ＮＧ２ ＴｒｉＫＥ（ニューロングリア抗原２またはＣＳＰＧ４）とともにインキュベートした。１６１５ＮＧ２および１６１５ＥｐＣＡＭ１３３の両方は、いくつかの異なるＥ：Ｔ比（２０：１、１０：１、および５：１）で活性を有した。（Ｂ）メソセリン＋ＥｐＣＡＭ－ＣＤ１３３－ＮＧ２ ＭＤＡ－４３５Ａ黒色腫細胞を、１６１５ＥＰＣＡＭ ＴｒｉＫＥまたは１６１５Ｍｅｓｏ ＴｒｉＫＥ（配列番号３６）ＴｒｉＫＥとともにインキュベートした。１６１５Ｍｅｓｏのみが活性を有した。（Ｃ）メソセリン＋ＮＧ２＋卵巣がん細胞（Ｏｖｃａｒ３細胞）を、１６１５ＮＧ２ ＴｒｉＫＥまたは１６１５ＳＳ１ ＴｒｉＫＥとともにインキュベートした。１６１５Ｍｅｓｏおよび１６１５ＮＧ２は活性を有した。（Ｄ）Ｒａｊｉ細胞をＮＫ細胞と培養し、５１Ｃｒリリースアッセイで調べた。ＴｒｉＫＥ １６１５２２１９（配列番号１２）は、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９およびＣＤ２２を同時に標的とする。１６１５２２１９、１６２２１９、およびリツキシマブのみが、ＣＤ２２＋ＣＤ１９＋標的を殺傷した。対照は殺傷しなかった。 配列番号３のＴｒｉＫＥ配列（下線）（ラマ１６１５３３ ＴｒｉＫＥ）。 ＣＡＭ１６１５ＳＳ１（メソセリン）アミノ酸配列（配列番号３２）。下線はＴｒｉＫＥ配列を示す。ＳＳ１（メソセリン）ｓｃＦＶ抗体断片を示す（配列番号３３）。 ＰＧＴ１２１Ｆａｂを、２Ａ自己切断ペプチドを使用して生成した。代替的な実施形態では、例えば、２つのプラスミド系またはＩＲＥＳを使用することができる。 図２０Ａ～２０Ｂ。Ｆａｂベースの抗体を産生するための哺乳動物細胞への２つのプラスミドのコトランスフェクション。２つの別個のプラスミド（プラスミド１およびプラスミド２）を、ＴｒｉＫＥ生成のためにＥｘｐｉ－Ｃｈｏ－Ｓ細胞にコトランスフェクションした。非ヒト化ラクダ科動物抗ＣＤ１６を含むアミノ酸配列を示す。

発明の詳細な説明
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫監視が可能な先天性免疫系の細胞傷害性リンパ球である。細胞傷害性Ｔ細胞と同様に、ＮＫ細胞は、膜透過性およびアポトーシス誘導性グランザイムおよびパーフォリン顆粒の蓄えを送達する。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は抗原プライミングを必要とせず、ＭＨＣ認識の不存在下で活性化受容体にエンゲージングする（ｅｎｇａｇｅ）ことによって標的を認識する。

ＮＫ細胞は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する活性化受容体であるＣＤ１６を発現する。ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５によって調節され、これは、増加した抗原依存性細胞傷害性、リンホカイン活性化キラー活性を誘導し、ならびに／またはインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および／もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）応答を媒介することができる。これらのすべてのＩＬ－１５活性化機能は、がん防御の改善に寄与する。

本開示は、三重特異的キラーエンゲージャー化合物（ＴｒｉＫＥ）であり得る多重特異的治療用化合物を記載する。ＴｒｉＫＥは３つの別個の結合領域を有し、ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ１６）に結合するＮＫ細胞エンゲージングドメイン、サイトカインまたはその機能的断片を含み、そのサイトカインの受容体に結合するＮＫ活性化ドメイン、および標的細胞（例えば、がん細胞）に存在するマーカーに結合するターゲティングドメインである。ＴｒｉＫＥの設計および作製は、例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０２８２３８６号に広く記載されている。ＴｒｉＫＥは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）促進性部分と、増大関連部分（ＩＬ－１５）とを同じ分子上で組み合わせるという利点を提供する。

治療上、ＮＫ細胞の養子移入は、例えば、リンパ枯渇化学療法およびＩＬ－２と組み合わせて、ＮＫ細胞の生存およびインビボ増大を刺激する場合、難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者において寛解を誘導することができる。この療法は、抗原特異性の欠如、ならびにＮＫ細胞増殖および機能を抑制する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のＩＬ－２媒介性誘導によって制限され得る。Ｔｒｅｇ阻害の負の効果を回避しながら、ＮＫ細胞の抗原特異性、増大、および／または持続性を駆動する試薬を生成することは、ＮＫ細胞に基づく免疫療法を増強することができる。

抗レトロウイルス薬の有効性および使用の進歩は、ＨＩＶ感染者の健康および寿命を実質的に改善したが、これらの薬物は、ＡＩＤＳへの進行を防止し、ウイルスのさらなる伝播を制限するための一時しのぎに過ぎない。ＨＩＶの複製を抑制するために抗レトロウイルス剤を使用したにもかかわらず、感染者は、ＨＩＶに潜伏感染した細胞のリザーバーを保持しており、抗レトロウイルス療法を中止すると、活性感染を再活性化し、再確立する可能性がある。治癒的解決策は、これらの潜伏感染した細胞の再活性化およびその後の破壊を必要とする。ＨＩＶ感染に対する抗体応答は、存在しているが、ウイルスの変異率が高く、生成された抗体によって認識されるエピトープを迅速に排除することができるため、一般に効果がない。しかしながら、近年、強い中和作用を有するが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する能力が低い様々なＨＩＶ特異的抗体が、感染者において同定されている。

したがって、本発明は、ＩＬ－１５分子によって連結されたＨＩＶ－Ｅｎｖに対する広域中和抗体（ｂｎＡｂ）に由来する短鎖可変断片と、ＣＤ１６エンゲージャーとからなる、二重および三重特異的ナチュラルキラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥ）を提供することによって、これらの問題に対処する。この三重特異的抗体コンストラクトの目的は、これらの抗体の広特異性を利用してＨＩＶを標的とすると同時に、膜に発現したＥｎｖのその認識を介してＮＫ細胞の殺傷を活発に複製している感染細胞に特異的にリダイレクトし、低親和性Ｆｃ受容体、ＣＤ１６を介してＮＫ細胞の脱顆粒化を引き起こすことである。リンカーとしてのＩＬ－１５の付加は、ＮＫ細胞をさらに活性化し、それによって、それらの応答を増強させる。ＩＬ－１５は、潜伏感染細胞の潜在的な再活性化因子（ｒｅａｃｔｉｖａｔｏｒ）としても同定されている。本発明者らの研究室からの初期研究は、ＨＩＶ特異的コンストラクトとインキュベートしたときに、ＮＫ細胞サイトカイン産生およびＨＩＶ－Ｅｎｖを発現する感染標的の殺傷が増強されたことを示している。ＴｒｉＫＥとインキュベートした健常なドナー由来のＰＢＭＣは、ＮＫ、ＣＤ４およびＣＤ８サブセットにおける免疫細胞活性化の顕著な増加、ならびにＮＫ細胞の増殖を誘導することを示した。さらに、単量体、またはＴｒｉＫＥの一部としてのＩＬ－１５は、インビトロで感染患者から単離された、ＨＩＶに潜伏感染したＴ細胞を再活性化する、能力を示す。

ＡＲＴ治療を受けたＨＩＶ感染患者におけるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａスーパーアゴニスト（Ｎａｎｔ－８０３）の最近の試験でもまた、血清中のウイルスの検出および免疫の活性化がもたらされた。総合して、これらのデータは、ＮＫ細胞がＡＤＣＣを媒介する能力を利用することによって、潜伏感染したリザーバーの再活性化および除去におけるＴｒｉＫＥを含有するＨＩＶ－ｂｎＡｂの役割を示す。

ヒトファージディスプレイライブラリ技術に由来する抗ヒト抗ＣＤ１６ ｓｃＦｖを組み込んだ二重特異的融合物が作製されている（ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：４３３－４４５）。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）受容体を介して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ＣＤ１６受容体を介したシグナル伝達は、カルシウムフラックスおよびＩＴＡＭのリン酸化を誘導し、溶解性顆粒、ならびにインターフェロン（ＩＦＮγ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）などのサイトカインの放出を引き起こす。二重特異的分子は、他の標的分子と併せてＣＤ１６受容体を引き起こすように設計されている（Ｇｌｅａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４（１９）：３０１６－２６）、いわゆる二重特異的キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）である。１つのｓｃＦｖがＮＫ細胞を認識し、第２のｓｃＦｖが腫瘍抗原を認識することにより、ＢｉＫＥは、様々なヒトのがんにおける細胞傷害性殺傷を顕著に増強することができる。１つの例示的なＢｉＫＥは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に対するＣＤ３３および増強されたＮＫ細胞応答を標的とした。ＭＤＳは、末梢血（ＰＢ）血球減少症を伴う正常または過形成性骨髄（ＢＭ）を特徴とするクローン性不均一幹細胞障害であり、ＡＭＬに進行するリスクが高い。

ＮＫ細胞は、例えば、ＮＫ細胞の恒常性、増殖、生存、活性化、および／または発達に関与するＩＬ－１５を含む、様々なサイトカインに応答性である。ＩＬ－１５およびＩＬ－２は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒ□□（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）を含む、いくつかのシグナル伝達構成要素を共有する。ＩＬ－２とは異なり、ＩＬ－１５はＴｒｅｇを刺激せず、免疫応答のＴｒｅｇ阻害を迂回しながらＮＫ細胞の活性化を可能にする。ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の恒常性および増殖を促進することに加えて、移植後の環境で生じ得るＮＫ細胞の機能的欠陥を救うことができる。ＩＬ－１５はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を刺激し、その免疫療法の可能性をさらに高めることができる。加えて、前臨床試験に基づいて、ＩＬ－１５の毒性プロファイルは、低用量ではＩＬ－２よりも好ましい場合がある。

ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の発達恒常性、増殖、生存、および活性化において役割を果たす。ＩＬ－１５およびＩＬ－２は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒ□（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）を含む、いくつかのシグナル伝達構成要素を共有する。ＩＬ－１５はまた、ＮＫ細胞を活性化させ、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後のＮＫ細胞の生着における機能的欠陥を回復させることができる。

本開示は、一態様では、１つ以上のＮＫ細胞エンゲージャードメイン（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ１６＋ＣＤ２、ＣＤ１６＋ＤＮＡＭ、ＣＤ１６＋ＮＫｐ４６）、１つ以上のターゲティングドメイン（例えば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を標的とする）、および１つ以上のサイトカインＮＫ活性化ドメイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、または他のＮＫ細胞増強サイトカイン、ケモカイン、および／または活性化分子）を一般に含み、各ドメインが他のドメインに作動可能に連結されている、三重特異的キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）分子を記載する。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、直接的または間接的な共有結合を指す。したがって、作動可能に連結された２つのドメインは、互いに直接共有結合され得る。逆に、２つの作動可能に連結されたドメインは、介在部分（例えば、および隣接配列）への相互共有結合によって連結されてもよい。２つのドメインは、例えば、それらが、１つ以上の介在する隣接配列の有無にかかわらず、第３のドメインによって分離されている場合、作動可能に連結されているとみなされ得る。例示的な実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインは、ＣＤ１６を対象とし、ＮＫ活性化ドメインは、ＩＬ－１５またはその機能的断片である。

ＮＫエンゲージングドメインは、ＮＫ細胞に結合および／もしくは活性化する任意の部分、ならびに／またはＮＫ細胞の阻害をブロックする任意の部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインは、ＮＫ細胞の表面の構成要素に選択的に結合する抗体を含むことができる。他の実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインは、ＮＫ細胞の表面の構成要素に選択的に結合するリガンドまたは小分子を含むことができる。本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」という用語は、例えば、特定の標的に対する任意の程度で異なる親和性を有するなどの２つ以上の選択肢の間で区別する能力を指す。本明細書で使用される場合、「抗体」は、概して、免疫グロブリンまたはその断片を指し、したがって、モノクローナル抗体、その断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または他の修飾形態）、モノクローナル抗体および／もしくはその断片の組み合わせ、ならびに／またはポリクローナル抗体の組み合わせを包含する。したがって、簡潔にするために、ＮＫ細胞の表面の構成要素に選択的に結合する抗体への言及は、記載された結合特性を示す任意の抗体断片を含む。同様に、ＮＫ細胞の表面の構成要素に選択的に結合するリガンドへの言及は、記載された結合特性を示すリガンドの任意の断片を含む。

いくつかの実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインは、ＮＫ細胞の表面に少なくとも部分的に位置する受容体に選択的に結合することができる。ある特定の実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインは、ＮＫ細胞を結合する機能を果たし得、それによって、ＮＫを、以下でより詳細に記載されるターゲティングドメインが選択的に結合する標的と空間的に近接させることができる。しかしながら、ある特定の実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインは、ＮＫ細胞を活性化する受容体に選択的に結合することができ、したがって、活性化機能も有する。上述したように、ＣＤ１６受容体の活性化は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘発し得る。したがって、ある特定の実施形態では、ＮＫエンゲージングドメインは、ＣＤ１６受容体に選択的に結合するのに有効な抗ＣＤ１６受容体抗体の少なくとも一部を含むことができる。他の実施形態では、ＮＫエンゲージャー細胞ドメインは、ＮＫ細胞を阻害するメカニズムを妨害し得る。

所望の程度のＮＫ選択性、したがって、所望の免疫エンゲージング特性を有するように、ＮＫエンゲージングドメインを設計することができる。例えば、ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）として同定されている。これらの受容体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合し、次いで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害のためにＮＫ細胞を活性化する。抗ＣＤ１６抗体は、ＮＫ細胞に選択的に結合するが、好中球にも結合することができる。抗ＣＤ１６ａ抗体は、ＮＫ細胞に選択的に結合するが、好中球には結合しない。抗ＣＤ１６ａ抗体を含むＮＫエンゲージングドメインを含むＴｒｉＫＥ実施形態は、ＮＫ細胞に結合することができるが、好中球には結合しない。したがって、ＮＫ細胞をエンゲージングさせたいが好中球をエンゲージングさせたくない状況では、抗ＣＤ１６ａ抗体を含むようにＴｒｉＫＥのＮＫエンゲージングドメインを設計することができる。

ＮＫエンゲージングドメインが抗ＣＤ１６受容体ｓｃＦｖを含む様々な実施形態に関して本明細書に記載されるが、ＮＫエンゲージングドメインは、ＣＤ１６受容体に選択的に結合する任意の抗体または他のリガンドを含むことができる。さらに、ＮＫエンゲージングドメインは、例えば、細胞傷害性受容体２Ｂ４、低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＲ－１、および／またはＤＮＡＭ－１などの任意のＮＫ細胞受容体に選択的に結合する抗体またはリガンドを含むことができる。

ターゲティングドメインは、例えば、腫瘍細胞、がん間質中の標的、ＣＤ３３＋である骨髄由来抑制細胞等の阻害細胞上の標的、またはウイルス感染細胞上の標的等の、意図した標的に選択的に結合する任意の部分を含むことができる。

他の実施形態では、ターゲティングドメインは、例えば、アデノウイルス、ＨＩＶ、ＣＭＶ、および／またはＨＰＶなどのウイルスによって感染した細胞上の標的に選択的に結合することができる。本明細書の例示的な例では、ターゲティングドメインは、ＨＩＶエピトープである。

ＮＫ活性化ドメインには、ＮＫ細胞を活性化するか、ＮＫ細胞の持続を促進するか、またはそうでなければ、ＮＫ細胞活性を促進するアミノ酸配列が含まれ得る。ＮＫ活性化ドメインは、ＮＫ細胞を活性化および／または維持することができる１つ以上のサイトカインであり得るか、またはそれに由来することができる。本明細書で使用される場合、「由来する」という用語は、ＮＫ細胞の活性化および／または活性の維持を提供するのに十分なサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）のアミノ酸断片を指す。２つ以上のＮＫ活性化ドメインを含む実施形態では、ＮＫ活性化ドメインは、直列的に、または任意の他の組み合わせで提供されてもよい。加えて、各サイトカインベースのＮＫ活性化ドメインは、ＴｒｉＫＥ分子に含まれる他のＮＫ活性化ドメインの性質とは無関係に、サイトカインの完全なアミノ酸配列のいずれかを含み得るか、またはアミノ酸断片であり得る。ＮＫ活性化ドメインが基づくことができる例示的なサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２、およびＩＬ－２１が挙げられる。したがって、ＮＫ活性化ドメインがＩＬ－１５に由来する例示的なモデル実施形態に関して本明細書に詳細に記載されるが、ＴｒｉＫＥは、任意の好適なサイトカインであるか、またはそれに由来するＮＫ活性化ドメインを使用して設計され得る。

この説明の簡潔さのために、それが基づくことができるサイトカインを同定することによるＮＫ活性化ドメインへの言及は、サイトカインの完全なアミノ酸配列、サイトカインの任意の好適なアミノ酸断片、および／または１つ以上のアミノ酸置換を含むサイトカインの改変バージョンの両方を含む。したがって、「ＩＬ－１５」ＮＫ活性化ドメインへの言及は、ＩＬ－１５の完全なアミノ酸配列を含むＮＫ活性化ドメイン、ＩＬ－１５の断片を含むＮＫ活性化ドメイン、または野生型ＩＬ－１５アミノ酸配列と比較してアミノ酸置換を含む、例えば、ＩＬ－１５Ｎ７２ＤもしくはＩＬ－１５Ｎ７２ＡなどのＮＫ活性化ドメインを含む。

ＴｒｉＫＥにおけるＩＬ－１５ ＮＫ活性化ドメインの使用は、ヒトＮＫ細胞が劇的に上昇し、３週間後であってもがんが減少することを示すマウスモデルで証明されているように、持続的なＮＫ細胞活性を提供することができる。ＮＫ細胞は、マウスで活性化され、数多くの抗がん因子およびサイトカインを産生する。ＩＬ－１５ ＮＫ活性化ドメインは、これらの分子がより容易にリフォールディングされ、および／またはより高い収率で回収可能であるように、これらの分子の化学的性質を何らかの形で変化させ、こうして、ＴｒｉＫＥ分子を、臨床的スケールアップにより適したものにする。

いくつかの実施形態では、分子は、上述のドメインのうちの２つを連結することができる隣接配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、隣接配列の存在は、ＮＫ細胞活性化をさらに増加させることができる。１つの例示的な隣接配列は、配列番号１の２０個のアミノ酸を含む（米国特許出願公開第２０１８／０２８２３８６号も参照されたい）。別の例示的な隣接配列は、配列番号２の７つのアミノ酸を含む。ある特定の実施形態は、２つ以上の隣接配列を含む。一例として、配列番号１は、ＮＫエンゲージングドメイン（例えば、抗ＣＤ１６受容体ｓｃＦｖ）をＮＫ活性化ドメイン（例えば、ＩＬ－１５）と連結する配列番号３の隣接配列を含む。配列番号１はまた、ＮＫ活性化ドメインをターゲティングドメイン（例えば、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）と連結する配列番号４の隣接配列を含む。

^５１クロムリリースアッセイが、いくつかの異なるＴｒｉＫＥを用いて実行され、がん細胞を標的とする任意のｓｃＦｖが機能的ＴｒｉＫＥに組み込まれ得ることを示した。非小細胞肺がん細胞（ＮＣＩ－Ｈ４６０）細胞を、１６１５ＥＰＣＡＭ１３３ ＴｒｉＫＥまたは１６１５ＮＧ２ ＴｒｉＫＥとともにインキュベートした。１６１５ＮＧ２および１６１５ＥｐＣＡＭ１３３の両方は、いくつかの異なるＥ：Ｔ比（２０：１、１０：１、および５：１）で活性を有した。図１９Ｂは、黒色腫細胞を、１６１５ＥＰＣＡＭ１３３ ＴｒｉＫＥとともにインキュベートしたことを示す。メソセリン＋ＥｐＣＡＭ－ＮＧ２ ＭＤＡ－４３５Ａ黒色腫細胞を、１６１５ＥＰＣＡＭ ＴｒｉＫＥ、または１６１５Ｍｅｓｏ ＴｒｉＫＥ（配列番号３２）とともにインキュベートした。１６１５Ｍｅｓｏのみが活性を有した。卵巣がん細胞（Ｏｖｃａｒ３細胞）を、１６１５ＮＧ２ ＴｒｉＫＥまたは１６１５Ｍｅｓｏ ＴｒｉＫＥとともにインキュベートした。両方のＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞溶解活性を誘導した。また、白血病マーカーＣＤ１９およびＣＤ２２を認識する抗白血病ＴｒｉＫＥを作製した。１６１５２２１９ ＴｒｉＫＥを、ＣＤ２２＋ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞で試験し、それらを非常に良好に殺傷した（リツキシマブと同様）。総合して、これらのデータは、任意のｓｃＦｖが１６１５Ｘの一般化されたＴｒｉＫＥ構造プラットフォームに挿入され得、得られたＴｒｉＫＥが、ＮＫ細胞に、ｓｃＦｖ標的に対して応答して、増大するよう指示することができることを示す。追加の例示的なＴｒｉＫＥ分子を表１にリスト化する。

（表１）例示的なＴｒｉＫＥ分子

^＊ＴｒｉＫＥプラットフォームによって３０％を超えて増強されたＡＤＣＣまたは細胞傷害活性
^＊＊増大：ＴｒｉＫＥはＮＫ細胞の増大を増強するが、ＢｉＫＥは増強しない。
^＊＊＊活性化：ＴｒｉＫＥは、ＩＮＦγおよびＴＮＦαを含む様々な抗がんサイトカインの産生を増強する。

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、動物ナノボディに由来するヒト化ＣＤ１６エンゲージャーの使用を伴うことができる。ｓｃＦｖは、リンカーによって結合された重可変鎖構成要素および軽可変鎖構成要素を有するが、ナノボディは、標的に特異的にエンゲージングすることができる単一の単量体可変鎖、例えば、可変重鎖または可変軽鎖からなる。ナノボディは、例えば、ラクダ科動物（例えば、ラマまたはラクダ）または軟骨魚類などの任意の好適な動物の抗体に由来し得る。ナノボディは、より大きな抗体断片と比較して、優れた物理的安定性、深い溝（ｄｅｅｐ ｇｒｏｏｖｅ）に結合する能力、および増加した産生収率を提供することができる。

一例示的な実施形態では、ナノボディベースのＮＫエンゲージャー分子は、公開されているラマナノボディに由来するヒト化ＣＤ１６ナノボディを含むことができ（ＧｅｎｅＢａｎｋ配列ＥＦ５６１２９１、Ｂｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２１（１）：１－１０）、ＥＦ９１と称される。ラマＥＦ９１は、このＣＤ１６エンゲージャーがＮＫ細胞の活性化を駆動する能力を試験するために、当初、ＣＤ１９を含有するＢｉＫＥに構築された。これは、Ｒａｊｉ標的を用いたクロムリリースアッセイにおいて、リツキシマブ媒介性殺傷と同様の機能を示した（図１Ａ）。分子の機能性を確認したら、ＣＤＲをヒト化ラクダ科動物足場にクローニングして（Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８４（５）：３２７３－３２８４）、ＣＤ１６エンゲージャーをヒト化し、これをＨｕＥＦ９１と称する。ＨｕＥＦ９１の結合は、標準ＣＤ１６ ｓｃＦｖを使用して観察された結合と同等であり、ラマナノボディ可変重鎖をヒト化骨格に組み込むことが、分子の特異性を妨げていないことを示した。本明細書に記載のＴｒｉＫＥ分子におけるＮＫエンゲージャーとしてのＨｕＥＦ９１の使用は、薬物収量を増加させ、安定性を増加させ、および／またはＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣの有効性を増加させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫エンゲージャーを使用して、患者自身の免疫系を刺激して腫瘍細胞を排除することができる。研究は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子組換えされたＴ細胞が抗腫瘍活性の強力な臨床媒介物質であることを示すが、Ｔ－ＣＡＲの産生はコストが高く複雑である。他の不利な点としては、サイトカイン毒性のリスク、および健常な組織との相互作用または腫瘍性形質転換をもたらすＴ－ＣＡＲの長期持続性が挙げられる。本明細書に記載されるように、三重特異的キラーエンゲージャーは、ＡＤＣＣの媒介物として機能することができ、体外遺伝子組換えおよび遺伝子治療を必要とせずにＮＫ細胞を増大させることができ、Ｔ－ＣＡＲ系に対して潜在的な利点を提供する。免疫エンゲージャーが迅速に除去されるため、応答は無制限に持続することができず、おそらく、Ｔ－ＣＡＲと比較して、免疫エンゲージャーのサイトカイン毒性のリスクを低減する。

いくつかの実施形態では、三重特異的キラーエンゲージャーは、サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、三重特異的キラーエンゲージャーは、好ましくはＩＬ－１５を含む。ＩＬ－１５は、Ｔｒｅｇを誘導せず、ＩＬ－１５はＮＫ細胞の制御因子である。活性化および細胞傷害性を改善することに加えて、ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞上の抗アポトーシスおよび増殖シグナルを調節および開始し、増強されたＮＫ細胞の増大および生存をもたらすことができる。これらの特徴は、がんの治療における三重特異的キラーエンゲージャーの使用中に有益であり得る。いくつかの実施形態では、三重特異的キラーエンゲージャーにＩＬ－１５を含むことにより、ＴｒｉＫＥのＮＫ／標的細胞シナプスへの直接送達を媒介することができ、全身性ＩＬ－１５よりも効果的にＩＬ－１５を腫瘍部位に蓄積させる可能性がある。

いくつかの実施形態では、免疫エンゲージャーは、免疫細胞媒介性サイトカインの分泌を増加させる。いくつかの実施形態では、サイトカイン分泌は、好ましくは抗原特異的である。いくつかの実施形態では、このサイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、および／またはＴＮＦ－αを含むことができる。いくつかの実施形態では、このサイトカイン産生は、好ましくは、生理学的レベルである。いくつかの実施形態では、このサイトカイン産生は、ＩＬ－１２／ＩＬ－１８で刺激されたＮＫ細胞で観察されるレベルよりも低いレベルである（Ｐａｐａｄａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：７００２－７００７）。実施例２に示されるように、サイトカインＬｕｍｉｎｅｘ分析を使用してＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－αを含む特徴的な炎症性サイトカインを測定すると、ＢｉＫＥとＴｒｉＫＥとの間でＧＭ－ＣＳＦ分泌において統計的に有意な差を示したが、他のサイトカインの分泌において差はなかった。

いくつかの実施形態では、免疫エンゲージャーは、リンパ球の増殖を増加させる。リンパ球は、例えば、ＮＫ細胞、γδ－Ｔ細胞、および／またはＣＤ８Ｔ細胞を含むことができる。２つ以上のＮＫ細胞エンゲージャードメインおよび／または２つ以上のＮＫ活性化ドメインを含む、ＴｅｔｒａＫＥ、またはより大きな分子を設計することができる。

別の態様では、本開示は、対象における標的細胞を殺傷する方法を記載する。全体として、本方法は、ＴｒｉＫＥ分子を、標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量で対象に投与することを含む。「治療」またはその変形は、状態に関連する症状または徴候を任意の程度に低減する、進行を制限する、改善する、または解消することを指す。本明細書で使用される場合、「改善する」は、特定の状態の症状または臨床徴候の特徴の程度、重症度、頻度、および／または可能性の任意の低減を指し、「症状」は、疾患または患者の状態の任意の主観的証拠を指し、「徴候」または「臨床徴候」は、患者以外の者によって見出されることができる特定の状態に関連する客観的な身体所見を指す。

「治療」は、療法的であっても予防的であってもよい。「療法的」およびその変形は、状態に関連する１つ以上の既存の症状または臨床徴候を改善する治療を指す。「予防的」およびその変形は、状態の症状または臨床徴候の発症および／または出現を任意の程度に制限する治療を指す。一般に、「療法的」治療は、状態が対象に現れた後に開始され、「予防的」治療は、状態が対象に現れる前に開始される。したがって、ある特定の実施形態では、本方法は、状態を発症するリスクのある対象の予防的治療を含むことができる。「リスクのある」とは、記載されたリスクを実際に有し得るか、または有しない対象を指す。したがって、例えば、特定の状態を発症するための「リスクのある」対象は、対象が状態を有するかまたは発症する任意の症状または臨床徴候（ｓｉｇｎ）を示すかどうかにかかわらず、１つ以上の徴候（ｉｎｄｉｃｉａ）を欠く個体と比較して、特定の状態を有するリスクまたは発症するリスクの高い１つ以上の徴候を有する対象である。状態の例示的な徴候は、例えば、遺伝的素因、系統（ａｎｃｅｓｔｒｙ）、年齢、性別、地理的居住地、ライフスタイル、または病歴を含むことができる。症状が解消した後も、例えば、再発を予防または遅延させるために、治療を継続してもよい。

例えば、ＨＩＶに感染した対象の場合、「治療」は、ウイルス量の低減および／または症状の改善を含み得る。

場合によっては、治療は、ＴｒｉＫＥ分子がインビボで内因性ＮＫ細胞を刺激することができるように、ＴｒｉＫＥ分子を対象に投与することを伴うことができる。インビボの一部としてＴｒｉＫＥ分子を使用することは、ＮＫ細胞を抗原特異的にすることができ、同時共刺激、生存の向上、および増大が、抗原特異的になり得る。他の場合では、ＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞養子移入療法のアジュバントとしてインビトロで使用することができる。

したがって、ＮＫ活性化ＴｒｉＫＥまたはＴ細胞活性化ＴｒｉＫＥにかかわらず、ＴｒｉＫＥ分子は、対象が最初に状態の症状または臨床徴候を示す前、その間、またはその後に投与されてもよい。対象が最初に状態に関連する症状または臨床徴候を呈する前に開始された治療は、ＴｒｉＫＥ分子が投与されていない対象と比較して、対象が状態の臨床的証拠を経験する可能性を減少させ、症状および／もしくは状態の臨床徴候の重症度を減少させ、ならびに／または状態を完全に解消することをもたらし得る。対象が最初に状態に関連する症状または臨床徴候を呈した後に開始された治療は、組成物が投与されていない対象と比較して、状態の症状および／もしくは臨床徴候の重症度を減少させ、ならびに／または状態を完全に解消することをもたらし得る。

ＴｒｉＫＥ分子は、適切な標的細胞集団に選択的に結合するターゲティングドメインを有する、上述のＴｒｉＫＥ分子の任意の実施形態であり得る。場合によっては、標的細胞は、ウイルス感染細胞を含むことができ、この方法は、ウイルス感染症を治療することを含むことができる。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、ウイルス感染症の少なくとも１つの症状または臨床徴候を改善することを含むことができる。

様々な実施形態では、例えばＴｒｉＫＥターゲティングドメインは、例えば、ＨＩＶ上のメソセリンまたはウイルス抗原に選択的に結合するポリペプチドを含むことができる。

本明細書で使用する場合、「対象」は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、サル等）等の任意の動物であり得る。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトであり得る。

本明細書に記載のＴｒｉＫＥ分子は、薬学的に許容される担体とともに製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤、および／または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および／または薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の培地または薬剤が有効成分と不適合である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助有効成分も組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、生物学的または他の方法で望ましくないものではない材料を指し、すなわち、材料が、いずれかの望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含まれる薬学的組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、ＴｒｉＫＥ分子とともに個体に投与され得る。

したがって、ＴｒｉＫＥ分子は、薬学的組成物に製剤化されてもよい。薬学的組成物は、好ましい投与経路に適合される様々な形態で製剤化され得る。したがって、組成物は、例えば、経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）、または局所（例えば、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸など）を含む既知の経路を介して投与され得る。薬学的組成物は、例えば、鼻または呼吸粘膜への投与（例えば、スプレーまたはエアゾールによる）などによって、粘膜表面に投与することができる。組成物は、持続放出または遅延放出を介して投与することもできる。

したがって、ＴｒｉＫＥ分子は、溶液、懸濁液、乳剤、スプレー、エアゾール、または任意の形態の混合物を含むがこれらに限定されない任意の好適な形態で提供され得る。組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、担体、またはビヒクルを含む製剤で送達されてもよい。例えば、製剤は、例えば、クリーム、軟膏、エアゾール製剤、非エアゾールスプレー、ゲル、ローションなどの従来の局所剤形で送達され得る。製剤は、例えば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、香料、香味料、保湿剤、増粘剤などを含む１つ以上の添加剤をさらに含んでよい。

製剤は、単位剤形で都合良く提示されてもよく、薬学の分野で周知の方法によって調製されてもよい。薬学的に許容される担体を含む組成物を調製する方法としては、ＴｒｉＫＥ分子を、１つ以上の副成分を構成する担体と会合させるステップが挙げられる。一般に、製剤は、活性分子を液体担体、細かく分割された固体担体、または両方と均一かつ／または密接に会合させ、次いで必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することによって調製され得る。

投与されるＴｒｉＫＥ分子の量は、使用される特定のＴｒｉＫＥ分子、対象の体重、体調、および／もしくは年齢、ならびに／または投与経路を含むがこれらに限定されない様々な要因に応じて変化し得る。したがって、所与の単位剤形に含まれるＴｒｉＫＥ分子の絶対重量は、対象の種、年齢、体重および体調、ならびに／または投与方法などの要因に依存して、広く変化し得る。したがって、すべての可能な用途に有効なＴｒｉＫＥ分子の量を構成する量を一般に提示することは、実用的ではない。しかしながら、当業者は、そのような要因を適切に考慮して適切な量を容易に決定することができる。

いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、約１００ｎｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量を対象に提供するのに十分なＴｒｉＫＥ分子を投与することを含み得るが、いくつかの実施形態では、本方法は、この範囲外の用量でＴｒｉＫＥ分子を投与することによって実行され得る。これらの実施形態のうちのいくつかでは、本方法は、対象に約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、約１００μｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの用量を提供するのに十分なＴｒｉＫＥ分子を投与することを含む。

あるいは、用量は、治療コースの開始直前に得られた実際の体重を使用して計算されてもよい。このようにして算出した投与量の場合、体表面積（ｍ２）は、デュボア法を使用して、治療コースの開始前に算出する：ｍ２＝（体重ｋｇ０．４２５×身長ｃｍ０．７２５）×０．００７１８４。

いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍ２～約１０ｍｇ／ｍ２の用量を提供するのに十分なＴｒｉＫＥ分子を投与することを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ＴｒｉＫＥ分子は、例えば、１週間に単回用量から複数回用量まで投与され得るが、いくつかの実施形態では、本方法は、この範囲外の頻度でＴｒｉＫＥ分子を投与することによって実行され得る。ある特定の実施形態では、ＴｒｉＫＥ分子は、月に約１回～週に約５回投与され得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。１つ以上の追加の治療剤は、ＴｒｉＫＥ分子の投与の前、後、および／または同時に投与され得る。ＴｒｉＫＥ分子および追加の治療剤を同時投与してもよい。本明細書で使用される場合、「同時投与される」は、組み合わせの治療または予防効果が、単独で投与されるいずれかの成分の治療または予防効果よりも大きくなり得るように投与される、組み合わせの２つ以上の成分を指す。２つの成分は、同時的にまたは連続的に同時投与されてもよい。同時的に同時投与される成分は、１つ以上の薬学的組成物で提供され得る。２つ以上の成分の連続的な同時投与には、各成分が同時に治療部位に存在することができるように成分が投与される場合が含まれる。あるいは、２つの成分の連続的な同時投与は、少なくとも１つの成分が治療部位から除去されたが、成分を投与することによる少なくとも１つの細胞効果（例えば、サイトカイン産生、ある特定の細胞集団の活性化など）が、１つ以上の追加の成分が治療部位に投与されるまで、治療部位で持続する場合を含むことができる。したがって、同時投与される組み合わせは、ある特定の状況では、互いに化学混合物中に絶対に存在しない成分を含むことができる。他の実施形態では、ＴｒｉＫＥ分子および追加の治療剤は、混合物またはカクテルの一部として投与されてもよい。いくつかの態様では、ＴｒｉＫＥ分子の投与は、他の治療剤または薬剤の単独投与と比較して、他の治療モダリティのより低い用量の有効性を可能にし得、それによって、より高い用量の他の治療剤または薬剤が投与されるときに観察される毒性の可能性、重症度、および／または程度を減少させる。

いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の十分なＴｒｉＫＥ分子を投与すること、および治療的相乗作用を示す少なくとも１つの追加の治療剤を投与することを含むことができる。本発明の方法のいくつかの態様では、本明細書に記載のＴｒｉＫＥ分子および追加の治療剤の両方を投与した後に観察される治療に対する応答の測定は、ＴｒｉＫＥ分子または追加の治療剤のいずれかを単独で投与した後に観察される治療に対する応答の同じ測定よりも改善される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＨＩＶ標的とする追加の薬剤、例えば、アタザナビル（Ｒｅｙａｔａｚ）、ダルナビル（Ｐｒｅｚｉｓｔａ）、ホスアンプレナビル（Ｌｅｘｉｖａ）、ロピナビル；リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ）；チプラナビル（Ａｐｔｉｖｕｓ）またはアシクロビルを含むことができる。他の抗ウイルス剤は、当業者に既知であり、ＴｒｉＫｅ投与前、投与中、または投与後にＴｒｉＫｅ組成物と組み合わせることができる。

前述の説明および以下の特許請求の範囲では、用語「および／または」は、リスト化された要素のうちの１つまたはすべて、またはリスト化された要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味し、「含む」、「含んでいる」という用語、およびそれらの変形は、拡張可能として解釈されるべきであり、すなわち、追加の要素またはステップは、任意選択であり、存在しても、存在していなくてもよく、別段の定めがない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、１つまたは２つ以上を意味し、エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれるすべての数値を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。

前述の説明では、明確にするために特定の実施形態を単独で説明してもよい。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と互換性がないことが別途明示的に指定されない限り、ある特定の実施形態は、１つ以上の実施形態に関連して本明細書で説明される互換性のある特徴の組み合わせを含むことができる。

個別のステップを含む本明細書に開示される任意の方法について、ステップは、任意の実現可能な順序で実施することができる。また、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせを同時に実施してもよい。

本発明は、以下の実施例によって説明される。特定の実施例、材料、量、および手順は、本明細書に記載される本発明の範囲および精神に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。

実施例１
１６１５抗ＨＩＶの構築
１６１５ｘはプラットフォーム技術であるため、がんの発症に関連するまたは関連しない抗ウイルスｓｃＦｖを使用することも可能である。ＴｒｉＫＥ １６１５抗ＨＩＶ（配列番号５）をコードするハイブリッドポリヌクレオチドの合成およびアセンブリは、ＤＮＡシャッフルおよびライゲーション技術を使用して達成された。完全にアセンブルされたポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端まで、ＮｃｏＩ制限部位、ＡＴＧ開始コドン、抗ＣＤ１６ ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域、２０アミノ酸セグメント（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ 配列番号１）、改変ＩＬ－１５、７アミノ酸リンカー（ＥＡＳＧＧＰＥ 配列番号２）、および抗ＨＩＶ ｓｃＦｖを有し、最後に、ＸｈｏＩ制限部位を有する。

ＨＩＶ－エンベロープ特異的、ＩＬ－１５含有三重特異的キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）は、両方とも再活性化し、ＮＫ細胞の殺傷をＨＩＶ感染Ｔ細胞に向かわせる
抗レトロウイルス薬の有効性および使用の進歩は、ＨＩＶ感染者の健康および寿命を実質的に改善したが、これらの薬物は、ＡＩＤＳへの進行を防止し、ウイルスのさらなる伝播を制限するための一時しのぎに過ぎない。ＨＩＶの複製を抑制するために抗ウイルス剤を使用したにもかかわらず、感染者は、ＨＩＶに潜伏感染した細胞のリザーバーを保持しており、抗レトロウイルス療法を中止すると、活性感染を再活性化し、再確立する可能性がある。治癒的解決策は、これらの潜伏感染した細胞の再活性化およびその後の破壊を必要とする。ＨＩＶ感染に対する抗体応答は、存在しているが、ウイルスの変異率が高く、生成された抗体によって認識されるエピトープを迅速に排除することができるため、一般に効果がない。しかしながら、近年、強い中和作用を有するが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する能力が低い様々なＨＩＶ特異的抗体が、感染者において同定されている。したがって、本発明者らは、ＩＬ－１５分子によって連結されたＨＩＶ－Ｅｎｖに対する広域中和抗体（ｂｎＡｂ）に由来する短鎖可変断片と、ＣＤ１６エンゲージャーとからなる二重および三重特異的キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥ）を設計した。この三重特異的抗体コンストラクトの目的は、これらの抗体の広特異性を利用してＨＩＶを標的とすると同時に、膜に発現したＥｎｖのその認識を介してＮＫ細胞の殺傷を活発に複製している感染細胞に特異的にリダイレクトし、低親和性Ｆｃ受容体、ＣＤ１６を介してＮＫ細胞の脱顆粒化を引き起こすことである。リンカーとしてのＩＬ－１５の付加は、ＮＫ細胞をさらに活性化し、それによって、それらの応答を増強するはずである。ＩＬ－１５は、潜伏感染細胞の潜在的な再活性化因子（ｒｅａｃｔｉｖａｔｏｒ）としても同定されている。本発明者らの研究室からの初期研究は、本発明のＨＩＶ特異的コンストラクトとインキュベートしたときに、ＮＫ細胞サイトカイン産生およびＨＩＶ－Ｅｎｖを発現する感染標的の殺傷が増強されたことを示している。ＴｒｉＫＥとインキュベートした健常なドナー由来のＰＢＭＣは、ＮＫ、ＣＤ４およびＣＤ８サブセットにおける免疫細胞活性化の顕著な増加、ならびにＮＫ細胞の増殖を誘導することを示した。さらに、単量体、またはＴｒｉＫＥの一部としてのＩＬ－１５は、インビトロで感染患者から単離された、ＨＩＶに潜伏感染したＴ細胞を再活性化する、能力を示す。ＡＲＴ治療を受けたＨＩＶ感染患者におけるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαスーパーアゴニスト（Ｎａｎｔ－８０３）の最近の試験でもまた、血清中のウイルスの検出および免疫の活性化がもたらされた。総合して、これらのデータは、ＮＫ細胞がＡＤＣＣを媒介する能力を利用することによって、潜伏感染したリザーバーの再活性化および排除におけるＴｒｉＫＥを含有するＨＩＶ－ｂｎＡｂの潜在的な役割を示す。

さらなる例として、以下の表２に示される広域中和抗体（ｂｎＡｂ）を、１６／１５／Ｘ ＴｒｉＫＥの本明細書に記載される組成物および方法において使用することができる。表２に示される抗体は、例えば、ｃａｍＣＤ１６／ＩＬ－１５／抗ＨＩＶ ｂｎＡｂを含むＴｒｉＫＥコンストラクトにおいて使用することができる。本発明で有用なＨＩＶ遮断抗体をリスト化するデータベースのさらなる例は、以下のサイトで公開され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１３１２３０２３１８２１／ｈｔｔｐ：／／ｂｎａｂｅｒ．ｏｒｇ／、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ａｂ＿ｓｅａｒｃｈ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１３１２３０２３１８２１／ｈｔｔｐ：／／ｂｎａｂｅｒ．ｏｒｇ／。

（表２）広域中和ＨＩＶ抗体

^＃上記の特許および出願の開示は、特にｂｎＡｂ配列に関して、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例２
メソセリンに対する三重特異的キラーエンゲージャー（ＴＲＩＫＥ）はＮＫ細胞を肺がんに向けてターゲティングする
ＮＫ細胞は、血液悪性腫瘍の治療において重要なエフェクターであるが、固形腫瘍の治療においては、これまでにあまり効果的ではなかった。肺がん細胞は一般的にＮＫ細胞の殺傷には抵抗性があるが、共通の腫瘍抗原であるメソセリンに対してＮＫ細胞の溶解をリダイレクトする小分子が肺がん環境でのＮＫ細胞の殺傷を増強することができるかどうかを明らかにしたいと考えた。メソセリンは、肺内膜（ｌｕｎｇ ｌｉｎｉｎｇ）の侵襲性がんである中皮腫を含むいくつかのがんにおいて過剰発現される表面タンパク質である。

健常なドナーおよび新たに診断されたがん患者からの末梢血ＮＫ細胞との比較により、肺がん患者は、ＮＫ細胞の主要なサブセットに差異がない細胞表面でＣＤ１６（Ｆｃ受容体）の発現を維持していることが明らかになった。したがって、本発明者らは、ＣＤ１６に対する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と、メソセリンに対する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）とからなる三重特異的キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）を設計した。ｓｄＡｂおよびｓｃＦｖは、組換えＩＬ－１５によって一緒に連結された。健常ドナーの末梢血ＮＫ細胞で試験したところ、本薬物はインビトロでＮＫ細胞の増殖を増強することができた。加えて、末梢血ＮＫ細胞を９つの異なる肺がん株で培養した場合、ＴｒｉＫＥは、がん細胞に対して特異的に脱顆粒化（一部では＞６０％）およびＩＦＮγ産生（一部では＞３０％）を増加させた。

肺がん患者の末梢血由来のＮＫ細胞も、薬物のみに応答して増殖した。さらに、ＴｒｉＫＥで処理した場合、患者の細胞は、肺がん細胞に応答して、脱顆粒化（＞６０％）およびＩＦＮγ産生（＞４０％、これは、健常なドナー応答よりも有意に多かった）を増加させた。

チェックポイント遮断抗体は、肺がん患者に対する現在の標準治療であり、本発明者らのさらなる研究は、インビトロおよびインビボの両方で、このメソセリンを標的としたＴｒｉＫＥとチェックポイント遮断との組み合わせに焦点を当てている。

実施例３
抗ＨＩＶ／ＣＡＭ１６ ＢＩＫＥおよびＴＲＩＫＥの一過性発現
実験計画
ＶＲＣ０１－ｂ１２ＣＬ／ＶＲＣ０７Ｈ Ｇ５４Ｈ（ｂｎＡｂについては表４を参照されたい）については、最初にＶＲＣ ＦａｂベースのＢｉＫＥを試験することから始めた。ｂＮＡｂは、進化に何年もかかり、他の抗体の３倍もの変異が蓄積される。

発現コンストラクト
哺乳動物細胞株における発現のために、ＶＲＣ０１－ｂ１２ＣＬ（軽鎖）を、短いリンカー（ＧＧＧＧＳ２）および非ヒト化ＣＡＭ１６とともに、好適な発現ベクター（ｐＣｏｏｆ４０）にクローニングした。使用されたクローニング法はギブソンアセンブリまたは関連する方法のＨｉＦｉアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）であった。ヒト化ＣＡＭ１６ ＢｉＫＥも同様に構築した。ＶＲＣ０７Ｈ Ｇ５４Ｈプラスミドは改変されなかった。両方のプラスミドＤＮＡの大規模な調製物を、ＺｙｍｏＰＵＲＥ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって作成した。

ＢｉＫＥタンパク質の発現
本発明者らは、高レベルの一過性タンパク質発現のために、懸濁液適応ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞株（ＥｘｐｉＣＨＯ／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）を用いた。１：１の比率の重鎖対軽鎖含有プラスミド（１ｕＧ ＤＮＡ／ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ培地）を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯまたは２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してコトランスフェクションし、製造業者の指示に従って、温度およびＣＯ２制御インキュベーターで振とうしながらインキュベートした。４～５日後、または生存率が７５％未満の生存細胞で測定された場合、ベンチトップ遠心分離機で２０００ＲＰＭで遠心分離し、続いて０．２２マイクロメートルフィルターを通して濾過することによって上清を採取した。次に、濾過した上清を－８０℃で保存した。

精製の準備ができたら、製造業者の指示に従って、ＴＡＬＯＮ金属親和性樹脂を使用して薬物を解凍し、単離した。続いて、ＢＳＡを標準として使用したブラッドフォードアッセイを使用して、薬物を定量化した。純度は、Ｂｏｌｔ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー中でＢｏｌｔ（商標）４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ＋ＳＤＳ－Ｐａｇｅゲルを泳動し、クマシー色素Ｇ－２５０で染色した濃度測定を使用してアクセスした。

実施例４
ＨＩＶ特異的ＢＩＫＥおよびＴＲＩＫＥ
図１１は、ＨＩＶ特異的ＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥの構造および提案されている機能を示す。図１１（Ａ）は、ＨＩＶ広域中和抗体（ｂｎＡｂ）ＶＲＣ０１に由来するＦａｂに連結された抗ＣＤ１６短鎖可変断片から構成される最初の二重特異的ＨＩＶターゲティングコンストラクトの構成要素の起源を示す概略図である。図１１（Ｂ）ＨＩＶ二重特異的および三重特異的キラーエンゲージャー（それぞれＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥ）の概略および提案された機能。ＢｉＫＥは、ｂｎＡｂ構成要素を介して感染細胞上に発現されたＨＩＶエンベロープに結合し、抗ＣＤ１６部分は、ＮＫ細胞に結合し、ＣＤ１６を介してシグナル伝達し、機能的応答を誘発する。同様の活性が、ＮＫ細胞を活性化し、その機能を増強し、増殖応答を誘導するＩＬ－１５リンカー能力を追加した、ＴｒｉＫＥを使用して提案される。ＩＬ－１５構成要素はまた、潜伏感染したＴ細胞を活性化してもよく、それにより、ＨＩＶ－ＴｒｉＫＥおよび免疫系全体による認識を受けやすくし得る。

図１２は、ＨＩＶ－Ｅｎｖ特異的ＢｉＫＥが、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞、ＨＩＶ感染細胞株に結合し、ＨＩＶ特異的ＮＫ細胞応答を誘導することを示す。図１２（Ａ）健常なドナー精製末梢血ＮＫ細胞を、ＣＤ１６、ストレプトアビジン対照、またはＨｉｓタグ付きＢｉＫＥについて、ビオチン化抗Ｈｉｓおよび蛍光色素コンジュゲートストレプトアビジンで染色した。ＢｉＫＥは、ＣＤ１６発現を反映するＮＫ細胞に結合する。図１２（Ｂ）未感染のＣＤ４発現ＨｅＬａ細胞またはＨＩＶに感染したＨｅＬａ－ＣＤ４をＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥで染色した。ＢｉＫＥは、感染したＨｅＬａ－ＣＤ４に特異的に結合したが、未感染のＨｅＬａ－ＣＤ４には結合せず、ＨＩＶエンベロープを発現する細胞に対するＢｉＫＥの特異性を示す。図１２（Ｃ）精製された健常なドナーＮＫ細胞を、ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥありもしくはなしで、感染または未感染のＨｅＬａ－ＣＤ４細胞とともにインキュベートした。リツキシンを有するＫ５６２細胞およびＲａｊｉを対照として使用した。ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥは、感染したＨｅＬａ細胞に対してのみ強力な脱顆粒化およびサイトカイン応答を誘発し、ＢｉＫＥの特異的活性を示した。これらの応答は、Ｒａｊｉ＋リツキシン対照と同等であった。

図１３は、ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥが、初感染Ｔ細胞株に特異的に結合し、ＮＫ細胞の殺傷を媒介することを示す。図１３（Ａ）２つのＨＩＶに感染したＴ細胞株、Ｈ９ ＨＩＶ－ＩＩＩＢおよびＡＣＨ－２、またはそれらの未感染対応物、Ｈ９およびＣＥＭ ＣＤ４を、ＨＩＶキャプシドタンパク質について細胞内染色して、活性なＨＩＶ複製を確認した。図１３（Ｂ）同じ感染および未感染のＴ細胞株を、Ｈｉｓタグ付きＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥおよびビオチン化抗Ｈｉｓ＋ストレプトアビジンで、または二次のみで染色した。ＢｉＫＥは、未感染Ｔ細胞株への結合を示さなかったが、両方の感染クローンに結合し、活性な感染Ｔ細胞に対する特異性を示した。図１３（Ｃ）健常なドナーからの精製されたＮＫ細胞を、ＨＩＶ－Ｅｎｖ ＢｉＫＥありもしくはなしで、未感染のまたはＨＩＶ感染Ｔ細胞株と共培養し、ＮＫ脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）およびＩＦＮｇ産生について評価した。ＨＩＶ－ＢｉＫＥは、感染したＴ細胞株に対して特異的に、ＮＫ細胞の脱顆粒化およびサイトカイン産生の両方を増強したが、未感染のＴ細胞株に対しては増強しなかった。

図１４は、ＩＬ－１５含有ＨＩＶ－ＴｒｉＫＥが、免疫サブセットを活性化し、潜伏感染した初代細胞株およびＴ細胞株においてウイルス転写を誘導することを示している。（Ａ）末梢血単核細胞を、等モルのｒｈＩＬ－１５またはＩＬ－１５含有ＨＩＶ－ＴｒｉＫＥとともに１６時間インキュベートした。ＮＫおよびＴ細胞サブセットを、ＣＤ６９発現による活性化についてフローサイトメトリーによって評価した。図１４（Ｂ）潜伏感染したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞株、ＡＣＨ－２を、１０ｎＭのＰＭＡ、１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１５、または等モルのＩＬ－１５含有ＴｒｉＫＥの存在下で４８時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＨＩＶ－ｇａｇ（ｐ２４）について細胞内染色した。ＩＬ－１５単独およびＴｒｉＫＥの両方は、ｐ２４発現によって示されるように、著しいウイルス再活性化を誘導した。図１４（Ｃ）精製されたＣＤ４＋記憶Ｔ細胞を、抗レトロウイルス処置されたＨＩＶ感染患者から単離し、ｒｈＩＬ－１５、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト、Ｎａｎｔ－８０３、またはＩＬ－１５含有ＴｒｉＫＥとともに培養した。各状態を、ＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡのありまたはなしで、７２時間インキュベートした。次いで、細胞を採取し、ネステッドＰＣＲ反応を行って、ＨＩＶ ｍＲＮＡを同定した。

ＢｉＫＥ分子およびＴｒｉＫＥ分子の両方は、例えば、軽鎖および重鎖を別々にコードする２つのプラスミドまたはポリヌクレオチドのコトランスフェクションを含む上記の方法を使用して生成することができる。２つのタンパク質は、例えば、２Ａ自己切断ペプチドまたはＩＲＥＳを使用して、単一のプラスミドまたはポリヌクレオチドから生成することもできる。例示的なＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥ分子およびアミノ酸配列は、本明細書の図面および配列に示される）。

上記の明細書に記載の様々な実施形態に加えて、以下の追加の実施形態が、本明細書において企図される。
実施形態１．
ＣＤ１６に選択的に結合する部分を含むＮＫエンゲージングドメインと、
ＩＬ－１５またはその機能的断片を含む、ＮＫエンゲージングドメインに作動可能に連結されたＮＫ活性化ドメインと、
ウイルス抗原に選択的に結合し、ＮＫ活性化ドメインおよびＮＫエンゲージングドメインに作動可能に連結されている、ターゲティングドメインと
を含む、化合物。
実施形態２．ＣＤ１６がＣＤ１６ａを含む、請求項１に記載の化合物。
実施形態３．ウイルス抗原が感染細胞上に存在する、請求項１に記載の化合物。
実施形態４．ウイルス抗原が、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスに由来する、請求項１に記載の化合物。
実施形態５．ウイルス抗原がＨＩＶに由来する、請求項１に記載の化合物。
実施形態６．ＮＫエンゲージングドメイン部分が抗体もしくはその結合断片またはナノボディを含む、請求項１に記載の化合物。
実施形態７．抗体断片がｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む、請求項６に記載の化合物。
実施形態８．抗体もしくはその結合断片またはナノボディが、ヒトのものであるか、ヒト化されているか、またはラクダ科動物のものである、請求項６に記載の化合物。
実施形態９．抗体もしくはその結合断片またはナノボディがラクダ科動物のものである、請求項６に記載の化合物。
実施形態１０．ＩＬ－１５が、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項６に記載の化合物。
実施形態１１．ＩＬ－１５の機能的変異体が、配列番号４と比較してＮ７２ＤまたはＮ７２Ａアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の化合物。
実施形態１２．ターゲティングドメイン部分が抗体もしくはその結合断片またはナノボディを含む、請求項１に記載の化合物。
実施形態１３．抗体結合断片がｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む、請求項１２に記載の化合物。
実施形態１４．ＮＫエンゲージングドメインがＣＤ１６を含み、ＮＫ活性化ドメインがＩＬ－１５を含み、ターゲティングドメインが、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する、請求項１に記載の化合物。
実施形態１５．ＮＫエンゲージングドメインがＣＤ１６ａを含み、ＮＫ活性化ドメインがＩＬ－１５を含み、ターゲティングドメインが、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する、請求項１に記載の化合物。
実施形態１６．ＮＫエンゲージングドメインがＮＫＧ２ｃを含み、ＮＫ活性化ドメインがＩＬ－１５を含み、ターゲティングドメインが、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する、請求項１に記載の化合物。
実施形態１７．前記ドメインのうちの２つを連結する少なくとも１つの隣接配列を含む、請求項１に記載の化合物。
実施形態１８．連結された２つのドメインを第３のドメインと連結する第２の隣接配列をさらに含む、請求項１７に記載の化合物。
実施形態１９．隣接配列がＮＫ活性化ドメインに隣接している、請求項１８に記載の化合物。
実施形態２０．第１の隣接配列が、ＮＫエンゲージングドメインに対してＣ末端側にあり、第２の隣接配列が、抗ウイルスターゲティングドメインに対してＮ末端側にある、請求項１８に記載の化合物。
実施形態２１．第２のターゲティングドメインをさらに含む、請求項１に記載の化合物。
実施形態２２．第２のＮＫエンゲージングドメインをさらに含む、請求項１に記載の化合物。
実施形態２３．第２のＮＫ活性化ドメインをさらに含む、請求項１に記載の化合物。
実施形態２４．配列番号５、７、２４、２９、または３７である、請求項１に記載の化合物。
実施形態２５．
請求項１～２４のいずれかに記載の化合物と、
薬学的に許容される担体と
を含む、組成物。
実施形態２６．
標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量で請求項１～２５のいずれかに記載の化合物を、対象に投与すること
を含む、方法。
実施形態２７．標的細胞がウイルスに感染している、請求項２６に記載の方法。
実施形態２８．ウイルスがＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスである、請求項２７に記載の方法。
実施形態２９．ウイルスがＨＩＶである、請求項２８に記載の方法。
実施形態
インビボでのＮＫ細胞の増大を刺激するための方法であって、
対象におけるＮＫ細胞の増大を刺激するのに有効な量の請求項１～２５のいずれかに記載の化合物を、対象に投与することを含む、方法。
実施形態３１．対象がウイルスに感染している、請求項３０に記載の方法。
実施形態３２．ウイルスがＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスである、請求項３１に記載の方法。
実施形態３３．ウイルスがＨＩＶである、請求項３２に記載の方法。
実施形態３４．
対象におけるウイルス感染症を治療する方法であって、
ウイルス感染症を治療するのに有効な量の請求項１～２５のいずれかに記載の化合物を、対象に投与することを含む、方法。
実施形態３５．対象が、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスに感染している、請求項３４に記載の方法。
実施形態３６．対象がＨＩＶに感染している、請求項３５に記載の方法。
実施形態３７．配列番号６の単離された核酸配列。
実施形態３８．配列番号７の単離されたアミノ酸配列。
実施形態３９．ｃａｍＣＤ１６／ＩＬ－１５／配列番号８の配列を含む、単離されたアミノ酸配列。
実施形態４０．配列番号９、１７、２７、２８、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０を含む、単離されたアミノ酸配列。
実施形態４１．配列番号１０の単離されたアミノ酸配列をさらに含む、請求項４０に記載の単離されたアミノ酸。
実施形態４２．ＩＬ－１５に作動可能に連結された配列番号１８を含む、単離されたアミノ酸配列。
実施形態４３．配列番号２０～２６の単離されたアミノ酸配列。
実施形態４４．
（ｉ）配列番号２２、２５、３０または３９の免疫グロブリン重鎖を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドと、配列番号２１、２６、３１または４０の免疫グロブリン軽鎖を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドとをそれぞれ、哺乳動物細胞にコトランスフェクションすること、および
（ｉｉ）哺乳動物細胞から上清を収集すること
を含み、得られた化合物がウイルス抗原に結合する、請求項１～２４のいずれかに記載の化合物を作製する方法。
実施形態４５．ウイルス抗原がＨＩＶに由来する、請求項４４に記載の方法。
実施形態４６．ウイルス抗原がＥｎｖである、請求項４５に記載の方法。
実施形態４７．配列番号２１、２２、２５、２６、３０、３１、３９、または４０のアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
実施形態４８．薬学的に許容される担体中に配列番号７、２４、２９、３２、３４、３６、および３７を含む、薬学的組成物。
実施形態４９．対象を治療する方法であって、薬学的に許容される担体中に配列番号５、７、２４、２９、３２、３４、３６、および３７を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
実施形態５０．
ＡＩＤＳを有するかまたはＡＩＤＳを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、配列番号５、７、２４、２９、および３７を含む薬学的組成物を、対象に投与することを含む、方法。

本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な資料の完全な開示は、参照によりその全体が組み込まれる。本発明は、上記の実施例を参照して説明されてきたが、修正および変形が、本発明の精神および範囲内に包含されることを理解されたい。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

配列

Claims (50)

1. ＣＤ１６に選択的に結合する部分を含むＮＫエンゲージングドメインと、
   ＩＬ－１５またはその機能的断片を含む、前記ＮＫエンゲージングドメインに作動可能に連結されたＮＫ活性化ドメインと、
   ウイルス抗原に選択的に結合し、前記ＮＫ活性化ドメインおよび前記ＮＫエンゲージングドメインに作動可能に連結されている、ターゲティングドメインと
   を含む、化合物。
2. 前記ＣＤ１６がＣＤ１６ａを含む、請求項１に記載の化合物。
3. 前記ウイルス抗原が感染細胞上に存在する、請求項１に記載の化合物。
4. 前記ウイルス抗原が、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスに由来する、請求項１に記載の化合物。
5. 前記ウイルス抗原がＨＩＶに由来する、請求項１に記載の化合物。
6. 前記ＮＫエンゲージングドメイン部分が抗体もしくはその結合断片またはナノボディを含む、請求項１に記載の化合物。
7. 前記抗体断片がｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む、請求項６に記載の化合物。
8. 前記抗体もしくはその結合断片または前記ナノボディが、ヒトのものであるか、ヒト化されているか、またはラクダ科動物のものである、請求項６に記載の化合物。
9. 前記抗体もしくはその結合断片または前記ナノボディがラクダ科動物のものである、請求項６に記載の化合物。
10. 前記ＩＬ－１５が、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項６に記載の化合物。
11. ＩＬ－１５の前記機能的変異体が、配列番号４と比較してＮ７２ＤまたはＮ７２Ａアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の化合物。
12. 前記ターゲティングドメイン部分が抗体もしくはその結合断片またはナノボディを含む、請求項１に記載の化合物。
13. 前記抗体結合断片がｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む、請求項１２に記載の化合物。
14. 前記ＮＫエンゲージングドメインがＣＤ１６を含み、前記ＮＫ活性化ドメインがＩＬ－１５を含み、前記ターゲティングドメインが、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する、請求項１に記載の化合物。
15. 前記ＮＫエンゲージングドメインがＣＤ１６ａを含み、前記ＮＫ活性化ドメインがＩＬ－１５を含み、前記ターゲティングドメインが、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する、請求項１に記載の化合物。
16. 前記ＮＫエンゲージングドメインがＮＫＧ２ｃを含み、前記ＮＫ活性化ドメインがＩＬ－１５を含み、前記ターゲティングドメインが、ＨＩＶに由来するウイルス抗原に選択的に結合する、請求項１に記載の化合物。
17. 前記ドメインのうちの２つを連結する少なくとも１つの隣接配列を含む、請求項１に記載の化合物。
18. 連結された２つの前記ドメインを第３のドメインと連結する第２の隣接配列をさらに含む、請求項１７に記載の化合物。
19. 前記隣接配列が前記ＮＫ活性化ドメインに隣接している、請求項１８に記載の化合物。
20. 第１の隣接配列が、前記ＮＫエンゲージングドメインに対してＣ末端側にあり、第２の隣接配列が、抗ウイルスターゲティングドメインに対してＮ末端側にある、請求項１８に記載の化合物。
21. 第２のターゲティングドメインをさらに含む、請求項１に記載の化合物。
22. 第２のＮＫエンゲージングドメインをさらに含む、請求項１に記載の化合物。
23. 第２のＮＫ活性化ドメインをさらに含む、請求項１に記載の化合物。
24. 配列番号７、２４、２９、または３７である、請求項１に記載の化合物。
25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の化合物と、
    薬学的に許容される担体と
    を含む、組成物。
26. 標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量で請求項１～２５のいずれか一項に記載の化合物を、対象に投与することを含む、方法。
27. 前記標的細胞がウイルスに感染している、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ウイルスがＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ウイルスがＨＩＶである、請求項２８に記載の方法。
30. インビボでのＮＫ細胞の増大を刺激するための方法であって、
    対象におけるＮＫ細胞の増大を刺激するのに有効な量の請求項１～２５のいずれか一項に記載の化合物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
31. 前記対象がウイルスに感染している、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ウイルスがＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ウイルスがＨＩＶである、請求項３２に記載の方法。
34. 対象におけるウイルス感染症を治療する方法であって、
    前記ウイルス感染症を治療するのに有効な量の請求項１～２５のいずれか一項に記載の化合物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
35. 前記対象が、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、またはアデノウイルスに感染している、請求項３４に記載の方法。
36. 前記対象がＨＩＶに感染している、請求項３５に記載の方法。
37. 配列番号６の単離された核酸配列。
38. 配列番号７の単離されたアミノ酸配列。
39. ｃａｍＣＤ１６／ＩＬ－１５／配列番号８の配列を含む、単離されたアミノ酸配列。
40. 配列番号９、１７、２７、２８、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０を含む、単離されたアミノ酸配列。
41. 配列番号１０の単離されたアミノ酸配列をさらに含む、請求項４０に記載の単離されたアミノ酸。
42. ＩＬ－１５に作動可能に連結された配列番号１８を含む、単離されたアミノ酸配列。
43. 配列番号２０～２６の単離されたアミノ酸配列。
44. （ｉｉｉ）配列番号２２、２５、３０または３９の免疫グロブリン重鎖を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドと、配列番号２１、２６、３１または４０の免疫グロブリン軽鎖を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドとをそれぞれ、哺乳動物細胞にコトランスフェクションすること、および
    （ｉｖ）前記哺乳動物細胞から上清を収集すること
    を含み、得られた化合物がウイルス抗原に結合する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の化合物を作製する方法。
45. 前記ウイルス抗原がＨＩＶに由来する、請求項４４に記載の方法。
46. 前記ウイルス抗原がＥｎｖである、請求項４５に記載の方法。
47. 配列番号２１、２２、２５、２６、３０、３１、３９、または４０のアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
48. 薬学的に許容される担体中に配列番号７、２４、２９、３２、３４、３６、および３７を含む、薬学的組成物。
49. 対象を治療する方法であって、薬学的に許容される担体中に配列番号５、７、２４、２９、３２、３４、３６、および３７を含む薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
50. ＡＩＤＳを有するかまたはＡＩＤＳを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、配列番号５、７、２４、２９、および３７を含む薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。

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