CN108693098B - 细胞样本的细胞计数分析方法 - Google Patents

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Abstract

细胞样本的细胞计数分析方法。本发明涉及借助用于显微检查多个细胞样本的显微镜来细胞计数分析多个细胞样本的方法，其中显微镜可以或优选选择性地和/或交替地以透射模式和/或荧光模式、尤其落射荧光模式操作，并且至少一个细胞样本具有至少一个荧光标记。尤其该方法中规定，在透射模式下记录的图像中检测细胞样本的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓，并然后根据细胞样本中细胞或细胞组分的检测到的位置和/或轮廓分析在荧光模式下记录的图像的检测到的强度，和/或在荧光模式的图像中检测细胞样本的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓，并然后根据细胞样本中细胞或细胞组分的检测到的位置和/或轮廓分析在透射模式下记录的图像的检测到的强度。

Description

细胞样本的细胞计数分析方法
技术领域
本发明涉及用于多个细胞样本的细胞计数(cytometric)分析的方法。
背景技术
例如，用于荧光染色细胞的基于图像的分析的细胞计数分析方法在细胞计数法领域是已知的，其中，除了经典细胞计数法中已知的基于图像的细胞计数法的参数或相应特征之外，可用参数或相应特征的数目加倍，因为(可能通过荧光显微镜)在显微镜下记录的细胞样本的相应图像的目标大小(尤其是细胞大小)和其它形态学参数是遵循经典计数法中已知的参数(通常是颜色(或相应波长)、强度和散射光信号)获得的。
现有技术中已知其它方法，借助于这些方法，使用成像和非成像方法来检查样本(诸如组织样本或细胞培养物)的荧光性质。各种方法还使得能够确定个体生物细胞和细胞组分的荧光强度。借助成像时间延迟积分检测器(TDI检测器)(如在US6211955B1中所描述的)，或者借助脉动照射(如在US 5247339中所描述的)，或者通过用激光束扫描样本，例如在流式细胞计数器中或在成像流式细胞计数器中对荧光强度进行定量。
此外，已知流式细胞计数法是一种用于细胞的定量荧光分析的方法。在流式细胞计数法中，使聚焦激光束穿过(染色的)细胞悬液，其中，检测到以这种方式产生的散射光和荧光。在测量期间，个体荧光标记的细胞通过毛细管进行传送，其中，个体细胞流过流动池(flow cell)，在流动池中这些个体细胞被激光激发。细胞中的荧光染料(fluorescentdye)被激光束激发，其结果是，细胞散射激光。在这样做时，检测到光散射和发射的荧光。
用于定量荧光分析的其它方法利用常规落射荧光(epifluorescence)显微镜结合数字成像和随后的图像分析进行荧光定量。在这些方法中使用样本和样本载体，以便可以在诸如微量滴定板(“孔板”)的培养容器中直接分析例如贴壁细胞。
DE 10 2011 075 369 A1描述了一种用于高速记录目标的横向相邻区域的个体图像的方法以及一种用于在连续图像记录周期期间记录目标的个体图像以及后续将个体图像合成为完整的目标图像的显微镜。
出于科学研究和质量控制的目的以及分别针对毒理学或诊断学，已知将细胞加入到液体细胞固定溶液或液体缓冲液中，以对细胞培养物中的荧光样本进行定量，其中，细胞通常在检查过程期间被液体覆盖。
在显微镜检查中，将细胞样本布置在台上的作为样本载体的显微镜板(微量滴定板；孔板)上，其中，台连同样本载体一起从一个位置传送到下一个位置，并且停下来记录图像。然后，样本载体进一步移动。由于样本载体的抖动，待研究的细胞受到加速力和振动的作用，这会引起细胞培养物的变化并且还产生表面波，因此妨碍了透射图像的记录。
另选地，为了防止待研究的样本上的振荡，显微镜的整个光学系统或光学器件的部分相对于样本载体移动，由此因所讨论的显微镜的组件的重量重，难以进行快速移动。
发明内容
本发明的目的包括改进细胞样本的荧光定量，其中，应该减少细胞样本(尤其是贴壁细胞)的负荷(尤其是机械负荷)和曝光，其中，应该有可能尤其对贴壁细胞执行更快的分析。
该目的是通过借助用于显微观察多个细胞样本的显微镜对多个细胞样本进行细胞计数分析的方法来解决的，其中，该显微镜可以或优选选择性地和/或交替地以透射模式和/或荧光模式(尤其是落射荧光模式)进行操作，并且其中，至少一个细胞样本具有至少一个荧光标记，该方法具有以下方法步骤：
-使细胞样本连续地且优选线性地相对于具有至少一个显微镜相机的显微镜的光学系统在一个平面内移动，
-其中，在细胞样本的移动期间，在透射模式或荧光模式下记录细胞样本的子区域的至少一个或更多个图像，并且(优选至少分段地)在荧光模式(尤其是落射荧光模式)下记录细胞样本的同一子区域的至少一个或更多个图像，并且优选地将这些图像数字化，
-其中，透射模式或荧光模式下的细胞样本的同一子区域的至少一个或更多个图像和荧光模式下的细胞样本的同一子区域的至少一个或更多个图像彼此(优选地在位置上(locally))相关联，
-以及a)其中，在透射模式的图像中检测细胞样本的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓，并然后根据细胞样本中细胞或细胞组分的检测到的位置和/或轮廓来分析荧光模式下记录的图像的检测到的强度，和/或b)其中，在荧光模式的图像中检测细胞样本的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓，并然后根据细胞样本中细胞或细胞组分的检测到的位置和/或轮廓来分析透射模式下记录的图像的检测到的强度，和/或c)其中，在荧光模式的图像中检测细胞样本的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓，并然后根据细胞样本中细胞或细胞组分的检测到的位置和/或轮廓来分析另一荧光模式下记录的图像的检测到的强度。
本发明是基于以下思路：具有荧光标记分子的一个或更多个细胞样本相对于显微镜的光学系统移动，其中，交替地i)在透射模式和荧光模式之间交替或ii)优选地只在荧光模式下记录细胞样本的子区域的图片或相应的图像。在显微镜进行交替操作期间，优选在透射模式下，尽管照射时间非常短，但也使得能够(充分)照射图像以进行数字图像分析，检测细胞、细胞结构和/或亚细胞区域的布置，然后记录所检查的子区域的荧光，使得可随后执行荧光定量。
在本发明的范围内，有可能的是，优选排它性地以荧光模式操作显微镜，其中，在细胞样本的移动期间，在第一荧光模式下记录细胞样本的子区域的至少一个或更多个图像，然后借助至少一个显微镜相机，优选至少分段地在第二荧光模式下记录细胞样本的同一子区域的至少一个或更多个图像，随后第一荧光模式下细胞样本的同一子区域的至少一个或更多个图像和第二荧光模式下细胞样本的同一子区域的至少一个或更多个图像彼此(优选地在位置上)相关联。随后，在第一荧光模式的图像中检测细胞样本的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓，并然后根据第一荧光模式下细胞样本中细胞或细胞组分的检测到的位置和/或轮廓来分析第二荧光模式下记录的图像的检测到的强度。
由于通过检测明亮传输通道中的细胞样本中的细胞和细胞组分使得细胞样本的连续移动和非常短的照射时间成为可能，因此能够减少对细胞的影响(诸如，光毒性以及光所引起的其它损害)，其中，同时还减少了影响细胞活力的机械振动或加速力。由此提供了一种简单且快速的方法，并且对关于单个或多个贴壁细胞的细胞信息的定量的侵害性较小。由于这种方法尤其保护细胞，同时与流式细胞计数器分析相反，还可以很容易地在稍后阶段对同一样本重复进行，因此它也非常适用于时间活细胞分析，其中，在多个连续的时间点重复该方法。
使用具有至少一个数码相机的光学显微镜系统，可以从个体细胞内的亚细胞区域获得更多信息。在这种情形下，光学显微镜系统与一个或多个数码相机布置在一起，以便从所有细胞样本的有限视野或者从一个样本区域记录图像。由至少一个显微镜相机数字记录从子区域记录的图像，其中，图像被数字化并且根据成像方法(即以透射模式或荧光模式)进行存储，或者在待研究样本相对于显微镜的光学系统连续移动时直接进行分析。
根据成像方法(即透射模式或荧光模式)，从相互重叠的视场记录图像。然后，将透射模式或(第一)荧光模式下记录的接受检查的子区域的图像与从对应子区域在所述荧光模式或第二荧光模式下记录的对应图像关联，因此可随后进一步研究所关注的细胞样本的区域。
当细胞样本在移动时，在透射模式或荧光模式下记录细胞样本的子区域的至少一个或更多个图像，并然后记录同一子区域的至少一个或更多个图像，其中，因为与先前记录的第一图像相比，细胞样本连续移动，所以在后期的第二图像中记录同一子区域的一个或更多个片段。
根据本发明，提供了一种用于自动分析生物细胞或细胞样本的方法，其中，可以使用显微镜和数字图像分析领域中的方法来检查大量的个体细胞或细胞组分，以便进行荧光强度的定量分析。
另外，该方法的一个实施方式中进一步有利的是，在时间上偏移(尤其是更晚或更早)的透射模式下的细胞样本的子区域的至少一个图像相对于透射模式下的细胞样本的子区域的预定第一图像根据时间偏移或者根据细胞样本相对于至少一个显微镜相机在预定第一图像与时间偏移图像之间的相对位移而被修改，使得尤其是第一预定图像和时间偏移图像与细胞样本的同一子区域关联。
因为两个时间偏移图像是从细胞样本的被检测子区域中记录的，所以透射模式下的两个图像根据细胞样本在图像记录间隔期间的位移通过虚拟位置校正彼此正确叠加。
另外，该方法的实施方式的区别特征在于以下事实：相对于荧光模式下细胞样本的子区域的预定第一图像的荧光模式下细胞样本的子区域的至少一个时间偏移(尤其是更晚或更早)图像根据时间偏移或者根据细胞样本相对于至少一个显微镜相机在预定第一图像与时间偏移图像之间的相对位移而被修改，使得尤其是第一预定图像和时间偏移图像与细胞样本的同一子区域关联。
如同透射模式下记录的同一子区域的图像一样，对于荧光模式下记录的同一子区域的图像，在不同时间记录的子区域的图像考虑到细胞样本在不同时间记录的图像之间的位移路径在它们被记录下之后也被彼此叠加，因为细胞样本连续地(且优选线性地)在这两个图像之间移动。
此外，该方法的一个实施方式中被认为有利的是，细胞样本的移动将被与或与细胞样本的子区域的图像的时间顺序同步。
根据细胞样本相对于显微镜的优选静止的光学系统的连续(优选均匀的)运动(借助于该运动，在透射模式和荧光模式下记录图像)，连续记录细胞样本的子区域的图像或相应图片并且按预定的规则间隔进行保存，并然后在后续方法步骤中进行分析和评估。
根据本发明，提供或提出了一种用于移动细胞样本的设备，其中，所述设备具有控制设备，借助于该控制设备，在细胞样本上的预定位置处生成触发信号，优选电子触发信号，以便相机拍摄图像并且将针对不同图像类型(即，透射模式或荧光模式下的图像)的至少一个光源同步。
此外，该方法的有利实施方式中规定，在优选聚焦的第一平面中记录透射模式下细胞样本的子区域的至少一个图像，并且在与第一平面不同的第二(优选散焦(defocused))平面中记录透射模式下细胞样本的子区域的至少一个图像。
此外，有利地，在荧光模式下(尤其是落射荧光模式下)记录细胞样本的子区域(或相应地同一子区域)的至少两个图像。
另外，一个实施方式中的该方法的区别特征在于以下事实：在已经在透射模式和荧光模式下记录了细胞样本的子区域的图像之后，针对与细胞样本的在前子区域相邻(尤其是紧邻)的细胞样本的子区域，在透射模式和/或荧光模式下记录另外的图像，其中，针对相邻子区域，尤其以与细胞样本的在前(优选第一)子区域相同的方式来记录所述另外的图像。
通过记录细胞样本的多个相邻子区域的多个图像，能够检查细胞样本中的更大区域，从而允许进行更大数量的细胞样本的自动化细胞计数分析。
此外，在该方法的一个实施方式中有利的是，针对细胞样本的多个子区域的透射模式下细胞样本的图像全部被组合成透射模式下的一个完整图像，和/或针对细胞样本的多个子区域的荧光模式下细胞样本的图像全部被组合成荧光模式下的一个完整图像。
在实现该方法期间另外优选的是，优选地，通过自动化装置来分析每种图像类型(尤其是透射模式或荧光模式下)的图像或每种图像类型(尤其是透射模式或荧光模式下)的完整图像。为此目的，使用源自数字图像处理和分析的方法，针对例如个体细胞或细胞组分的存在来检查合适记录模式(优选地，透射模式)下的图像或相应图片，并且识别或确定被检测目标的位置和/或轮廓(即细胞样本的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓)，由此一旦执行了虚拟位置校正，就可以对在另一种成像模式下拍摄的图片中的相同目标的荧光强度进行定量。优选地，在透射模式下直接识别和确定针对目标的目标掩模或相应的分段掩模，因为当确定在荧光模式下拍摄的图片中的分段掩模时，测量由于缺乏独立性而可能会出现误差。确定荧光模式下拍摄的图片中的分段掩模或相应目标掩模非常适于使用显著更长照射时间并因此实现了更高信噪比或相应更高对比度的情况。
此外，在该方法的一个实施方式中，根据透射模式下的图像或根据透射模式下的完整图像来生成相衬(phase-contrast)图像是实际的。在该方法的一个实施方式中还公开了，在透射模式下获得的图像已经被记录为相衬图像。
尤其是，可以根据相衬透射图像来确定研究所关注的细胞样本的区域，由此在透明或半透明细胞样本(诸如，未染色细胞)中增加图像的对比度。例如，通过Zernicke相衬法或者通过差分干涉对比(DIC)法来生成相衬图像。
另外，还可以通过使用散焦透射图像来获得相衬图像，其中，使用因散焦而引起的像差所引起的相衬，其中，能够随后通过对图像进行数字图像处理来使对比度最大化。
还可以通过定量相位测量或估算方法(诸如，数字全息方法或基于叠层成像(ptychography)的方法来获得相衬图像。
还公开了，也可以获得基于强度传播方程(TIE)法的相衬图像。
此外，在一种配置中，能够通过利用光学系统或相应的成像系统的纵向色差特性来实现散焦图像。在这种情况下，在一种配置中规定随后用具有不同波长的光来照射样本。另选地，借助于RGB相机或者在细胞样本与至少一个相机之间的光学路径中使用彩色滤光器来记录图像。
该方法中还规定，还在透射模式下获得子区域的RGB透射图像。
借助所获得或创建的相衬图像，能够使用图像来确定个体细胞样本中的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓。关于细胞和/或细胞组分的位置和/或轮廓信息使得能够测量局部关联的荧光图像中的强度，并且这些测量与细胞样本中识别出的细胞和/或细胞组分关联。尤其是，可以使用强度测量来酌情将各种细胞类型或细胞特性归类。
为了执行该方法，例如，提供具有带有相机的优选自动化宽视野显微镜的显微镜设备，用于对活细胞进行检查和成像。在这种情况下，用针对透射模式的亮场方法或相衬方法和针对荧光模式的反射方法来操作该设备。
因此在“细胞计数模式”下操作该方法，其中，在非常快速的连续成像模式下，借助上述的创造性方法来检测细胞和细胞结构并确定对应的荧光强度。在该模式下获得例如常常是通过基于流式细胞计数法的分析获得的关于细胞样本的数据或相应的图像数据。与用于悬浮在液体中的非贴壁细胞的流式细胞计数法相比，根据本发明的方法还允许在细胞计数模式下用于微量滴定板或相应的孔板中的贴壁细胞。
在后续筛选模式下，可以在透射模式和荧光模式下自动记录细胞样本的多个子区域的高质量图像。
在实现该方法期间，样本或相应的细胞样本在固定物镜前的X-Y平面中移动，使得整个区域通过显微镜的相机连续成像。细胞样本在X-Y平面内连续地且优选线性地移动。然后，将以这种方式获得的细胞样本的子区域的图像可选地合并成更大的无缝图像，其中，部分图片或相应的部分图像因此被合并。
在细胞样本相对于显微镜物镜连续移动期间，以规则的间隔连续获得细胞样本的子区域的图像。这里应理解的是，在透射模式下连续移动期间，通过自动对焦来调节图像位置。例如，图像位置被设置在上基板平面的焦点上或根据不同方法进行设置。
在拍摄细胞样本的图像的同时，记录细胞样本的位置数据或相应的与每个所获得的图像相对应的细胞样本载体的位置数据。
因此，在实现该方法时规定，同时或快速连续地在至少两个Z平面中以透射模式检测透射光。
通常，图像同样被记录在一个或更多个荧光通道中。在荧光模式下记录的子区域图像可能质量较差，不一定用于可视化。相反，荧光模式下的图像被记录用于预定区域上的强度测量。
因为在记录图像期间或相应地针对记录图像使用非常短的光脉冲，所以细胞样本暴露于光非常短的时间，并因此防止了样本载体连续移动期间图像变模糊。尤其是，样本的照射时间通常短于100μs，尤其短于50μs。优选地，使用发光二极管(LED)来照射样本。
除了针对细胞样本的图像的记录时间显著减少之外，根据本发明的方法的另一优点在于，由于细胞样本被布置在微量滴定板(“孔板”)上并且微量滴定板可被移动以便借助显微镜系统来进一步记录图像，因此细胞样本可以被多次检查以便进一步进行图像记录和分析。
通过结合权利要求书和附图以及示图对本发明实施方式的描述，本发明的其它特征将变得显而易见。可通过个体特征或通过多个特征的组合来实现根据本发明的实施方式。
附图说明
在不限制总体发明构思的情况下，下面将参照附图和示图基于示例性实施方式来描述本发明，其中，对于文本中没有提及的所有细节，明确参照附图和示图。以下附图示出：
图1是用于在显微镜下检查细胞样本的布置的示意图；
图2是用于执行细胞样本的细胞计数分析的方法的记录过程的示意图；
图3是用于细胞样本的自动显微观察和分析的方法步骤的示意图，
图4是个体荧光染色的细胞核的示例性图像数据和众多细胞核的相关细胞计数评估。
具体实施方式
在图1中示意性地示出了用于在显微镜下检查细胞样本的基本布置10，借助于该基本布置10，可以执行用于细胞样本的细胞计数分析的方法。
布置10具有光源12，借助于该光源12，光通过聚光透镜14透射到样本载体16上。在这种情况下，样本载体16被布置在移动台18上，该移动台18可以通过电机22在X-Y平面中移位。借助优选配置为发光二极管或具有发光二极管的光源12，在透射模式下照射样本载体16上的细胞样本，并因此穿过细胞样本的光随后被物镜24和数码相机28检测到。以这种方式，通过数码相机28数字记录细胞样本的子区域的图像。
在光穿过台18与物镜24之间的细胞样本之后，可以在光源12与数码相机28之间的光束路径中设置装置26，以在Z平面中提供聚焦。此外，在一个实施方式中，可以在透射模式下在光的光束路径中的物镜24与数码相机28之间设置另一光学元件30，以便记录细胞样本的两个平行Z平面中的图像。
光源12优选被配置为发光二极管(LED)，其中，光源12产生持续的(例如，少于50μs)的光闪烁。也可以规定，光源12具有产生不同波长光的多个发光二极管。可以同时或相继激活发光二极管。
移动台18例如在X-Y平面中以20mm/s的速度连续移动。
数码相机28所记录的图像被发送到计算机32，使得数字化的图像可以被计算机32保存和处理。同时，计算机32被配置为电机22的控制装置并且与电机22相联接，使得台18被同步地控制并且以预定速度移动。结果，样本载体16的移动以位置准确方式与数码相机28所记录的图像同步。
此外，计算机32还与光源12(这里未示出)相联接，由此光源12的电路同样被同步。
用于产生荧光的光源34被布置在台18的下方，以便在透射模式下记录了子区域的细胞样本的图像之后，以后续荧光模式照射细胞样本。借助所产生的荧光并且例如在穿过激发滤光器之后，所产生的光被分束器36朝向细胞样本(即，沿台18的方向)偏转或相应地反射，使得短波激发光射入样本载体16中的细胞样本。细胞样本提供有荧光标记等，使得在激发光被吸收之后立即发射较长波的荧光，由此所辐射的荧光射入分束器36，并且由于分束器36是半透明的，较长波的荧光穿过分束器36而未发生偏转，并且有可能在穿过阻挡滤光器之后，被数码相机28记录。
数码相机28所拍摄的图片是基于细胞样本所辐射的荧光。优选地，在荧光模式下记录细胞样本的子区域的多个图像。
在图2中示意性地示出了例如借助显微镜(参见图1)对细胞样本的子区域的图像的记录过程，其中，显微镜在透射模式和荧光模式下交替操作。然后，以这种方式获得的图像被用于细胞样本的细胞计数分析。
在图2的上部中指示了带有细胞样本的样本载体的相应位置，其中，细胞样本相对于显微镜的光学系统的显微镜相机从左向右连续移动。在样本载体的连续移动期间，在图像周期中连续记录细胞样本的第一子区域a的四个图像1a、2a、3a、4a。在接下来的图像周期中，通过显微镜系统的数码相机记录细胞样本的子区域b的图像1b、2b、3b、4b。类似地，在第二图像周期之后，在第三图像周期中连续记录图像1c、2c、3c、4c。此后，在第四图像周期中记录并保存细胞样本的子区域d的图像1d、2d、3d、4d。
在每个图像周期中，在样本载体上的细胞样本沿相对于固定显微镜系统的方向连续地线性移动时，在四个图像通道(1、2、3、4)中连续记录相应子区域a、b、c和d等的四个图像。每个子区域a、b、c或d的第一个图像1a、1b、1c、1d作为第一透射图像是透射光方法中的聚焦光场图像。每个子区域a、b、c或d的最后一个图像4a、4b、4c、4d是相应子区域的散焦光场图像。
随后，作为图像周期的第三(3a、3b、3c、3d)和第四(4a、4b、4c、4d)图像，子区域a、b、c或d等的两个不同图像因此被记录为各种波长的荧光图像。细胞样本的子区域a的第一图像周期的四个图像1a、2a、3a、4a各自被分别记录并且被分别保存在例如单独的存储通道中。然后，对于每周期四个不同图像，在第二图像周期中，透射图像1b、2b和荧光图像3b，4b二者都因此各自被保存在适当存储通道中。
在已经检测了多个子区域或细胞样本的全部之后，相应成像模式下子区域的相应关联图像彼此(优选在位置上)相关联。
此外，为了对细胞样本进行细胞计数评估，考虑到细胞样本的位移移动，根据时间偏移来对子区域的时间偏移图像进行修改，并因此相应子区域的图像周期的四个图像彼此在位置上相关联。如图2的下部区域中所示，使用该数字或相应的虚拟图像位移，对于子区域a，图像1a、2a、3a、4a例如彼此在位置上相关联。由于图像1a、2a、3a中的每一个不完全覆盖子区域a，因此来自与所讨论子区域重叠的相邻子区域的图像1b、2b、3b同样与子区域a成比例地关联。结果，子区域a因此被完全成像。对于图像1b、2b、3b、4b连同图像1c、2c、3c以及对于子区域b、c和d的图像周期中的另外的图像，这也类似地发生。
作为后处理和数字图像位移的结果，在考虑到带有细胞样本的样本载体的位移路径和位移时间的情况下，图像彼此在位置上正确关联。对于在对应成像模式的相应图像之间的接合区域中的图像重叠，在后处理期间，可以使用常规方法使图像彼此适应并且可以将图像组合成一个大图像或相应成像模式下的对应的完整图像。
图3中示意性地示出了用于尤其带有贴壁细胞的细胞样本的自动显微观察和分析的方法步骤。
在这种情况下，细胞样本的子区域的图像被记录在不同的通道中，其中，在透射模式和荧光模式下交替记录子区域。在图3示出的过程中，首先，在显微镜系统的透射模式下将图像记录在通道1中，其中，样本载体一直在移动。然后，基于带有细胞样本的样本载体的位置数据，确定样本载体或相应地样本中的图像位置。这里，带有细胞样本的样本载体的移动是由控制单元控制的，由此可以基于来自控制单元的控制数据来确定图像位置。随后执行诸如对比度优化的数字图像处理，以便在明亮的透射模式下对子区域进行成像。然后，合适的目标掩模(优选自动)使用适当的识别算法等在图像通道1中检测细胞或亚细胞结构的轮廓。
一旦细胞样本的第一子区域已经被成像，子区域的荧光图像就被记录在下游图像通道2中，其中，然后基于来自用于样本载体的控制单元的控制数据来确定子区域的图像的图像位置，由此，考虑相对于第一通道中的图像记录的位移路径和位移时间，随后借助数字图像位移来调整图像记录的位置。如有必要，可以执行数字图像处理，诸如所识别的信号的噪声优化。此后，对于图像通道1和图像通道2，在细胞样本连续移动的同时，在细胞样本的荧光模式或透射模式下交替地记录对应的图像记录，其中，在后处理步骤中，使所获得的图像数据相对于前一图像数字位移。如有必要，图像记录的对应数字图像处理发生在对应的通道中。
在将部分图像内的所识别或预定的目标掩模发送到相应通道中之后，接着通过高内涵筛选分析工具或细胞计数分析程序来分析已经获得的强度测量值。这里，可以使用细胞计数数据分析来测量预定目标掩模内的透射模式或荧光模式下检测到的光的强度。高内涵筛选(HCS)是用于自动记录和分析细胞或细胞样本的图像的方法或相应的过程，其中，借助图像处理或相应的图像处理程序来评估、展示和分析所记录的图像。以这种方式，可以通过细胞计数来分析细胞样本。因此，这种分析使得能够例如对细胞进行分类。以这种方式获得的分类也可以用作细胞亚组的快速预分类，该分类的激活之后在过程中自动逐步地激活，以便可以按更高的显微分辨率进行记录和分析它们。(数据)分析可以按直方图和散点图以及通过细胞的分类和种群的识别等来呈现。
图4示出了众多细胞核的图像数据的上部部分中的个体荧光染色的细胞核的示例性记录图像和下部部分中的相应的细胞计数评估。
这些图例示了利用透射和分割以及细胞周期的具有G1期和G2期的荧光(具有低信号)的分析进行的基于图像的细胞计数分析。对于示例A，这里示出的图像和评估是在细胞样本的逐步移动期间进行的，其中照射时间为100ms。在第二示例B中，细胞样本逐步移动并且以1ms的照射时间进行照射。在示例C中进行细胞样本的连续移动，其中，照射时间为50μs。
示例A、B和C展示了利用惯用照射参数的常规图像记录(A)以及利用尤其短的照射时间的常规图像记录(B)和根据本发明利用非常短的照射时间的图像记录(C)，其中样本载体连续移动。在所示出的所有情况下，直接基于荧光信息的定量的所示出的散点图(下部)中的信息内容是可比较的，尽管在根据本发明的情况C下样本上的负荷显著降低并且数据记录速度显著增加。
在图4中，基于示例示出了能够使用根据本发明的方法进行的分析的基本性质。示例A的上部部分示出包括单细胞核的显微图像的一部分，该部分是借助传统显微镜在荧光模式(即，显微镜台逐步移动并且照射时间在100ms的范围内)下记录的。在示例A的图像的相关联的下部部分中，通过散点图来表示样本中众多细胞核的相关联的细胞计数数据分析。
示例性应用的目的是为了在散点图中能够辨别两个不同的集群(cluster)，这两个集群可以在有丝分裂期G1和G2中被识别为细胞核的亚群，在散点图中，展示了表面上检测到的荧光的平均强度。在示例A的情况下，在技术上将能够根据荧光图像直接推导出位置和轮廓数据。替代地，选择样本中的同一位置的透射图像，使得可独立于荧光图像来确认该信息。所示出的细胞的分割掩模或相应地目标掩模被绘制在上部图像中并且被指定为M。
在所示出的第二示例(示例B)中，描绘了与示例A相同的情况，但照射时间较短，为1ms。在这种情况下，原则上仍然可以根据荧光图像直接确定细胞的分割掩模，但是这样做对于进一步分析而言是不稳健的。根据现有技术，对于显微镜台逐步移动时的较快图像记录而言，显著较短的照射时间是不合适的，因为为了在显微镜台移动时的激活、加速和减速过程而扩展的典型时间量相对较高，并且在记录图像期间出现的力和振动对活细胞是有害的。
在示例C中示出根据本发明的情况。由于显微镜台连续移动，极短的照射时间(在本情况下为50μs)是合理的并且允许非常高的图像记录速率，同时产生作用于细胞和液体的非常低的力和振动。
由于照射时间极短，光对细胞的伤害被降至最低。虽然所记录的细胞的荧光图像不适于执行自动细胞分割以便直接获得或相应地确定适当的目标掩模或相应的分割掩模以便进行评估和分析，但是使用从透射模式确定的分割掩模或目标掩模使得能够执行细胞的荧光强度的稳健定量，尽管荧光图像的信噪比极低。在下部散点图中，众多测量的细胞核的强度数据的与应用相关的表示清晰地示出了与示例B(根据现有技术)相同的亚群分类。
所有指定的特征(包括单独从附图获得的特征以及结合其它特征公开的单个特征)被单独和组合地视为是本发明必要的。可以通过单个特征或通过多个特征的组合来实现根据本发明的实施方式。在本发明的范围内，以“尤其”或“优选”表征的特征被理解为可选特征。
参考标号的列表
10 布置
12 光源
14 聚光透镜
16 样本载体
18 台
22 电机
24 物镜
26 装置
28 数码相机
30 光学元件
32 计算机
34 光源
36 分束器

Claims (15)

1.一种用于借助显微镜对多个细胞样本进行细胞计数分析的方法，所述显微镜用于在显微镜下检查多个细胞样本，其中，所述显微镜能够在透射模式和/或荧光模式下进行操作，或者在透射模式和/或荧光模式下进行操作，并且其中，至少一个细胞样本具有至少一个荧光标记，所述方法具有以下方法步骤：
-使所述细胞样本相对于具有至少一个显微镜相机的所述显微镜的光学系统在一个平面中连续移动，
-其中，在所述细胞样本的所述移动期间，借助所述至少一个显微镜相机，在所述透射模式或所述荧光模式下记录所述细胞样本的子区域的至少一个或更多个图像，并且在所述荧光模式下记录所述细胞样本的同一子区域的至少一个或更多个图像，
-其中，在考虑到带有所述细胞样本的样本载体的位移路径和位移时间的情况下，所述透射模式或所述荧光模式下的所述细胞样本的所述同一子区域的所述至少一个或更多个图像和所述荧光模式下的所述细胞样本的所述同一子区域的至少一个或更多个图像彼此在位置上相关联，
-并且其中，在所述透射模式的所述图像中检测所述细胞样本的细胞或细胞组分的位置和/或轮廓，并然后根据所述细胞样本中细胞或细胞组分的所检测到的位置和/或轮廓来分析在所述荧光模式下记录的所述图像的所检测到的强度，
和/或
其中，在所述荧光模式的所述图像中检测所述细胞样本的细胞或细胞组分的所述位置和/或轮廓，并然后根据所述细胞样本中细胞或细胞组分的所检测到的位置和/或轮廓来分析在所述透射模式下记录的所述图像的所检测到的强度，
和/或
其中，在荧光模式的所述图像中检测所述细胞样本的细胞或细胞组分的所述位置和/或轮廓，并然后根据所述细胞样本中细胞或细胞组分的所检测到的位置和/或轮廓来分析在第二荧光模式下记录的所述图像的所检测到的强度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透射模式下的所述细胞样本的子区域的至少一个时间偏移图像相对于所述透射模式下的所述细胞样本的所述子区域的预定第一图像根据时间偏移或者根据所述细胞样本相对于所述至少一个显微镜相机在所述预定第一图像与所述时间偏移图像之间的相对位移而被修改，使得所述预定第一图像和所述时间偏移图像与所述细胞样本的所述同一子区域相关联，其中所述时间偏移是更晚或更早。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光模式下的所述细胞样本的子区域的至少一个时间偏移图像相对于所述荧光模式下的所述细胞样本的所述子区域的预定第一图像根据时间偏移或者根据所述细胞样本相对于所述至少一个显微镜相机在所述预定第一图像与所述时间偏移图像之间的相对位移而被修改，使得所述预定第一图像和所述时间偏移图像与所述细胞样本的所述同一子区域相关联，其中所述时间偏移是更晚或更早。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一个所述细胞样本相对于所述显微镜的所述光学系统在一个平面中连续且线性地移动。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显微镜能够选择性地和/或交替地在透射模式和/或荧光模式下进行操作，或者所述显微镜选择性地和/或交替地在透射模式和/或荧光模式下进行操作。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显微镜能够在透射模式和/或落射荧光模式下进行操作，或者所述显微镜在透射模式和/或落射荧光模式下进行操作。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，借助所述至少一个显微镜相机在所述荧光模式下至少分段地记录所述细胞样本的所述同一子区域的至少一个或更多个图像，和/或所述图像被数字化。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞样本的所述移动与所述细胞样本的所述子区域的所述图像的时间顺序同步。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在第一平面中记录所述透射模式下的所述细胞样本的所述子区域的至少一个图像，并且在与所述第一平面不同的第二平面和/或散焦平面中记录所述透射模式下的所述细胞样本的所述子区域的至少一个图像。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述荧光模式或落射荧光模式下记录所述细胞样本的所述子区域的至少两个图像。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在已经在所述透射模式和/或所述荧光模式下记录了所述细胞样本的所述子区域的所述图像之后，针对所述细胞样本的与所述细胞样本的在前子区域相邻的子区域或紧邻的子区域，在所述透射模式和/或所述荧光模式下记录另外的图像。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，针对所述相邻的子区域，以与所述细胞样本的所述在前子区域或第一子区域相同的方式来记录所述另外的图像。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透射模式下的所述细胞样本的针对所述细胞样本的多个子区域的所述图像全部被组合成所述透射模式下的一个完整图像，和/或所述荧光模式下的所述细胞样本的针对所述细胞样本的多个子区域的所述图像全部被组合成所述荧光模式下的一个完整图像。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，对所述透射模式或所述荧光模式下的所述图像或者所述透射模式或所述荧光模式下的所述完整图像进行分析。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，根据所述透射模式下的所述图像或者根据所述透射模式下的所述完整图像生成相衬图像。
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