CN108690003B - 含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物及其制备方法和应用，该香豆素类衍生物的具体化合物结构为7‑[6‑(2‑甲基咪唑)己氧基]香豆素。通过7‑羟基香豆素与1,6‑二溴己烷发生烷基化反应制备7‑(6‑溴己氧基)香豆素，由7‑(6‑溴己氧基)香豆素与2‑甲基咪唑发生取代反应制得7‑[6‑(2‑甲基咪唑)己氧基]香豆素，该化合物对鲤春病毒血症病毒等弹状病毒具有良好的抗病毒及杀灭作用。

Description

含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及抗弹状病毒活性物质，具体涉及含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物(7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素)及其制备方法和抗病毒活性的应用。
背景技术
香豆素类化合物是一类重要的有机杂环化合物，具有抗凝血、抗肿瘤、杀虫、抑菌、抗病毒等广泛的生物学活性，广泛的应用于医药和农药领域。自鲤春病毒血症病毒和传染性造血器官坏死病病毒被分离、鉴定，研究人员一直在努力寻找可有效防控这两种弹状病毒的手段。渔用疫苗的研究、应用和高效、低毒、低残留、环境污染小的无公害水产渔药基础创新研究及产业化是当前控制病害发生、保障水产品安全和生态安全的有效手段。然而，渔用疫苗大规模的商业化以及在世界范围内推广应用进程仍然十分缓慢。另外，病原体的变异和抗原的多样性也是影响渔用疫苗使用最重要的因素之一。因此，药物防治技术研究对于鲤春病毒血症和其它病毒病的防控与健康养殖有重要意义。
香豆素类衍生物的构效研究目前尚未涉及其抗病毒活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物，该香豆素类衍生物为7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素，结构如式1所示：
Figure BDA0001744395310000011
其中，R为2-甲基咪唑。
上述含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
第一步，将4.8～5.0g 7-羟基香豆素以及13.8～14.0g无水碳酸钾加入溶剂(例如丙酮)中后于20～25℃下搅拌2～3h得物料A，向物料A中加入22～24g 1,6-二溴己烷后于60～65℃下回流反应20～24h，反应后减压蒸除溶剂得物料B，向物料B中加水后用氯仿进行萃取，萃取得到位于底层的有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得固体粗品，该固体粗品经柱层析分离纯化，得到7-(6-溴己氧基)香豆素，结构如式2所示：
Figure BDA0001744395310000021
第二步，将0.6～0.7g 7-(6-溴己氧基)香豆素以及1.3～1.5g无水碳酸钾加入溶剂(例如乙腈)中后于20～25℃下搅拌1～2h得物料C，向物料C中加入0.5～0.6g 2-甲基咪唑后于20～25℃下搅拌20～24h，然后减压蒸除溶剂得物料D，向物料D中加水后用氯仿进行萃取，萃取得到位于底层的有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得固体粗品，该固体粗品经柱层析分离纯化，得到7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素，结构如式3所示：
Figure BDA0001744395310000022
优选的，所述减压浓缩的温度为45～60℃；所述柱层析采用硅胶作为层析柱填料，以石油醚/乙酸乙酯混合液或氯仿/甲醇混合液为洗脱试剂，石油醚或氯仿与乙酸乙酯或甲醇的体积比为4～10:1。
上述含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物在制备抗病毒药物或用于杀灭体内外病毒的药物中的应用。
优选的，所述病毒为弹状病毒，例如鱼类等水产动物鲤春病毒血症病毒。
本发明的有益效果体现在：
本发明公开的含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物为7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素，对鲤春病毒血症病毒等弹状病毒具有良好的杀灭作用，可应用于防治病毒病害。
本发明通过7-羟基香豆素与1,6-二溴己烷发生烷基化反应制备7-(6-溴己氧基)香豆素，由7-(6-溴己氧基)香豆素与2-甲基咪唑发生取代反应制得7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素，目标化合物容易分离，产率较高。
附图说明
图1为7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素的总合成路线示意图；
图2为图1中7-(6-溴己氧基)香豆素的合成路线示意图；
图3为图1中7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素的合成路线示意图；
图4为7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素对SVCV N、P、M和G蛋白表达的抑制率曲线；
图5为7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素作用下感染SVCV的EPC细胞形态学显微照片；
图6为10mg/L 7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素处理48h和72h后EPC细胞内凋亡小体染色结果；
图7为10mg/L 7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素处理48h和72h后SVCV感染EPC细胞凋亡率。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。
本发明提供了一种化学合成的香豆素衍生物，该香豆素类衍生物抗病毒效果优良，且合成过程相对简单、收率高、易于转化。
在合成、筛选7-取代香豆素类衍生物的研究过程中，发现7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素对鲤春病毒血症病毒具有良好的杀灭活性，具有防治病毒病害的应用价值。化合物7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素可按照如图1所示的合成路线制备。
(一)化合物的制备
(1)7-(6-溴己氧基)香豆素(中间体化合物)的制备
参见图2，将4.86g(30mmol)购买得到的7-羟基香豆素、13.8g无水K2CO3(100mmol)以及120mL丙酮加入到250mL圆底烧瓶中，室温搅拌2h后，向所述圆底烧瓶中再加入22g(90mmol)1,6-二溴己烷，60℃下回流反应24h。减压蒸除(45℃，0.05MPa负压)反应体系中的丙酮，向所述圆底烧瓶中加入100mL蒸馏水并用氯仿萃取(150mL×4)，合并下层有机相；向有机相中加入20～30g无水硫酸钠静置过夜，过滤除去硫酸钠固体、减压浓缩(45℃，0.05MPa负压)得固体化合物粗品。粗品经硅胶柱层析(V石油醚:V乙酸乙酯＝4:1)分离纯化，TLC检测收集含有中间体化合物的洗脱部分，减压浓缩除去洗脱试剂(55℃，0.05MPa负压)，得6.63g白色针状固体。
(2)7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素(目标化合物，简称化合物1)的制备
参见图3，向含有40mL乙腈的100mL圆底烧瓶中加入0.65g(2mmol)7-(6-溴己氧基)香豆素以及1.38g(10mmol)无水K2CO3，室温搅拌1h后向所述圆底烧瓶中再加入0.53g(6mmol)2-甲基咪唑，继续室温下搅拌24h，反应完毕，减压蒸除溶剂(70℃，0.07MPa负压)，向所述圆底烧瓶中加入30mL去离子水并用氯仿萃取(50mL×3)，合并下层有机相；向有机相中加入20～30g无水硫酸钠静置过夜，过滤除去硫酸钠固体、减压浓缩(45℃，0.05MPa负压)得固体化合物粗品。粗品经硅胶柱层析(V氯仿:V甲醇＝10:1)分离纯化，TLC检测收集含有目标化合物的洗脱部分，减压浓缩除去洗脱试剂(55℃，0.05MPa负压)，得0.589g白色胶状固体。
(3)中间体化合物和目标化合物结构数据列于表1、2中：
表1.化合物的性状
Figure BDA0001744395310000041
表2.化合物的1H NMR、13C NMR与ESI-MS数据
Figure BDA0001744395310000042
从表1可以看出，本发明提供的中间体化合物与目标化合物的制备方法具有较高的产率，从表2可以确定中间体化合物与目标化合物的结构，即通过williamson反应合成中间体化合物，表2中氢谱中4.03-1.46，碳谱中的33.87-25.32为烷烃侧链的化学位移，这证明反应的正确性。中间体化合物与2-甲基咪唑通过取代反应生成目标化合物，表2中氢谱的6.90-6.87,2.35和126.48,120.82,12.47等为2-甲基咪唑的化学位移，这证明反应产物结构的正确性。
(二)化合物1(7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素)抗鲤春病毒血症病毒活性测定
(1)试验材料
病毒材料：鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)，株型号0504，来源为大连海洋大学水产与生命学院；感染细胞系：鲤上皮瘤细胞(Epitheliomapapulosum cyprini cell，EPC)，来源于中国水产科学研究院长江水产研究所。
待测药液的配制：
准确称取500mg待测化合物1，分别置于10mL容量瓶中，加二甲基亚砜(DMSO)溶解并定容，即得浓度为50mg/mL的待测药液，冰箱保存(4℃或-80℃)，备用。
细胞培养、病毒增殖及滴度检测：
从冰箱中取出冻存的EPC细胞，用含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的M199细胞培养基(含100IU/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)进行细胞复苏。待细胞生长稳定后，对其进行传代培养，培养箱温度维持在25±0.5℃，CO2浓度为5％。根据细胞生长密度及状态，每2～3天传代一次。
从液氮中取出冻存的SVCV病毒悬液，37℃水浴快速溶解复苏。用无血清的M199培养基漂洗25mL细胞培养瓶长至80％～90％的EPC细胞，按体积比为1％接种病毒悬液，25℃感染2h，在此期间培养瓶需要摇晃3～5次。感染结束后及时吸出病毒液，并向培养瓶中加入细胞维持液(含5％FBS M199细胞培养基)，培养温度为25℃。48～96h后，利用倒置显微镜观察EPC细胞感染病毒的情况，待80％以上细胞出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)时，收取培养瓶中的病毒，并分装于2mL冻存管，液氮中保存、备用。
向96孔细胞培养板中加入密度为1×104/孔的EPC细胞100μL，25℃培养16～24h。待细胞生长至80％～90％时，向其中接种稀释度为101～1010的病毒液100μL/孔，每个稀释度设置8个平行孔，25℃培养箱中培养2h。孵育结束后，将病毒液回收，用M199培养基漂洗2次，添加100μL细胞维持液继续培养96h。实验设置3组平行，每隔24h观察记录各稀释度单层细胞的CPE现象，并记录相应孔数，按照Reed-Muench法计算SVCV的半数组织细胞感染量(tissue culture infective dose，TCID50)。
(2)化合物1抗病毒活性检测
进行抗病毒活性测定前，利用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测化合物1对EPC细胞的毒性作用。根据试剂盒说明书要求，将密度约为1×104/孔细胞接种于96孔板中，放置在25℃、二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中培养约16h；待细胞在96孔板中覆盖80～90％时，加入不同浓度的化合物1继续培养48h，然后利用全波段酶标仪在450nm处检测吸光值。根据以下公式计算得到细胞增殖率。
细胞增殖率/％＝(OD处理组－OD空白组)/(OD对照组－OD空白组)×100
根据试验结果，判定化合物1对EPC细胞的毒性作用，然后设定一系列药物浓度梯度(0.1、0.25、0.63、1.6、4、10和25mg/L)，测定化合物1抗SVCV的有效活性浓度。具体操作步骤如下：
a)将密度为1×105/孔的EPC细胞接种于12孔细胞培养板中，25℃培养16～24h，待细胞生长至单层时，吸出培养基，M199培养基漂洗2～3次，加入SVCV稀释液(1×103TCID50，M199培养基稀释)，25℃孵育2h；
b)用细胞维持液将母液浓度为50mg/mL的化合物1稀释至检测浓度。病毒孵育2h后，吸出病毒液，M199培养基漂洗2～3次，加入新鲜配制的化合物1稀释液或细胞维持液(对照组，含0.02、0.2或0.5‰DMSO)，25℃继续培养48h；空白组即不含DMSO和化合物1的细胞维持液。
c)化合物1暴露48h后，将药液吸出，0.1M PBS洗涤EPC细胞2～3次，用含EDTA、浓度为0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后1000rpm、5min离心收集样品，弃去上清后向收集的细胞内加入TRIzol试剂，提取样品总RNA。
总RNA提取具体方法如下：
a)将含EPC细胞的TRIzol液转移至1.5mL无菌无酶的EP管中，用无菌枪头反复吹打直至管底无沉淀；
b)每1mL TRIzol加入200μL氯仿，然后涡旋振荡15s使溶液充分乳化，室温静置2～3分钟，12000g、4℃离心15分钟；
c)小心吸取上层水相500～600μL转移至新的无菌无酶EP管中，再加入等体积的异丙醇，上下颠倒EP管使液体充分混匀，室温静置10分钟，12000g、4℃离心10分钟；
d)吸弃上清液，沿管壁缓慢加入1mL 75％的乙醇，上下颠倒EP管洗涤沉淀，7500g、4℃离心5min后吸弃乙醇；
e)室温干燥沉淀10分钟左右，加入15～20μL无RNA酶的超纯水溶解RNA，-80℃保存备用。
使用诺唯赞(Vazyme)反转录试剂盒对各样品总RNA进行反转录PCR，具体方法如表3：
表3.反转录PCR反应体系
Figure BDA0001744395310000061
用移液器将上述样品轻轻吹打混匀。42℃反应2分钟。再在第1步的反应管中直接加入5×Select qRT SuperMixⅡ2μL，使用移液器轻轻吹打混匀。50℃反应15分钟，85℃反应2分钟。
以β-actin为内参、反转录产物为模板，利用实时定量PCR检测药物抗病毒活性，比较SVCV在不同浓度药物处理后的复制情况。SVCV各蛋白基因和内参基因引物序列如表4所示。
表4.引物序列
Figure BDA0001744395310000071
反转录PCR合成的cDNA模板用Vazyme
Figure BDA0001744395310000072
qPCR
Figure BDA0001744395310000073
Green Master Mix试剂盒进行qRT-PCR扩增，条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火1min，循环40次；熔解曲线分析，65℃至95℃，每步5s。仪器为Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR DetectionSystem。总体积为15μL的反应体系如表5所示。利用2-△△Ct法分析实时定量数据。
表5.实时定量PCR反应体系
Figure BDA0001744395310000074
根据药物浓度与抗病毒抑制率之间的关系，得到化合物1的抗病毒半数有效浓度(EC50)及其95％置信区间为1.6(1.2～1.8)mg/L。化合物1对SVCV N/P/M/G蛋白表达的抑制作用如图4所示，药物对N/P/M/G蛋白表达的抑制趋势相类似，化合物1的最高活性浓度(10mg/L)可有效降低4种蛋白的相对表达量，对病毒复制的抑制率均超过90％。其中，化合物1对SVCV N和M蛋白表达的抑制作用最强，最高抑制率均达到98.2％。此外，CCK-8检测显示化合物1在抗SVCV有效浓度范围(4～10mg/L)内对细胞增殖无影响。
化合物1对感染SVCV的EPC细胞的保护效果如图5所示。倒置显微镜观察结果显示正常的EPC细胞呈不规则多边形以及单层密集排列的状态，在被1000×TCID50SVCV感染48h后，EPC细胞出现了明显的CPE现象，细胞收缩变圆、边缘折光度增加，数量显著减少，细胞单层呈破渔网状；在72h细胞大量死亡，出现大量的细胞碎片，明显丧失生长活力。经过化合物1处理后，感染病毒的EPC细胞在48h均保持良好的细胞形态，并较好的维持了细胞生长活力。相比于病毒组，细胞活力增加40.0％。
(三)化合物1(7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素)抗SVCV诱导的细胞凋亡作用
(1)DAPI荧光染色分析
a)细胞培养和病毒感染
将密度为1×105/孔的EPC细胞接种于含圆形细胞爬片的12孔细胞培养板中，25℃培养16～24h至细胞在爬片上生长至单层。然后吸出培养基，M199培养基漂洗2～3次，加入SVCV稀释液(1×103TCID50)，25℃孵育2h。
b)药物处理
用细胞维持液将母液浓度为50mg/mL的化合物1分别稀释至10mg/L，待病毒孵育2h后，回收病毒液，用M199培养基漂洗2～3次，加入新鲜配制的化合物1稀释液或细胞维持液(对照组，含0.2‰DMSO)，25℃继续培养48～72h。
c)细胞固定
48或72h后，将12孔板内的培养基吸出，用0.1M PBS漂洗爬片上细胞2～3次，加入500μL 4％多聚甲醛，室温孵育20min。
d)细胞染色
细胞固定完成后，用0.1M PBS漂洗爬片上细胞3次，加入500μL 5μM Dil细胞膜荧光探针工作液，37℃避光孵育10～20min，然后吸弃工作液，0.1M PBS洗涤3次，每次2～3min。再加入DAPI染液，37℃避光染色15～20min。染色结束后，吸弃DAPI染液，0.1M PBS洗涤3次，每次2～3min。
e)封片
用镊子小心取出长满细胞的爬片，将爬片细胞面朝上放置在吸水纸上干燥一定时间(不能完全晾干)。吸取抗荧光淬灭剂15～20μL滴加在干净载玻片上，将爬片含细胞面朝下盖在载玻片上，尽量避免出现气泡，可轻压爬片挤出多余液体，用吸水纸将爬片边缘擦干。室温避光静置干燥约20min后用无色指甲油封片。待指甲油凝固后，将含爬片的载玻片置于4℃避光保存，样品在3d内用正置荧光显微镜观察。
f)荧光显微镜(Leica-DM5000)观察
细胞爬片采用正置荧光显微镜进行观察，Dil的最大激发波长为549nm，最大发射波长为565nm，显红色。DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI与核酸结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm，显蓝色。
DAPI染色结果如图6显示，SVCV感染EPC细胞48h后，通过荧光显微镜可清晰地观察到纯病毒感染组宿主细胞的细胞核出现典型的细胞凋亡特征：细胞核界线模糊并伴随明显的融解趋势，染色质出现皱缩，核逐步边缘化甚至破裂，细胞内出现凋亡小体。随着SVCV感染时间延长至72h，EPC细胞的凋亡特征进一步显现：凋亡小体的数量急剧上升，细胞核界线出现消失现象。相比之下，化合物1处理后的感染病毒的EPC细胞与对照组观察结果基本一致，细胞均正常染色，细胞核形态大小一致，染色质也未出现皱缩现象，凋亡小体在观察区域数量极低，这个结果说明了化合物1能有效抗SVCV诱导的细胞凋亡(抑制SVCV诱导的凋亡小体在EPC细胞内产生)，显示了化合物1良好的抗病毒效果。
(2)流式细胞术检测细胞凋亡
本发明使用Vazyme Annexin V-FITC/PI凋亡双染检测试剂盒对各样品细胞的凋亡情况进行检测，具体操作步骤如下所示：
a)细胞样品的收集
药物-病毒处理实验结束后，用0.1M PBS洗涤细胞2～3次，再用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化EPC细胞，然后300g、4℃离心5min收集样品。
b)染色
上步的细胞样品用预冷的0.1M PBS洗涤2～3次，每次收集细胞均在300g、4℃离心5min条件下进行。然后向样品中加入100μL 1×Binding Buffer缓冲液重悬细胞，然后，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染液，轻轻混匀，室温、避光反应10min。最后，再加入400μL1×Binding Buffer缓冲液，轻轻混匀。细胞样品在1h内用流式细胞仪检测。
c)流式细胞仪分析
流式细胞仪的激发波长为488nm，FITC所属的绿色荧光在FL1通道检测，PI所属的红色荧光在FL3通道检测。使用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点，FL1为横坐标，FL3为纵坐标，每个样品采集20000数据点。本发明样品细胞可以分为三个亚群：活细胞含极低强度的背景荧光；早期凋亡细胞仅有较强的FITC绿色荧光；晚期凋亡细胞有FITC绿色荧光和PI红色荧光双重染色。
流式细胞术检测SVCV诱导EPC细胞凋亡结果(Annexin-V/PI双染检测)如图7所示。SVCV感染EPC细胞，能够显著降低正常细胞的比例，下降幅度达到47.34％，而凋亡细胞则大部分处于凋亡早期阶段。随着病毒感染时间延长至72h，病毒感染组细胞的正常比例则进一步下降，只占全部细胞的31.63％；值得注意的是，EPC细胞的晚期凋亡率在逐步的升高，这说明了病毒感染的细胞受到的损伤进一步加强，并随时有崩解的趋势。在加入10mg/L化合物1后，药物处理组的细胞凋亡率显著降低。相比于病毒感染组，药物处理组正常细胞的比例均超过80％。除此之外，通过检测低浓度组香豆素对SVCV诱导的细胞凋亡的影响，凋亡率统计结果分别为50.5％～28.7％和66.0％～37.2％。随着化合物1处理浓度的增加，药物处理组与病毒感染组的细胞凋亡率差值持续下降，这说明药物处理浓度与病毒诱导的细胞凋亡呈负相关关系。通过化合物1处理感染病毒的细胞后，病毒的复制被阻止，并有效控制Caspase凋亡信号的启动，从而避免细胞凋亡的发生，降低病毒对宿主细胞的危害，实现药物对细胞的直接保护作用。

Claims (4)

1.一种含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒选自弹状病毒，该香豆素类衍生物的结构如式1所示：
Figure FDA0002448459110000011
其中，R为2-甲基咪唑。
2.一种含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物在制备水产动物抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒选自弹状病毒，该香豆素类衍生物的结构如式1所示：
Figure FDA0002448459110000012
其中，R为2-甲基咪唑。
3.一种含甲基咪唑类功能基团的香豆素类衍生物在制备用于杀灭病毒的药物中的应用，其特征在于：所述病毒选自弹状病毒，该香豆素类衍生物的结构如式1所示：
Figure FDA0002448459110000013
其中，R为2-甲基咪唑。
4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于：所述病毒选自鲤春病毒血症病毒。
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