CN108686272A - 静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙壳芯结构纳米纤维动脉瘤覆膜支架及制备方法 - Google Patents

静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙壳芯结构纳米纤维动脉瘤覆膜支架及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域和生物高分子材料领域，涉及静电混纺VEGF纳米纤维动脉瘤覆膜支架及制备方法；该支架为采用静电纺技术，混纺有肝素和瑞舒伐他汀钙的纳米纤维作为覆膜支架，支架放置于动脉瘤颈部位后将瘤体与循环血流隔绝，使其治愈；材料内持续释放的肝素使其具备抗血栓形成的能力；瑞舒伐他汀钙具有非生物活性，易于保存、运输，并可持续释放药物，通过多种促内皮因子的介导，加快内皮层的形成。本发明为临床治疗颅内复杂动脉瘤提供了具有抗血栓形成、促内皮化性能并且易于生产、运送和保存的小管径覆膜支架。

Description

静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙壳芯结构纳米纤维动脉瘤覆膜 支架及制备方法
技术领域
本发明属于生物医学领域和生物高分子材料领域，涉及维动脉瘤覆膜支架，具体涉及静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙壳芯结构纳米纤维动脉瘤覆膜支架及制备方法。
背景技术
资料公开了颅内复杂动脉瘤(宽颈型、巨大型、梭形、夹层、假性动脉瘤)致残率和死亡率很高，严重影响人类健康，临床治疗有很大难度。临床实践显示，在治疗时既要消除病变，又要保证脑部的正常供血，这对于神经外科医生和神经介入医生都是严峻挑战。虽然近年来随着显微神经外科技术和介入神经外科的发展，部分病例已经能够得到治疗，但仍然存在若干待解决的问题。“国际蛛网膜下腔动脉瘤临床研究(internationalsubarachnoid aneurysm trial，ISAT)”显示从1年无残疾生存方面考虑，血管内介入治疗的确优于开颅夹闭术，然而介入治疗仍存在弊端，其中主要包括复杂动脉瘤弹簧致密填塞圈困难，以及高远期复发率等问题。临床研究显示，巨大型动脉瘤栓塞后，因瘤体填塞大量栓塞材料，占位效应仍然存在甚至加重；由于栓塞材料价格昂贵，往往使患者经济上难以承受。宽颈动脉瘤常规栓塞无法致密填塞瘤颈，即使采用支架或球囊辅助(如Remodeling技术等)，其复发率仍然很高。近年来开发的血流转流装置(flow diverter,或称密网支架)利用支架置入后瘤体内血流动力学的转变逐渐形成血栓，从而将动脉瘤闭塞。血流转流装置的发明和应用使得一部分通过传统方式无法治疗的复杂动脉瘤得以治愈，但国外中长期随访资料显示，仍然有相当一部分患者动脉瘤不能闭塞，其主要原因是血流转流装置无法彻底将动脉瘤隔绝于循环血流之外，动脉瘤的闭塞取决于瘤体内血流变化后的继发血栓形成，因而存在较大的不确定性和个体差异。然而，在很多情况下，特别是针对没有重要穿通支部位(如颈内动脉岩骨段、海绵窦段、床突旁段等)的复杂动脉瘤，如能采用合适的颅内覆膜支架，将这些难治性动脉瘤瘤体彻底隔绝于正常血流之外，同时保证载瘤动脉的通畅，这将达到治愈的目标，同时覆膜支架的使用能避免其他栓塞材料的大量使用，显著降低治疗费用。
据报道，覆膜支架已成功在外周血管、胸、腹部大动脉使用多年，但在颅内动脉瘤治疗中，目前仍没有理想的、能够在临床上成熟使用的覆膜支架，其主要原因在于：1、颅内动脉管径较细，容易血栓形成，对覆膜材料的抗凝要求极高，2、由于覆膜材料作为异物长期存在，其引起的血管内膜平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)反应性增生导致载瘤血管狭窄，3、覆膜材料本身不利于内皮细胞粘附及内皮层的最终形成，无法使瘤颈口得到解剖和功能上的修复，也是造成载瘤动脉狭窄的原因，4.支架植入过程中对载瘤动脉血管内膜造成一定程度损伤，最终有可能会由于SMC等细胞增生造成载瘤动脉狭窄，等等。
针对颅内复杂动脉瘤的治疗，目前有采用涤纶膜或PTFE膜作为覆膜材料，虽然具有较好的抗血栓能力，但与金属支架的材料相容性差，难以严密结合；同时，光滑的覆膜表面不利于内皮细胞的粘附和爬行；另外，PTFE覆膜支架的制作需要将PTFE膜手工缝，制于支架上，形成覆膜支架；由于所述支架的制造高度依赖个别技术工人的技巧，明显影响了作为产品的稳定性和产业化，故，至今所述支架未能在临床上得到广泛使用。因此，研制性能稳定可靠，适合产业化生产的新型颅内专用覆膜支架是解决颅内复杂动脉瘤这一顽症的迫切需求。而符合临床治疗要求的颅内动脉瘤覆膜支架需要解决以下问题：1、早期覆膜材料的抗血栓性；2、降低或避免远期覆膜材料引起的异物反应，降低血管狭窄率；3、促进瘤颈口(支架放置部位)内皮细胞的粘附，促使内皮层尽早形成。
本申请的发明人曾进行了多种静电纺纳米纤维支架的研制，包括混纺有肝素以及混纺有肝素-VEGF药物的覆膜支架，其表现出比较优秀的抗凝以及促内皮功效，然而，由于VEGF等细胞因子具有生物活性，在覆膜支架的生产和运输过程中有着严格的温控条件，不具有便捷的保存方式，故在运输后的使用过程中出现VEGF等因子效果不稳定的情况。同时，由于既往技术为混纺，导致了载药纺膜纳米纤维的一部分药物裸露于纤维表面，导致药物释放的快慢存在差异。
基于现有技术存在的问题，本申请的发明人拟提供具有抗血栓形成、促内皮化性能并且易于生产、运送和保存的用于治疗颅内复杂动脉瘤的小管径覆膜支架，具体涉及一种纳米纤维动脉瘤覆膜支架，尤其涉及静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙壳芯结构纳米纤维动脉瘤覆膜支架及制备方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷和不足，提供一种纳米纤维动脉瘤覆膜支架，尤其涉及静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙壳芯结构纳米纤维动脉瘤覆膜支架及制备方法。所述支架在生产、运输和保存方面具有良好的稳定性，并具有抗血栓性，降低或避免远期覆膜材料引起的异物反应，降低血管狭窄率的特点，同时能促进瘤颈口(支架放置部位)内皮细胞的粘附，促使内皮层尽早形成。
本发明的静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其支架使用金属裸支架，采用P(LLA-CL)的六氟异丙醇溶液为皮层纺丝液，配制含有肝素和瑞舒伐他汀钙的混合溶液为芯层溶液；
本发明中，采用静电纺技术，制成混纺有①肝素、②瑞舒伐他汀钙的poly(L-lactide-co-caprolactone，即P(LLA-CL)纳米纤维)作为覆膜材料，制得静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架。所述支架适用于放置于动脉瘤颈部位后将瘤体与循环血流隔绝，使其治愈；材料内持续释放的肝素使其具备抗血栓形成的能力，瑞舒伐他汀钙的持续释放，能局部促进内皮系细胞，并加快内皮层的形成。
本发明纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其支架部分采用普通不锈钢裸支架，支架上有支架覆膜材料，所述的支架覆膜材料由肝素和瑞舒伐他汀钙的poly(L-lactide-co-caprolactone，即P(LLA-CL)纳米纤维混纺制成；
所述的纳米纤维动脉瘤覆膜支架通过下述方法制备：
1)配制肝素和瑞舒伐他汀钙(Ros-Ca)的混合溶液为芯层溶液：配制12wt％的P(LLA-CL)的六氟异丙醇(HFIP)溶液为壳层纺丝液；
2).通过同轴静电纺丝的方法将肝素、瑞舒伐他汀钙混纺入皮芯结构的纳米纤维：使用同轴静电纺装置制备皮芯结构的纳米纤维，通过调节聚合物的浓度，并在适当的电压、推进速度、温度、湿度、喷丝口直径和接受距离等条件下进行纺丝获得合理的覆膜；
3)将肝素-瑞舒伐他汀钙同轴纺入颅内用覆膜支架：
预制瑞舒伐他汀钙溶液、肝素溶液，将金属裸支架套在金属钢管上，调节转速，以600转/分钟的速度接收PLCL-15Hep-Ros纳米纤维，收得的纳米纤维在金属裸支架上形成一层完整的覆膜层，制得完整的覆膜支架(如图1、图2所示)；
制得的支架的内径为2.5mm,长度为13mm；完全扩张后支架内径可变为4mm；所述的覆膜支架制成后进行压卧、消毒，真空包装后备用。
本发明的实施例中，将肝素-瑞舒伐他汀钙同轴纺入颅内用覆膜支架过程中：先预制10mg/ml瑞舒伐他汀钙溶液、15wt％肝素溶液，将金属裸支架(购自上海微创公司)套在金属钢管上，调节转速，以600转/分钟的速度接收PLCL-15Hep-Ros纳米纤维(其中，取100ul瑞舒伐他汀钙溶液+400ul肝素溶液，收得的纳米纤维在金属裸支架上形成一层完整的覆膜层，制得完整的覆膜支架。
本发明采用静电纺技术，制成混纺有肝素和瑞舒伐他汀钙的纳米纤维作为覆膜材料，制得静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架；所述支架适用于放置于动脉瘤颈部位后将瘤体与循环血流隔绝，使其治愈；所述覆膜支架的材料内持续释放的肝素使其具备抗血栓形成的能力，瑞舒伐他汀钙的持续释放能局部促进内皮系细胞，并加快内皮层的形成；为临床治疗颅内复杂动脉瘤提供了具有抗血栓形成、促内皮化性能并且易于生产、运送和保存的小管径覆膜支架。
为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明的新型静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架进行详细性能和应用描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本专利范围之内。
附图说明：
图1：制备纳米纤维动脉瘤覆膜支架的流程示意图。
图2：裸支架与纺制成的纳米纤维动脉瘤覆膜支架。
图3：“壳芯”纳米纤维的水接触角、平均直径和直径分布。
图4：纳米纤维的透射电子显微镜照片。
图5：纳米纤维应力-应变曲线和杨氏模量。
图6：纳米纤维中瑞舒伐他汀钙释放情况。
图7：纳米纤维促进内皮细胞生长情况。
图8：纳米纤维抗血栓特性检测。
图9：支架置入后动脉瘤被封闭。
图10：4月复查后发现动脉瘤无再通。
具体实施方式
实施例1制备纳米纤维动脉瘤覆膜支架：
1)配制肝素和瑞舒伐他汀钙(Ros-Ca)的混合溶液为芯层溶液：配制12wt％的P(LLA-CL)的六氟异丙醇(HFIP)溶液为壳层纺丝液；
2).通过同轴静电纺丝的方法将肝素、瑞舒伐他汀钙混纺入皮芯结构的纳米纤维：使用同轴静电纺装置制备皮芯结构的纳米纤维，调节聚合物的浓度，在适当的电压、推进速度、温度、湿度、喷丝口直径和接受距离等条件下进行纺丝以获得合理的覆膜；
3)将肝素-瑞舒伐他汀钙同轴纺入颅内用覆膜支架：
预制10mg/ml瑞舒伐他汀钙溶液、15wt％肝素溶液，将金属裸支架(上海微创公司)套在金属钢管上，调节转速，以600转/分钟的速度接收壳层为PLCL材料，芯层为肝素和瑞舒伐他汀钙的纳米纤维，收得的纳米纤维在金属裸支架上形成一层完整的覆膜层，制得完整的覆膜支架(如图1、图2所示)；制得的支架的内径为2.5mm,长度为13mm；完全扩张后支架内径可变为4mm；所述的覆膜支架制成后进行压卧、消毒，真空包装后备用。
通过电镜观察覆膜材料、扫描电镜纳米纤维的表征、亲疏水性测试、力学性能测试检测检测静电纺肝素-瑞舒伐他汀钙纳米纤维的物理特性：
(1)负载肝素-瑞舒伐他汀钙的纳米纤维内部结构
通过纳米纤维的透射电子显微镜照片，检测PLCL的纳米纤维的“壳-芯”结构，结果显示，由水相所构成的芯层呈连续状，且分布于纤维的中央；(如图3所示)
(2)负载肝素-瑞舒伐他汀钙纳米纤维亲疏水性测试
为了检测不同浓度瑞舒伐他汀钙芯层是否对材料表征有影响，我们对芯层溶液进行分组，分为：①PBS组②Ros-50-Heparin组(450μl肝素+50μl瑞舒伐他汀钙溶液)③Ros-75-Heparin组(425μl肝素+75μl瑞舒伐他汀钙溶液)④Ros-100-Heparin组(400μl肝素+100μl瑞舒伐他汀钙溶液)，随着瑞舒伐他汀钙量的增加，支架表面的亲水性没有明显的变化，结果表明，负载肝素-瑞舒伐他汀钙的支架表面接近于纯P(LLA-CL)，利于细胞的粘附和生长；(如图4所示:a.PBS组,b.Ros-50-Heparin组,c.Ros-75-Heparin组,d.Ros-100-Heparin组)
(3)负载肝素-瑞舒伐他汀钙纳米纤维力学性能测试
对制备的纳米纤维膜的干态的应力、应变情况进行检测，作出应力-应变曲线。结果表明，负载肝素-瑞舒伐他汀钙后支架的断裂强度增大，断裂伸长率有所下降，但仍具有优秀的力学性能；检测结果表明，制得的纳米纤维支架具有优良性能，具有良好的应用前景。(如图5所示)
实施例2
按上述方法制备纳米纤维动脉瘤覆膜支架；
通过肝素及瑞舒伐他汀钙的体外缓释研究、体外降解研究、体外生物相容性的检测，检测静电纺肝素-瑞舒伐他汀钙纳米纤维的生物学特性：(如图6、图7、图8所示)
(1)瑞舒伐他汀钙的体外释放行为
对①PBS组②Ros-50-Heparin组(450μl肝素+50μl瑞舒伐他汀钙溶液)③Ros-75-Heparin组(425μl肝素+75μl瑞舒伐他汀钙溶液)④Ros-100-Heparin组(400μl肝素+100μl瑞舒伐他汀钙溶液)纳米纤维的瑞舒伐他汀钙进行体外释放行为的测定，结果显示，所述三种浓度的支架中的瑞舒伐他汀钙均保持了较为稳定的释放，未见明显的突释现象；在释放到30天后，释放速度逐渐减慢，分析原因可能是：首先是药物的释放存在两种机制，即扩散机制和降解机制，其中短期的药物释放为扩散原理，纤维膜的表面可能存在少量未被包覆的瑞舒伐他汀钙，加入到PBS溶液中后便迅速扩散；其次是瑞舒伐他汀钙可以通过纤维两端口处释放，与通过皮层扩散的方式释放相比，其速度相对较快，当纤维两端的肝素钠释放量达到一定程度后，则难以再快速释放，因此其速度变慢；
(2)HUVEC(人脐静脉血管内皮细胞)在纳米纤维膜上的增殖情况
基于理想的组织工程支架应该具有良好的生物相容性，在体外条件下，为细胞的生长提供良好的微环境，细胞在支架上黏附后，从培养基中吸收营养并进行分裂增殖；本申请中统计了HUVEC在种植后不同时间点的增殖情况，结果显示，HUVEC在含有瑞舒伐他汀钙的支架上的细胞增殖相对高，尤其是在Ros-100-Heparin组(400μl肝素+100μl瑞舒伐他汀钙溶液)，与不含瑞舒伐他汀钙的支架相比存在显著性差异；进一步对瑞舒伐他汀钙的促内皮机制探究结果表明，其主要通过VEGF进行内皮的促进，表明负载到纤维中的瑞舒伐他汀钙通过VEGF的调剂，对内皮化相关的细胞增殖起促进作用，因此，本发明所述的纳米纤维在支架快速内皮化方面能起到较好的促进作用；
(3)HUVEC在纳米纤维膜上的细胞形态
经多聚甲醛固定和梯度乙醇脱水后，对比于空白对照组，HUVEC在含有肝素和瑞舒伐他汀钙的支架覆膜上大量存在，表明瑞舒伐他汀钙起到了促进HUVEC在支架上的粘附和增殖，该结果通过活死细胞染色得以确认；同时从扫描电镜的图片可以看出，细胞与支架能够很好的融合，保持良好生长形态，表明本发明所述的纳米纤维支架能够为细胞的生长提供适宜的微环境。
实施例3动物实验
覆膜支架治疗动脉瘤的效果评价：将肝素-瑞舒伐他汀钙混纺的纳米纤维覆膜支架通过血管介入技术置入兔颈动脉瘤模型，检测覆膜支架的动脉瘤治疗效果：(如图9、图10所示)
(1)构建新西兰大白兔的动脉瘤模型：实验动物全麻后，充分暴露右侧的颈总动脉并结扎其远端，近端颈总动脉的发出部位利用临时阻断夹阻断，向颈总动脉残腔内注入胰蛋白酶消化20分钟后吸除，放开临时阻断夹，形成动脉壁无中层结构的动脉瘤模型；构建三周后，动脉瘤模型稳定，覆膜支架植入前所有构建动脉瘤模型的新西兰大白兔均未出现明显的异常情况；
(2)覆膜支架的植入：全麻后，将实验动物仰卧于DSA检查床，四肢牵伸并用束缚带固定于检查床上，常规处理消毒实验动物双侧腹股沟区，摸清股动脉搏动位置，沿股动脉方向纵向切开皮肤约1cm，血管钳钝性分离皮下组织至清晰分辨股动脉，用4F动脉穿刺套针穿破股动脉前壁并进入股动脉内约1cm，拔出穿刺针内芯，将短导丝沿穿刺针套管至于股动脉内；将穿刺针套管拔出而保留导丝在股动脉内，再将带有皮肤扩张器的动脉导管鞘沿导丝置入股动脉内，然后拔出皮肤扩张器和导丝；用4F单弯造影导管与Y型阀相连接并排尽导管中的气体，然后将造影导管置入动脉导管鞘内；在X射线监视下将造影导管经股动脉、髂动脉、腹主动脉、胸主动脉输送到主动脉弓上，用旋转和推送技术分别将造影导管超选至右侧头臂干内；行手推数字减影血管造影；测量动脉瘤载瘤动脉直径和动脉瘤瘤颈宽度，选择合适的支架后，然后将装配好的球囊导管连同微导丝一起经Y型阀送入导引导管内，当球囊导管送出导引导管后，先将微导丝选择性输送跨越瘤颈到达瘤颈以远，然后顺微导丝使球囊导管沿微导丝稳定爬行，在X线监视下使支架中点位于动脉瘤瘤颈处，支架位置确定后，旋转压力泵旋柄使压力缓慢升高，观察球囊扩张和支架展开情况，若球囊扩张程度满意，则维持压力泵压力约10秒钟左右，然后以负压抽吸球囊，释放支架；支架释放完成后，撤出球囊导管和微导丝；复查血管造影明确动脉瘤治疗效果；造影结束后，拔出导引导管和动脉导管鞘；对动脉穿刺点进行缝扎止血，局部皮肤切口用丝线缝合，再用无菌敷料加压包扎；
(3)检验支架治疗动脉瘤效果：治疗后4月对动脉瘤治疗情况进行随访，结果显示所有实验动物均正常存活，治疗效果好，未发现异常中毒症状；
支架植入后血管造影显示支架未见明显移位,动脉瘤闭塞完全，载瘤动脉畅通，无明显狭窄。

Claims (8)

1.静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其特征在于，其支架使用金属裸支架，采用P(LLA-CL)的六氟异丙醇溶液为皮层纺丝液，含有肝素和瑞舒伐他汀钙的混合溶液为芯层溶液；采用静电纺技术，制成混纺有肝素和瑞舒伐他汀钙的P(LLA-CL)纳米纤维作为覆膜材料，制得静电混纺肝素-瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架。
2.按权利要求1所述的静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其特征在于，通过下述方法制备：
1)配制肝素和瑞舒伐他汀钙(Ros-Ca)的混合溶液为芯层溶液：配制12wt％的P(LLA-CL)的六氟异丙醇(HFIP)溶液为壳层纺丝液；
2).通过同轴静电纺丝的方法将肝素、瑞舒伐他汀钙混纺入皮芯结构的纳米纤维：使用同轴静电纺装置制备皮芯结构的纳米纤维，通过调节聚合物的浓度，并在适当的电压、推进速度、温度、湿度、喷丝口直径和接受距离条件下进行纺丝获得覆膜；
3)将肝素-瑞舒伐他汀钙同轴纺入颅内用覆膜支架：
预制瑞舒伐他汀钙溶液、肝素溶液，将金属裸支架套在金属钢管上，调节转速，以600转/分钟的速度接收壳层为PLCL材料，芯层为肝素和瑞舒伐他汀钙的纳米纤维，收得的纳米纤维在金属裸支架上形成一层完整的覆膜层，制得完整的覆膜支架。
3.按权利要求1或2所述的静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其特征在于，所述的支架的内径为2.5mm,长度为13mm；完全扩张后支架内径为4mm。
4.按权利要求2所述的静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其特征在于，将肝素-瑞舒伐他汀钙同轴纺入颅内用覆膜支架过程中：先预制10mg/ml瑞舒伐他汀钙溶液、15wt％肝素溶液，将金属裸支架套在金属钢管上，调节转速，以600转/分钟的速度接收壳层为PLCL材料，芯层为肝素和瑞舒伐他汀钙的纳米纤维，收得的纳米纤维在金属裸支架上形成一层完整的覆膜层，制得完整的覆膜支架。
5.按权利要求2所述的静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其特征在于，所述的纳米纤维中含不同配比的肝素和瑞舒伐他汀钙溶液的P(LLA-CL)静电纺丝。
6.按权利要求2所述的静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其特征在于，同轴纺入纳米纤维膜中的肝素与瑞舒伐他汀钙有相互作用，其中瑞舒伐他汀钙持续、稳定地进行释放。
7.按权利要求2所述的静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其特征在于，所述肝素与瑞舒伐他汀钙的相互作用，使得内皮相关细胞易贴附于支架上，形成内皮覆盖。
8.按权利要求2所述的静电同轴纺肝素/瑞舒伐他汀钙纳米纤维动脉瘤覆膜支架，其特征在于，所述的支架具有抗血栓性，降低或避免远期覆膜材料引起的异物反应，降低血管狭窄率，同时促进瘤颈口内皮细胞的粘附，促使内皮层早形成功能。
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