CN108671238A - 一种联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法，包括以下特征步骤：以多功能白蛋白为载体分子，以光疗剂的NHS活性酯与白蛋白的氨基按预设量比在pH7.0‑8.0缓冲液中反应10‑60分钟；过凝胶柱纯化后，按预设量比投入含马来酰亚胺基团的化疗药物与白蛋白分子的游离巯基避光反应10‑60分钟；过凝胶柱纯化后得到同时共价连接光疗剂与化疗药物的纳米颗粒系统。通过本发明中方法制备的白蛋白纳米系统能够克服现有临床肿瘤治疗中的多药耐药问题。

Description

一种联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药递药系统制备领域，具体涉及一种联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法。
背景技术
癌症是危害人类健康的恶疾，且发病率逐年上升。尽管在过去的几十年里，癌症的治疗取得了一些实质性的改善，但是化疗药物耐药成为阻碍肿瘤有效治疗的主要壁垒之一，如伴有恶性胸腔积液的非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer, NSCLC）通常对全身性化疗耐药。
肿瘤多药耐药（Multiple Drug Resistance, MDR）是造成肿瘤临床化疗失败的主要原因，也是肿瘤临床治疗的一大难题。肿瘤耐药的机制有：摄取的减少、药物外排、细胞内分布的改变、药物代谢酶的降解等。智能化纳米递药系统通过包载药物能够延长化疗药物的体内半衰期、改善药物在肿瘤组织的分布、提高生物利用度，还可控制药物释放，实现化疗药物和基因药物等的共传递，有望实现肿瘤的诊断、监测及治疗。但是，如何通过机体的物理、生理屏障渗透进入肿瘤组织深处依然是纳米递药系统发展中亟待解决的问题。
联合两种以上的治疗手段是克服肿瘤耐药的一个有效策略，尤其是联合光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）与化疗表现出明显的杀灭肿瘤细胞的效果。在当前的研究中，许多智能化纳米递药系统，如载Ce6和阿霉素的PDPA胶束、穿膜肽F3修饰的载PPa与紫杉醇的PEG-PLA纳米粒、载阿霉素的NaYF4:Yb/Tm–TiO2纳米粒等，通过同时包载光敏剂和化疗药物实现了抗肿瘤耐药。然而，这些体系的制备工艺复杂、载体材料的生物相容性差等使得它们市场化的前景渺茫。
由于肿瘤组织的一系列物理、生理屏障导致化疗药物很难穿透肿瘤并到达肿瘤组织内部，使肿瘤细胞长时间经受亚致死剂量的药物刺激，也是肿瘤产生耐药的重要原因。因此，输送足够剂量的药物至肿瘤内部不仅是减少肿瘤耐药发生的需要，也是实现抗肿瘤耐药的关键所在。
肿瘤血管生长迅速，形成不成熟、渗漏性比正常血管大、间质液压升高。纳米药物必须穿过血管壁与组织基质才能到达肿瘤细胞，而只有将足量的药物传递至肿瘤深处才有可能根除肿瘤防止复发。临床数据已经证实了高渗透长滞留（EPR）效应的存在，即大分子药物能够借助EPR效应到达肿瘤并滞留其中不被清除而发挥药效。与粒径大的纳米药物相比，粒径较小的纳米药物能够更快速的进入肿瘤细胞并更有效的传递药物，这是因为小粒径的纳米药物的肿瘤穿透性能更好。此外，肿瘤的微环境复杂，存在着一些单靠EPR效应不能克服的屏障，如肿瘤组织的血流量低、血流分布不均、血管通透性的异质性等限制了纳米药物的供给、渗透与分布，而纳米药物必须穿过血管壁与组织基质才能到达肿瘤细胞。
光疗能够增强肿瘤血管的通透性从而提高纳米药物在肿瘤的渗透性。以Pan-IR800预处理荷瘤小鼠后光照，继而给予纳米药物，结果发现纳米药物的血管渗透性增加了24倍，且对粒径200nm的纳米药物亦有促渗透的作用。在另一项研究中，以EGFP的抗体-IR700预处理荷瘤小鼠后光照，纳米药物在肿瘤的分布提高了5倍。
因此，为了克服肿瘤多药耐药，我们亟待找到切实可行的增加药剂递送至实体瘤并达到治疗浓度的新方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法，该白蛋白纳米系统能够提高药剂向实体瘤递送的效率并使药剂在肿瘤细胞内的浓度达到治疗浓度。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：一种联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法，包括以下特征步骤：以多功能白蛋白为载体分子，以光疗剂的NHS活性酯与白蛋白的氨基按预设量比在pH7.0-8.0缓冲液中反应10-60分钟；
过凝胶柱纯化后，按预设量比投入含马来酰亚胺基团的化疗药物与白蛋白分子的游离巯基避光反应10-60分钟；
过凝胶柱纯化后得到同时共价连接光疗剂与化疗药物的纳米颗粒系统。
进一步的，所述多功能的白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白；
所述光疗剂是IRye700DX或IRDye800；
所述化疗药物是阿霉素、柔红霉素、表阿霉素或洋红霉素。
进一步的，所述光疗剂的NHS活性酯与白蛋白的物质的量比为10:1-1:1。
进一步的，所述含马来酰亚胺基团的化疗药物与所述白蛋白的物质的量比为10:1-4:1。
本发明的有益效果是：
通过本发明中方法制备的白蛋白纳米系统能够克服现有临床肿瘤治疗中的肿瘤多药耐药问题。
其联合应用光疗与化疗能够实现抗肿瘤耐药主要是由于以下原因：
（1）光疗能够提高纳米递药系统的肿瘤渗透性，有助于药物向肿瘤深处的输送，提高肿瘤部位的药物浓度；
（2）化疗药物到达肿瘤后能够杀灭肿瘤外围的成纤维细胞等，改变肿瘤微环境，有助于肿瘤内部缺氧的改善，从而提高光疗效果；
（3）纳米递药系统主要经网格蛋白介导入胞到达溶酶体，光激发可以破坏溶酶体，帮助纳米递药系统实现溶酶体逃逸，并控制药物释放。
附图说明
下面结合附图对本发明的联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法作进一步说明。
图1 是实施例1中阿霉素-HSA-IR700的粒径分布图。
图2 是实施例2中阿霉素-HSA-IR700的粒径分布图。
图3 是验证例中光照后阿霉素脂质体与Dox-HSA-IR700肿瘤球渗透性的激光共聚焦照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
将人血清白蛋白溶解在pH 7.0-8.0的碳酸盐缓冲液中，继而按物质的量比1:1投入光疗剂的NHS活性酯IR700-NHS（IRDye700DX的NHS活性酯，IRDye700是近红外染料，具有光毒性），反应10分钟后，经凝胶柱纯化即得HSA-IR700（人血清白蛋白-IR700结合物）。可以想见的是：其中，人血清白蛋白可以由牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白及其组合物等其它类似物的多功能白蛋白来替换。光疗剂是IRye700DX，当然也可以是IRDye700、IRDye800及其组合物等类似物。
（6-马来酰丙基）阿霉素腙衍生物活化后，按阿霉素/HSA物质的量比4:1投入HSA-IR700中，避光反应30分钟后，过凝胶柱纯化后得Dox-HSA-IR700（阿霉素-人血清白蛋白-IR700结合物）纳米系统。其中，阿霉素可由柔红霉素、表阿霉素或洋红霉素，以及前述组合物等类似化疗药物一一来替代。
用动态光散射法测定粒径，如图1中A部所示，粒径约为8.0nm。
实施例2
将人血清白蛋白溶解在pH 7.0-8.0的碳酸盐缓冲液中，继而按物质的量比10:1投入IR700-NHS，反应60分钟后，经凝胶柱纯化即得HSA-IR700。
（6-马来酰丙基）阿霉素腙衍生物活化后，按阿霉素/HSA物质的量比10:1投入HSA-IR700中，避光反应60分钟后，过凝胶柱纯化后得Dox-HSA-IR700纳米系统。
用动态光散射法测定粒径，如图2中B部所示，粒径约为8.8nm。
验证例
取GFP转染肿瘤细胞培养3D肿瘤球，分别给予阿霉素脂质体（Doxil）与Dox-HSA-IR700孵育过夜，用新鲜培养基清洗后，用660nm的LED灯照射20分钟后，再次给予阿霉素脂质体（Doxil）与Dox-HSA-IR700，孵育4小时后，用新鲜培养基洗涤3次后，用激光共聚焦显微镜观察阿霉素的肿瘤穿透性，如图3所示，Dox-HSA-IR700能够将阿霉素传递至肿瘤球内部。
本发明不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法，包括以下特征步骤：以多功能白蛋白为载体分子，以光疗剂的NHS活性酯与白蛋白的氨基按预设量比在pH7.0-8.0缓冲液中反应10-60分钟；
过凝胶柱纯化后，按预设量比投入含马来酰亚胺基团的化疗药物与白蛋白分子的游离巯基避光反应10-60分钟；
过凝胶柱纯化后得到同时共价连接光疗剂与化疗药物的纳米颗粒系统。
2.根据权利要求1所述联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法，其特征在于：所述多功能的白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白；
所述光疗剂是IRye700DX或IRDye800；
所述化疗药物是阿霉素、柔红霉素、表阿霉素或洋红霉素。
3.根据权利要求1所述联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法，其特征在于：所述光疗剂的NHS活性酯与白蛋白的物质的量比为10:1-1:1。
4.根据权利要求1所述联合治疗高肿瘤渗透性白蛋白纳米系统的制备方法，其特征在于：所述含马来酰亚胺基团的化疗药物与所述白蛋白的物质的量比为10:1-4:1。
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