CN108660241B - 一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式pcr检测方法 - Google Patents

一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检测方法，主要提供了一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物(上游引物P1：5′‑CCCACCCTTTGCTGTTGCG‑3′和下游引物P2：5′‑AAGGCCCCGCGTTTTCG‑3′)，该引物与通用引物ITS1/ITS4配合使用，经过两轮PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在芒果疮痂病病原菌基因组DNA或感染芒果疮痂病病原菌的植物组织中特异性地扩增出长度为488bp的特异扩增产物。所发明的特异性引物及其用法可被用于生产实践中芒果疮痂病病原菌的快速、灵敏、特异的检测，对芒果疮痂病的鉴定和防治具有十分重要的意义。

Description

一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检 测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检测方法。
背景技术
芒果疮痂病是由芒果痂囊腔菌(Elsinoe mangiferae)引起的一种植物病害，常危害芒果叶片、幼稍和果实，降低果实商品价值，现已成为我国芒果产区的主要病害之一。我国于1985年发现该病害，1991年，该病在广东省花县造成严重危害，受害果实伤痕累累，基本丧失经济价值。鉴于该病对芒果造成的严重危害和巨大经济损失，该病原菌曾被列为我国对外检疫对象。因此，开展芒果疮痂病病原菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。
目前没有针对芒果疮痂病病原菌的PCR检测方法。传统的芒果疮痂病诊断方法包括症状检查、病菌的显微镜检查，分离培养等。由于芒果疮痂病病原菌比较难分离且生长非常缓慢(该病菌在PDA培养基上25℃下培养两周，菌落直径仅为2.5cm-3.5cm)，所以现有的检测鉴定方法容易导致假阴性，且耗时较长。本发明通过提供一对特异引物对，采用巢式PCR技术对芒果疮痂病病原菌进行检测，灵敏度高，特异性强，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检测方法。本发明可直接用总DNA为模板进行两轮PCR扩增就能判定有无芒果疮痂病病原菌，方便性得以提高，是一种很有应用前景的病原菌早期快速检测和监测技术，可为芒果疮痂病病原菌引起的植物病害诊断提供有力的技术保障。
本发明采取的技术方案如下：
一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物，包括上游引物P1和下游引物P2，所述P1和P2的序列为：
P1:5′-CCCACCCTTTGCTGTTGCG-3′；
P2:5′-AAGGCCCCGCGTTTTCG-3′。
优选的，所述引物P1和P2对芒果疮痂病病原菌特异性扩增出488bp的产物。
本发明还提供了一种利用所述引物P1和P2检测芒果疮痂病病原菌的巢式PCR方法，具体步骤为：以待测样品的DNA为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增，将PCR产物稀释50-100倍，再用权利要求1所述的特异性引物P1和P2进行第二轮PCR扩增，反应结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出488bp的产物，即判定样品中存在芒果疮痂病病原菌。
优选的，所述待测样品为芒果疮痂病病原菌或者疑似感染了芒果疮痂病病原菌的植物组织。
优选的，第一轮PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer，0.5μL的Taq DNA聚合酶5U/μL，1μL的引物ITS1，1μL的引物ITS4，2.0μL的dNTPs，1μL的模板DNA，用ddH2O补足至25μL；第二轮PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer，0.5μL的Taq DNA聚合酶5U/μL，1μL的引物P1，1μL的引物P2，2.0μL的dNTPs，1μL的PCR产物，用ddH2O补足至25μL。
优选的，第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、灵敏度高，采用本发明方法对芒果疮痂病病原菌的检测下限可达到10-2pg/μL。
2、特异性强，本发明方法能从芒果疮痂病原菌中特异地扩增出一条488bp的条带，而其它菌株及阴性对照中均未扩增出任何条带，表明本发明方法具有极高的特异性。
3、操作简单，省时省力，易于大规模推广，具有实际的应用价值。
附图说明
图1为芒果疮痂病病原菌PCR检测电泳图；
图2为芒果疮痂病病原菌PCR检测灵敏度实验结果，编号1-6分别代表芒果疮痂病病原菌基因组含量为1pg/μL，10-1pg/μL，10-2pg/μL，10-3pg/μL，10-4pg/μL，10-5pg/μL，“M”为Marker DL2000，“-”为阴性对照；
图3为芒果疮痂病病原菌特异性实验结果，编号1为阳性对照，编号2-11分别为：芒果疮痂病菌、芒果胶胞炭疽菌、芒果尖孢炭疽菌、芒果蒂腐病菌、芒果细菌性黑斑病菌、芒果白粉病菌、芒果露水斑病菌、芒果拟盘多毛孢叶斑病菌、芒果灰斑病菌、芒果畸形病菌，编号12为阴性对照，“M”为Marker DL2000。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
参试菌株：
芒果疮痂病菌(Elsinoe mangiferae)，芒果胶胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，芒果尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)，芒果蒂腐病菌(Phomopsis mangiferae)，芒果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestrispv.mangiferaeindicae)，芒果白粉病菌(Oidium mangifera)，芒果露水斑病菌(Cladosporium cladosporioides)，芒果拟盘多毛孢叶斑病菌(Pestalogiopsismangiferae)，芒果灰斑病菌(Alternaria tenuissima)，芒果畸形病菌(fusariumproliferatum)。
本发明实施例中所述CTAB的配方：CTAB 4g，NaCl 16.364g，1M Tris-HCl 20mL(pH8.0)，0.5M EDTA 8mL，先用70mL ddH2O溶解,再定容至200mL灭菌。
实施例1、一种芒果疮痂病病原菌的巢式PCR检测方法
1)芒果组织DNA的提取
取待测样品(即疑似感染芒果疮痂病的芒果叶片或者果皮等组织)10mg，置于研钵中，加入液氮研磨后，再加入600μL的65℃预热的CTAB提取液，65℃水浴1h；加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1，V/V)抽提；取上清，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀2h；12000rpm，4℃离心10min；去上清，加入75％的乙醇1mL洗涤沉淀；12000rpm，4℃离心10min；加入20-50μL的超纯水回溶基因组DNA。
2)引物设计与PCR扩增
以所提取的DNA为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增，将PCR产物稀释50-100倍，再用芒果疮痂病的特异性引物P1和P2进行第二轮PCR扩增。
所述通用引物引物ITS1/ITS4的序列为：
(SEQ ID NO:1)上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；
(SEQ ID NO:2)下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
芒果疮痂病原菌its序列如SEQ ID NO:5所示。
所述特异性引物P1和P2的序列为：
(SEQ ID NO:3)上游引物，P1:5′-CCCACCCTTTGCTGTTGCG-3′；
(SEQ ID NO:4)下游引物，P2:5′-AAGGCCCCGCGTTTTCG-3′。
第一轮PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer，0.5μL的Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL的引物ITS1，1μL的引物ITS4，2.0μL的dNTPs，1μL的模板DNA，用ddH2O补足至25μL。
第二轮PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR buffer，0.5μL的Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL的引物P1，1μL的引物P2，2.0μL的dNTPs，1μL的PCR产物，用ddH2O补足至25μL。
第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。
第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。
3)分析方法
两轮PCR反应结束后取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统上观察并拍照。若结果显示扩增出488bp条带，则说明样品中检测到芒果疮痂病病原菌。结果见图1。
实施例2：灵敏度实验
将芒果疮痂病原菌的基因组DNA分别稀释为1pg/μL，10-1pg/μL，10-2pg/μL，10-3pg/μL，10-4pg/μL，10-5pg/μL，做为模板加入到PCR反应体系中，参照实施例1的方法进行PCR扩增，PCR反应结束后取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图2。
结果表明，疮痂病原菌的基因组DNA浓度范围在10pg/μL-10-2pg/μL的产物电泳后显示扩增出488bp条带，其余均无条带(见图2)，表明本发明方法检测下限为10-2pg/μL，灵敏度高。
实施例3：特异性实验
以芒果疮痂病菌、芒果胶胞炭疽菌、芒果尖孢炭疽菌、芒果蒂腐病菌、芒果细菌性黑斑病菌、芒果白粉病菌、芒果露水斑病菌、芒果拟盘多毛孢叶斑病菌、芒果灰斑病菌、芒果畸形病菌的DNA来测试本发明方法的特异性，以芒果疮痂病原菌为阳性对照，以无菌水为阴性对照。结果见图3。
结果显示，本发明方法只能从芒果疮痂病原菌中特异地扩增出一条488bp的条带，而其它菌株及阴性对照中均未扩增出任何条带，表明本发明方法具有极高的特异性。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
序列表
<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
<120> 一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物及巢式PCR检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 芒果痂囊腔菌(Elsinoe mangiferae)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 芒果痂囊腔菌(Elsinoe mangiferae)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 芒果痂囊腔菌(Elsinoe mangiferae)
<400> 3
cccacccttt gctgttgcg 19
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 芒果痂囊腔菌(Elsinoe mangiferae)
<400> 4
aaggccccgc gttttcg 17
<210> 5
<211> 634
<212> DNA
<213> 芒果痂囊腔菌(Elsinoe mangiferae)
<400> 5
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta acgaggtagg gcctcctccg ggagcccgaa 60
ctccccaccc tttgctgttg cgaatcacgt tgcttcggcg ggaccctccc ccccttctcc 120
gagaggactg gggcgggggg gaccgggcca ccgcgcccgg gcagcgcccg ccgggggacc 180
caaccaactc ttgtgttttg aacattgcag tcggagtaca atcgtacaat caaactaaaa 240
ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag 300
taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccttg 360
gtattccgag gggcatgcct gttcgagcgt catttcacca atcaagcccc gcttggtatt 420
gggcgcgcgg ccggtccccc cgtggccggc ccgcccgaaa tgcatcggcg aggcaccgac 480
ccccggcgtg ttagaatttc gaaacgtcag gagcaccggt gaccccctcc gccgcgaaaa 540
cgcggggcct tcgggcctct cacttttttt caaaggttga cctcggatca ggtaggaata 600
cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 634

Claims (6)

1.一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物，其特征在于，包括上游引物P1和下游引物P2，所述P1和P2的序列为：
P1:5′-CCCACCCTTTGCTGTTGCG-3′；
P2:5′-AAGGCCCCGCGTTTTCG-3′。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测芒果疮痂病病原菌的特异性引物，其特征在于，所述引物P1和P2对芒果疮痂病病原菌特异性扩增出488bp的产物。
3.一种利用权利要求1所述引物检测芒果疮痂病病原菌的巢式PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品的DNA为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增，将PCR产物稀释50-100倍，再用权利要求1所述的特异性引物P1和P2进行第二轮PCR扩增，反应结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出488bp的产物，即判定样品中存在芒果疮痂病病原菌。
4.根据权利要求3所述的检测芒果疮痂病病原菌的巢式PCR方法，其特征在于，所述待测样品为芒果疮痂病病原菌或者疑似感染了芒果疮痂病病原菌的植物组织。
5.根据权利要求3所述的检测芒果疮痂病病原菌的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR缓冲液，0.5μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶，1μL的引物ITS1，1μL的引物ITS4，2.0μL的dNTPs，1μL的模板DNA，用ddH2O补足至25μL；第二轮PCR扩增的反应体系为：2.5μL的10×PCR缓冲液，0.5μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶，1μL的引物P1，1μL的引物P2，2.0μL的dNTPs，1μL的PCR产物，用ddH2O补足至25μL。
6.根据权利要求3所述的检测芒果疮痂病病原菌的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。
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