CN108653311B - 长效镇痛的药物组合物、纳米制剂及其制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗长时疼痛的药物组合物，所述药物组合物中的活性成分，按重量份计包括如下组分：双氯芬酸8～12份，黄芪甲苷3～5份，姜黄素2～3份，红花黄素2～3份。本发明还提供了相应药物组合物的制剂及其制备方法以及该药物组合物在制备预防和/或治疗疼痛方面的应用。本发明所得药物组合物具有显著的镇痛效果，其镇痛作用时间较长，适合较为强烈及持续时间较长的疼痛的预防及治疗。本发明所得纳米脂质体的粒径分布窄，利于制剂的质量控制。本发明在疼痛的预防和治疗方面具有良好的应用潜力。

Description

长效镇痛的药物组合物、纳米制剂及其制法和应用

技术领域

本发明属于疼痛的预防和治疗领域，涉及预防和治疗疼痛的药物技术领域，特别涉及可预防和治疗疼痛的长效药物及其纳米制剂。

背景技术

一般而言，疼痛分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛通常伴有自主神经反应有关，其疼痛时间通常较短(Vahabi S,Beiranvand S.Eff ect of local ropivacaine onhemodynamic responses in craniotomy patients.J Investig Surg 2017；1–5)；而慢性疼痛的作用通常持续至少3个月，其多为由组织损伤、相关疾病或者自发性引起的疼痛(Moradkhani MR,Karimi A,Negahdari B.Nanotechnology application to localanaesthesia(LA).Artifcells,nanomedicine,Biotechnol 2017；1–6)。

长期以来，非甾体类消炎药(NSAIDs)在作为治疗急慢性疼痛药物方面得到了大量的应用，治疗了大量的骨痛、头疼和术后疼痛等的病患。不过，NSAIDs也有着为人熟知的副作用，包括引起胃肠道不适、引发心血管疾病和损伤肾脏等(BhalaN,Emberson J,MerhiAetal Vascular and upper gastrointestinaleffects of non-steroidal anti-in flammatory drugs:Meta-analyses of individual participant data from randomisedtrials.Lancet(London,England)2013；382:769–779；Schneider V,Lévesque LE,Zhang Bet al.Association of selective and conventional nonsteroidal anti-inflammatory drugs with acute renal failure:Apopulation-based,nested case-control analysis.Am J Epidemiol 2006；164:881–889)。重要的是，这种副作用并非由长期用药引起，其副作用产生的时间很短，通常在用药第一周便会出现(McGettigan P,HenryD.Cardiovascular risk with non-steroidal anti-in fl ammatory drugs:Systematicreview of population-based controlled observational studies.PLoS Med.2011；8:e1001098)。因此，如何降低NSAIDs的副作用是非常重要的研究课题。

在克服NSAIDs的副作用方面，中国专利CN 1771973A公布了一种组合药物，其包括非甾体类抗炎镇痛药和氨基葡萄糖。该专利通过两种药的复配，较好的改善了NSAIDs的副作用。中国专利CN 105963364A公布了包含丁香和肉桂的组合药物，其可治疗由双氯芬酸、吲哚美辛、阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬等药引起的药源性腹痛。

另外，NSAIDs还具有药效时间短的缺点，多用于缓解短时的、轻度的疼痛(如普通的牙痛和头痛)，限制了其在疼痛期超过3天的、较为剧烈的疼痛的治疗应用。为了克服该缺点，中国专利CN 100553633B提供了一种由酮咯酸脂衍生物和油载剂组成的药物组合物，其作用时间可达3～5天，满足了长效镇痛的目的。中国专利CN 105169392A提供了一种由补骨脂甲素和非甾体抗炎药组成的药物组合物，其中补骨脂甲素可延长非甾体抗炎药的半衰期，从而发挥长效的镇痛抗炎作用。

在NSAIDs中，双氯芬酸(diclofenac)是常用的一种药，其具有抗炎、镇痛及解热作用，用于风湿性关节炎、粘连性脊椎炎、非炎性关节痛、关节炎、非关节性风湿病、非关节性炎症引起的疼痛、癌症疼痛、创伤后疼痛及各种炎症所致发热等。不过双氯芬酸较为容易引起上消化道问题，受到了越来越多研究者的注意(Lewis SC,Langman MJS,Laporte J-R etal.Dose-response relationships between individual nonaspirin nonsteroidalanti-inflammatory drugs(NANSAIDs)and serious upper gastrointestinal bleeding:A metaanalysis based on individualpatient data.Br J ClinPharmacol 2002；54:320–326)。

姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。Niti Mittal等人以及NurullahogluAtalik KE等人的研究发现姜黄素对于疼痛具有较好的镇痛作用(Niti Mittal,Rupa Joshi,DebasishHota，Amitava Chakrabarti.Evaluation of Antihyperalgesic Effect of Curcumin onFormalin-Induced Orofacial Pain in Rat.Phytother.Res.2009；23,507–512；Nurullahoglu Atalik KE,Okudan N,Belviranli M,Oz M.The comparison ofpreemptive analgesic effects of curcumin and diclofenac.Bratisl Lek Listy2014；115(12))。

随着研究的深入，人们发现将姜黄素和双氯芬酸联用具有一些积极的效果，如产生镇痛的协同增效作用、降低双氯芬酸胃肠道刺激、改善双氯芬酸的肾毒性等。MarcoA等人发现，将双氯芬酸和姜黄素联用用于镇痛治疗，可以产生较好的协同增效作用(MarcoA.DePaz-Campos,Mario I.Ortiz et al.Synergistic effect of the interactionbetween curcumin and diclofenac on the formalin test in rats.Phytomedicine 21(2014)1543–1548)。DP Singh等人发现，姜黄素可以防治服用双氯芬酸钠产生的胃肠道不适(DP Singh,SP Borse,R Rana,M Nivsarkar.Curcumin,a component of turmeric,efficiently prevents diclofenac sodium-induced gastroenteropathic damage inrats:A step towards translational medicine.Food&Chemical Toxicology 2017；108)。Ahmady Y等人发现姜黄素可以缓解双氯芬酸造成的肾毒性(Ahmady Y.Ahmed,AmanyM.Gad,Ola M.Abd El-Raouf.Curcumin ameliorates diclofenac sodium-inducednephrotoxicity in male albino rats.J Biochem Mol Toxicol.2017；e21951)。不过，这些研究仍无法解决NSAIDs药效时间短的问题。

红花是中国重要的中草药，为菊科植物的干燥花。红花黄素是从红花中提取出来的一种色素，其具有扩张冠状动脉、抗氧化、保护心肌、降血压、免疫抑制和脑保护等多种药理功能。BIN CHEN等人研究发现红花黄素对于LPS引起的椎间盘炎症具有较好的治疗效果(BIN CHEN,HAN-TAO WANG,BO YU et al.Carthamin yellow inhibits matrixdegradation and inflammation induced by LPS in the intervertebral disc viasuppression of MAPK pathway activation.EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE2017；1614-1620)。周晓勇的研究证明了复方红花注射液对于膝骨性关节炎膝痛具有良好的治疗效果(周晓勇.复方红花注射液穴位注射缓解膝骨性关节炎膝痛症状[J].中国组织工程研究,2004,8(11):2116-2116.)。陈传新等人发现红花散对于料伤五攒痛有着较好的治疗效果(陈传新,毕玉霞,郭庆华,等.红花散治疗料伤五攒痛[J].河南畜牧兽医:综合版,1994(4):34-35.)。

黄芪甲苷是一种从黄芪上提取出来的高纯度药物，有“超级黄芪多糖”之称，其具有增强机体免疫力、提高机体的抗病能力、抗病毒、抗应激、促进细胞生长、改善心肺功能等作用，同时也具有一定的保肝、抗炎(黄珏,钟君.黄芪甲苷联合多爱肤敷料应用于肠瘘伴中重度皮炎患者[J].护理学杂志,2017,32(22):38-40.)和镇痛作用(刘春.复元镇痛汤组分鉴定方法研究[D].北京中医药大学,2006)。另外，最近研究者们还发现黄芪甲苷对于阿司匹林引起的胃粘膜损伤还具有保护作用(Dan-dan Fan,Shan Lin,Yan-ping Song,etal.Astragaloside IV protects rat gastric mucosa against aspirin-induceddamage.International Immunopharmacology41(2016)47–55)。

杨苏钰等人发现，当将黄芪甲苷和姜黄素配伍后，对于人卵巢癌HO-8910原位移植瘤的抑瘤具有协同增效作用(杨苏钰,唐德才,曹子丰,等.黄芪甲苷配伍姜黄素对人卵巢癌HO-8910原位移植瘤转移的抑瘤作用[J]；中国实验方剂学杂质；2017年第6期)。SHUO ZHANG等人也发现黄芪甲苷和姜黄素联用对人肝细胞癌的抑瘤也具有协同增效作用(SHUOZHANG1,DECAI TANG1,WENHUA ZANG,et al.Synergistic Inhibitory Effect ofTraditional Chinese Medicine Astragaloside IV and Curcumin on Tumor Growthand Angiogenesis in an Orthotopic Nude-Mouse Model of Human HepatocellularCarcinoma.ANTICANCER RESEARCH 37:465-474(2017))。

如上所述，虽然传统中药中的一些活性成分具有广泛的医用作用，但各种活性成分间的相互作用仍处于不断摸索阶段。特别的，虽然人们已经知道姜黄素与NSAIDs药物双氯芬酸在镇痛方面具有协同增效作用，且鉴于NSAIDs是短效且仅常用于轻度疼痛治疗，能否通过加入其它药物进一步增强镇痛药效，延长药效时间并降低副作用，是扩大NSAIDs药物用途的一个有意义的研究方向。

另外，在实际的用药过程中，如何提高药物的生物利用度，也是一个不容忽视的问题。例如，由于姜黄素是一种水溶性差、生物利用度不佳的药物，研究者们需研发提高其生物利用度的制剂(Rumjhum Agrawal,Simarjot Kaur Sandhu,Ikksheta Sharma,etal.Development and Evaluation ofCurcumin-loaded Elastic Vesicles as anEffective Topical Anti-inflammatory Formulation.AAPS PharmSciTech.2015Apr；16(2):364-74.)。

因此，当构建药物组合物时，还需考虑适宜的药物载体，以期获得最佳的药效。一般而言，纳米制剂由于更佳的载药率，出于进一步降低NSAIDs药物的副作用以保证用药安全性而言，制备相应的纳米制剂是更为可取的。Manvelian等人研究发现将双氯芬酸装载在亚微米微粒中可以更好的发挥药效(Manvelian G,Daniels S,GibofskyA.A phase 2studyevaluating the efficacy and safety of a novel,proprietary,nano-formulated,lower dose oral diclofenac.Pain Med 2012；13:1491–1498)；Manvelian等人发现纳米制剂可以促进双氯芬酸的吸收(Nadri S,Mahmoudvand H,Vahabi S.Effect ofmagnesiumsulfate on morphine activity retention to control pain afterherniorrhaphy.Pain 2017；7:119–125)；Vahabi S发现在低剂量下，纳米制剂具有更好的镇痛效果(Vahabi S,RafeianY,Abbas ZadehA.The eff ects ofintraoperative esmololinfusion onthe postoperative pain and hemodynamic stability afterrhinoplasty.J Investig Surg 2017；1–7)。

综上所述，能否通过药物之间的联用，加入中药活性成分进一步增强NSAIDs药物的镇痛作用、延长镇痛时间并进一步降低NSAIDs药物的副作用，是一项非常值得研究的课题。在此基础上，研究适宜的纳米制剂，也是值得关注的。

发明内容

基于现有技术的需求以及针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种长效镇痛的药物组合物。该组合物中的活性成分具有显著的协同增效作用，具有更好的镇痛效果和长效的镇痛作用，同时还能防止双氯芬酸对于胃肠道的损伤。另外，该组合物长期服用无成瘾性。所述药物组合物中的活性成分，按重量份计包括如下组分：

双氯芬酸8～12份，黄芪甲苷3～5份，姜黄素2～3份，红花黄素2～3份。

双氯芬酸作为传统的NSAIDs药物，一直受到广泛的关注。姜黄素由于可以抑制大脑小胶质细胞中的JAK-STAT信号通路而具有抗炎作用，得到了一定程度的应用。另外，Sharma等人发现姜黄素在糖尿病性神经痛方面具有较好的治疗作用(Sharma S,KulkarniSK,Agrewala JN,Chopra K.2006.Curcumin attenuates thermal hyperalgesia in adiabetic mouse model ofneuropathic pain.Eur J Pharmacol 536:256–261.)。其它的研究成果也表明姜黄素具有良好的镇痛作用。

在前期的调研中，我们知道双氯芬酸和姜黄素在镇痛方面产生协同增效作用(Phytomedicine 21(2014)1543–1548)。不过，通过我们的预实验，我们发现双氯芬酸联用姜黄素并不能延长药效的作用时间，这对于一些创伤较大的手术或者较为剧烈的慢性疼痛的治疗而言，并不能产生让人满意的效果。基于此，我们开展了进一步增强镇痛效果和镇痛时间的研究。

通过文献调研，我们发现黄芪甲苷和姜黄素在治疗肿瘤方面具有协同增效作用(ANTICANCER RESEARCH 37:465-474(2017))。我们设想，是否可以通过黄芪甲苷和姜黄素的联用，可以获得在镇痛方面的协同作用。然而，通过实验，我们发现，黄芪甲苷和姜黄素在镇痛方面并不产生协同作用。之后，我们将黄芪甲苷、姜黄素和双氯芬酸三者联用，发现黄芪甲苷的加入同样也没有增强姜黄素和双氯芬酸联用带来的镇痛效果。

通过大量的实验摸索，我们惊喜的发现，将红花黄素加入后，构建四药联用的药物组合物，大幅度的提高了姜黄素和双氯芬酸两者联用的镇痛效果。更让人惊喜的是本发明的药物组合物明显的延长了镇痛的作用时间。得到该结果后，为了考察该结果的获得是否是因为红花黄素与姜黄素和双氯芬酸之间有协同作用，我们将黄芪甲苷删除，构建三药联用的药物组合物。奇怪的是，所得的协同作用却消失了。因此，可以得出初步结论：红花黄素、姜黄素、黄芪甲苷和双氯芬酸的组合物在镇痛效果方面存在协同增效作用，并意外产生延长镇痛作用时间的效果。

红花黄素是从红花中提取出来的一种黄酮类化合物，通常作为食物色素添加剂使用。由于红花也是传统中药，其也作为促进血液循环和镇痛药物使用(Kohno Y,Totsuka K,Ikoma S,Yoda K,Shibata M,Matsushima R,Tomita Y,Maeda Y and Kobayashi K:Photostability enhancement of anionic natural dye by intercalation intohydrotalcite.J Colloid Interface Sci 337:117-121,2009.)。

在本发明中，关于红花黄素在疼痛预防和治疗方面，如何与姜黄素、黄芪甲苷和双氯芬酸产生协同作用，还需进行进一步的实验验证。

有些药物之间的协同作用是由于形成的络合物或者盐促进了其中成分的溶解性和吸收。而本发明中的相关实验是通过不同注射方式进行，这表明本发明所得的协同作用有可能是不同镇痛机制的综合作用产生的。同时，可得的初步猜想为：红花黄素和黄芪甲苷在这种不同机制综合作用的产生中分别起着关键的、不可或缺的作用。

我们先利用小鼠颈背部皮下注射福尔马林致痛模型进行了初步的镇痛实验，通过观察舔足反应时间，发现本发明的药物组合物具有令人惊喜的镇痛效果，其对于疼痛的抑制率大幅优于双氯芬酸和姜黄素组合物。

为了进一步验证本发明的镇痛效果，我们采取了不同致痛方案，通过爪压力测试对本发明的药物组合物的镇痛效果进行考察。结果表明，本发明的药物组合物对于多种条件引起的疼痛，均有显著的治疗效果。

在上述基础上，我们还利用兔子作为实验对象，采用福尔马林致痛模型和热板法致痛模型，考察了本发明药物组合物的镇痛效果。结果证明本发明药物组合物具有很好的镇痛效果。

为了考察本发明药物组合物对于炎性疼痛的镇痛作用时间，我们采用大鼠足底角叉菜胶注射致痛模型，测试了大鼠脚掌的疼痛阈值。我们发现，本发明药物组合物的镇痛时间可长达96个小时，这对于需要长时使用镇痛剂的病人来说，减少给药次数无疑增加了方便性和依从性。不过，如上述其它镇痛实验一样，当从本发明的药物组合物中删除黄芪甲苷或红花黄素后，这种药效时间的延长效果同样也消失了。另外，本发明的药物组合物同样也具有很好的抗炎效果。

此外，我们还考察了本发明药物组合物对于胃肠道的影响。结果表明本发明药物组合物对胃肠道不产生损伤。

在上述研究结果的基础上，本领域技术人员很容易知晓，可以在本发明的药物组合物的基础上添加任何药学上可接受的辅料；同时，也可以利用任何药学上可接受的载体对本发明的药物进行装载；还可以将本发明的药物组合物制成任何药物剂型，这些剂型包括固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的任何一种。

一般而言，无论是在实验室研究阶段还是在临床验证阶段，大量的研究表明纳米制剂在降低药物用量、提高药效、控制释药行为和降低药物毒副作用方面具有明显的优势。在NSAIDs的制剂制备上，纳米制剂也得到了广泛的应用，并取得了良好的效果(ManvelianG,Daniels S,GibofskyA.Aphase 2 study evaluating the efficacy and safety of anovel,proprietary,nano-formulated,lower dose oral diclofenac.Pain Med 2012；13:1491–1498)。因此，将本发明的药物组合物制备成纳米制剂是很有前景的。自然地，在本发明的一个可实施的方案中，本发明的药物组合物的剂型为纳米制剂。

由于纳米脂质体是纳米剂型中常见的一种，因此，在本发明的一个可实施的方案中，本发明所述的纳米制剂为纳米脂质体制剂。

在我们选择纳米脂质体作为药物载体时发现利用现有的脂质体制备技术比较难获得粒径分布窄的纳米脂质体，这可能是受到药物特性的一些影响。纳米制剂的粒径分布稳定，特别是稳定在较窄范围内，更利于制剂的质量品质控制。通过考察，我们选择了多种制备原料，最终发现当添加水溶性维生素E和聚山梨酯时，可以获得粒径窄分布的纳米脂质体。在此方面的摸索过程中，我们参考双氯芬酸纳米脂质体常用表面活性剂F-68(Li H,Qiao H,Lu H et al.Evaluation of the peripheral analgesic effect ofsufentanillipidnanoparticles.JAnesth 2014；28:702–707)、姜黄素纳米脂质体所用表面活性剂水溶性维生素E(CN 102008439 B)均无法得到良好的粒径控制效果。最终，我们发现，水溶性维生素E和聚山梨酯的同时添加，可以产生很好的粒径控制作用。

具体的，在制备装载本发明药物组合物的纳米脂质体时，所采用的方法如下：

(1)按药脂比1:45～55，将所述重量份的双氯芬酸、黄芪甲苷和姜黄素、胆固醇、大豆卵磷脂、水溶性维生素E、聚山梨酯溶于甲醇中，旋转蒸发除去甲醇成膜，加入硫酸铵，然后进行超声处理，再用脂质体挤压器过200nm聚碳脂膜，再用PBS溶液更换脂质体外相液；

(2)按药脂比1:50～58，将所述重量份的红花黄素加入步骤(1)所得物，加温充分震荡，即得到所述纳米脂质体；

所述胆固醇、大豆卵磷脂、水溶性维生素E、聚山梨酯的重量比为1:(15～25):(0.5～0.8):(0.3～0.5)。

由于本发明所得的药物组合物具有良好的镇痛效果，因此，本发明的另外一个目的在于提供所述药物组合物及其所得制剂在制备预防和/或治疗疼痛药物方面的应用。所述疼痛包括术后疼痛、外伤疼痛、炎性疼痛、关节疼痛中的任意一种。

本发明的有益效果：

本发明所得药物组合物具有显著的镇痛效果，其镇痛作用时间较长，适合较为强烈及持续时间较长的疼痛的预防及治疗。本发明所得纳米脂质体的粒径分布窄，利于制剂的质量控制。本发明在疼痛的预防和治疗方面具有良好的应用潜力。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.受试动物

雄性昆明种小鼠，18～22g。在光照周期12/12h、温度25℃下饲养3天后，用于正式试验。

2.药品

双氯芬酸注射液、黄芪甲苷、姜黄素和红花黄素均为市售产品。姜黄素购于SigmaChemicals，纯度为65～70％；黄芪甲苷、双氯芬酸注射液和红花黄素为国内市售产品(南京泽朗医药科技有限公司)。

将姜黄素充分溶于二甲基亚砜(DMSO)中，红花黄素溶于PBS溶液中。

3.方法

选取小鼠100只，随机分为生理盐水组、A组、B组、C组、实验组，共5组，每组20只。其中除了生理盐水组之外，其它组均为给药组。

其中，A组为姜黄素和双氯芬酸联合用药组，姜黄素的皮下注射量为5mg/kg，双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg；B组为姜黄素、双氯芬酸、红花黄素的联合用药组，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，红花黄素的皮下注射量为1mg/kg；C组为姜黄素、双氯芬酸、黄芪甲苷的联合用药组，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为2mg/kg；实验组中，双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为2mg/kg，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，红花黄素的皮下注射量为1mg/kg。

采用上述各组进行注射后，在小鼠左足足底皮下注射5％福尔马林溶液20μl，观察记录福尔马林注射后60min内小鼠的活动情况。以5min为一单元，统计小鼠各单元累积舔足时间，以前两个单元(1-10min)的舔足时间为1相舔足时间，反映中枢急性疼痛情况；以10-60min的舔足时间为2相舔足时间，反映炎症引起的慢性疼痛情况。按照以下公式评价疼痛抑制率：

疼痛抑制率＝(生理盐水组第二相舔足时间-给药组第二相舔足时间)÷生理盐水组第二相舔足时间×100％。

4.结果

各组对于2相疼痛抑制率的影响如表1所示。

表1

如表1所示，我们起初抱着考察黄芪甲苷的加入是否会如其与姜黄素在肿瘤治疗方面那般，也存在协同作用的目的，进行了相应的研究。但发现在姜黄素和双氯芬酸的基础上加入黄芪甲苷并不能增强镇痛作用。通过不断的摸索，我们很意外的发现，在双氯芬酸、姜黄素和黄芪甲苷的基础上，加入红花黄素显著的提高了所得药物的镇痛作用，其对于2相的炎性疼痛的疼痛抑制率高达97.2％。

由于本次实验的给药方式是皮下注射，我们认为这种协同增效的作用应该不是来自于各种药物间的相互作用导致各自的生物利用度的提高，而很可能是由于四种药物的联合使用产生了相应不同疼痛治疗机制的综合作用。为了进一步考察药用量的影响，我们在上述实验的基础上，开展了药用量对疼痛治疗影响的实验。

按照同样实验条件，我们将实验组中的各药物的皮下注射量调整如下，并分为5组：

1组：双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为1mg/kg，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，红花黄素的皮下注射量为0.5mg/kg。

2组：双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为1mg/kg，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，红花黄素的皮下注射量为1mg/kg。

3组：双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为2mg/kg，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，红花黄素的皮下注射量为0.5mg/kg。

我们认为，黄芪甲苷和红花黄素可能是产生上述治疗效果的关键，因此，在上述三组中，我们分别调低了其各自的药用量。

4组：双氯芬酸的皮下注射量为6mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为2.5mg/kg，姜黄素的皮下注射量为1.5mg/kg，红花黄素的皮下注射量为1.5mg/kg。

5组：双氯芬酸的皮下注射量为4mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为1.5mg/kg，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，红花黄素的皮下注射量为1mg/kg。

按照同样的评价方法，我们得到上述5组的2相疼痛抑制率，如表2所示：

表2

如表2所示，虽然黄芪甲苷和红花黄素的有无对于协同增效作用的有无是至关重要的，但其药用量的多寡也影响着协同增效作用的有无。当黄芪甲苷和红花黄素中至少一种的用量过低时，均不能产生协同增效作用，这进一步提示我们这种协同增效的作用很可能是不同治疗机制之间的综合影响所致。这一部分的内容将在后续的实验工作中进一步的摸索。

实施例2

在实施例1实验结果的基础上，我们考察了不同致痛方案下的疼痛治疗效果。

1.受试动物

雄性Sprague Dawley大鼠，150-200g，正常饲养三周后，进行爪压力测试。

2.药品

双氯芬酸注射液、黄芪甲苷、姜黄素和红花黄素均为市售产品。姜黄素购于SigmaChemicals，纯度为65～70％；黄芪甲苷、双氯芬酸注射液、红花黄素、长春新碱、碘醋酸一钠、胰腺毒素链脲霉素为国内市售产品(南京泽朗医药科技有限公司)。

将姜黄素充分溶于二甲基亚砜(DMSO)中，红花黄素溶于PBS溶液中。

3.方法

分为如下2组进行：

一组：将长春新碱以150μg/kg静脉注射入大鼠，第2天按实施例1的方法注射药物，药物的注射量为：双氯芬酸的皮下注射量为10mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为4mg/kg，姜黄素的皮下注射量为2mg/kg，红花黄素的皮下注射量为2mg/kg；用药后进行爪压力测试。

二组：将2mg的碘醋酸一钠单次给药至经麻醉后的大鼠关节腔，致关节炎后，按实施例1的方法注射药物，药物的注射量为：双氯芬酸的皮下注射量为10mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为4mg/kg，姜黄素的皮下注射量为2mg/kg，红花黄素的皮下注射量为2mg/kg；用药后进行爪压力测试。

实验结果如表3和表4所示。

表3

表4

机械阀值(g)的增加，证明本发明药物组合物在一组和二组中的致痛模型中均具有良好的镇痛作用。

实施例3

为了进一步考察本发明药物组合物的镇痛效果，我们在兔子上也利用福尔马林模型和热板法模型进行了实验。

1.受试动物

18个月大雌性兔子，320-350g。

2.药品

双氯芬酸注射液、黄芪甲苷、姜黄素和红花黄素均为市售产品。姜黄素购于SigmaChemicals，纯度为65～70％；黄芪甲苷、双氯芬酸注射液和红花黄素为国内市售产品(南京泽朗医药科技有限公司)。

将姜黄素充分溶于二甲基亚砜(DMSO)中，红花黄素溶于PBS溶液中。

3.方法

3.1按文献的方法，构建福尔马林模型(Tjolsen A,Berge OG,Hunskaar S etal.The formalin test:an evaluation of the method.Pain 1992；51:5–17.)。与实施例1一致，同样将1-10分钟为1相时间，11-60分钟为2相时间，按照实施例1的方法，考察2相疼痛抑制率。与实施例1不同的是，药物的使用量为：双氯芬酸的皮下注射量为10mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为4mg/kg，姜黄素的皮下注射量为2mg/kg，红花黄素的皮下注射量为2mg/kg。以注射药物一组作为用药组，对照组进行生理盐水注射。

实验表明，对于2相疼痛的抑制率为94.3％。

3.2将兔子的脚置于55℃的热平板上，按3.1的内容进行施药，考察兔子舔足、摆动足、跳足的反应时间。结果如表5所示。

表5热板法测试反应时间结果

反应时间的延长，表明本发明药物组合物具有良好的镇痛作用。

实施例4

在获得镇痛协同作用的基础上，我们考察了本发明药物组合物在镇痛时间方面的情况，出乎意料的是，本发明药物组合物还具备长时镇痛效果，其镇痛时间长达96个小时。

1.受试动物

雄性Sprague Dawley大鼠，150-200g，正常饲养三周后，进行正式实验。

2.药品

双氯芬酸注射液、黄芪甲苷、姜黄素和红花黄素均为市售产品。姜黄素购于SigmaChemicals，纯度为65～70％；黄芪甲苷、双氯芬酸注射液、红花黄素和角叉菜胶为国内市售产品(南京泽朗医药科技有限公司)。

将姜黄素充分溶于二甲基亚砜(DMSO)中，红花黄素溶于PBS溶液中。

取大鼠25只，随机分为生理盐水组、A组、B组、C组、实验组，共5组，每组5只。其中除了生理盐水组之外，其它组均为给药组。

其中，A组为姜黄素和双氯芬酸联合用药组，姜黄素的皮下注射量为5mg/kg，双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg；B组为姜黄素、双氯芬酸、红花黄素的联合用药组，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，红花黄素的皮下注射量为1mg/kg；C组为姜黄素、双氯芬酸、黄芪甲苷的联合用药组，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为2mg/kg；实验组中，双氯芬酸的皮下注射量为5mg/kg，黄芪甲苷的皮下注射量为2mg/kg，姜黄素的皮下注射量为1mg/kg，红花黄素的皮下注射量为1mg/kg。

采用上述各组进行注射后，在1分钟后，接受角叉菜胶足底注射，随后观察镇痛效果。

脚掌压力测试使用TSE镇痛系统。大鼠的脚掌被置于TSE镇痛系统的基座上，并施加从感应器的尖端产生的逐渐增强的压力。在开始测试时，压下足部开关，感应器则降低直到接触到大鼠的脚掌。之后，感应器阶段小幅降低直至疼痛阈值，达到疼痛阈值后，小鼠开始剧烈移动并缩回脚掌。在本实施例中，大鼠的脚掌缩回的压力基线为140～190gm。我们通过测试相应考察时间范围内的疼痛阈值来判定镇痛作用时间。

结果如表6所示。

表6

实施例5

在上述研究结果的基础上，我们将本发明的药物组合物制备成了纳米制剂：

按重量份计准备如下药物：

双氯芬酸10份，黄芪甲苷4份，姜黄素2份，红花黄素2份。

(1)按药脂比1:45～55，将所述重量份的双氯芬酸、黄芪甲苷和姜黄素、胆固醇、大豆卵磷脂、水溶性维生素E、聚山梨酯溶于甲醇中，旋转蒸发除去甲醇成膜，加入硫酸铵，然后进行超声处理，再用脂质体挤压器过200nm聚碳脂膜，再用PBS溶液更换脂质体外相液；

(2)按药脂比1:50～58，将所述重量份的红花黄素加入步骤(1)所得物，加温充分震荡，即得到所述纳米脂质体；

所述胆固醇、大豆卵磷脂、水溶性维生素E、聚山梨酯的重量比为1:20:0.6:0.4。

对比例1

除了不使用聚山梨酯之外，其余与实施例5一致。

对比例2

除了不使用水溶性维生素E之外，其余与实施例5一致。

对比例3

除了将水溶性维生素E替换为F-68(Li H,Qiao H,Lu H et al.Evaluation ofthe peripheral analgesic effect of sufentanil lipid nanoparticles.JAnesth2014；28:702–707)，其余与对比例1一致。

我们考察了不同制备方法所得纳米脂质体的粒径分布情况，如表7所示。

表7所得纳米脂质体粒径分布情况

如表7所示，按照本发明实施例5制备得到的纳米脂质体的粒径是高度分布在120～140nm范围的，在其它粒径尺寸范围方面的分布比例很小，这十分利于制剂的质量控制。而对比例1～3所得的粒径分布十分分散，这不利于制剂质量的控制。

Claims (10)

1.一种治疗长时疼痛的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中的活性成分，按重量份计由如下组分组成：

双氯芬酸 8~12份、黄芪甲苷 3~5份、姜黄素 2~3份和红花黄素 2~3份。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

4.根据权利要求1~3任一项所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的任何一种。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为纳米制剂。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述纳米制剂为纳米脂质体制剂。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述纳米脂质体的制备原料包括：所述活性成分、大豆卵磷脂、胆固醇、水溶性维生素E和聚山梨酯。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述纳米脂质体的制备方法包括如下步骤：

（1）按药脂比1:45~55，将所述重量份的双氯芬酸、黄芪甲苷和姜黄素、胆固醇、大豆卵磷脂、水溶性维生素E、聚山梨酯溶于甲醇中，旋转蒸发除去甲醇成膜，加入硫酸铵，然后进行超声处理，再用脂质体挤压器过200nm聚碳脂膜，再用PBS溶液更换脂质体外相液；

（2）按药脂比1:50~58，将所述重量份的红花黄素加入步骤（1）所得物，加温充分震荡，即得到所述纳米脂质体；

所述胆固醇、大豆卵磷脂、水溶性维生素E、聚山梨酯的重量比为1:(15~25):(0.5~0.8):(0.3~0.5)。

9.权利要求1~3、5~8中任一项所述药物组合物在制备预防和/或治疗疼痛药物方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疼痛包括术后疼痛、外伤疼痛、炎性疼痛、关节疼痛中的任意一种。