CN108646036B - 定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条及其使用方法 - Google Patents

定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，包括结合垫、NC膜，所述结合垫由鼠抗α‑FSH单克隆抗体与胶体金标记形成结合物并喷涂于玻璃纤维膜上制得；所述NC膜由鼠抗β‑LH单克隆抗体、鼠抗β‑FSH单克隆抗体及抗鼠IgG多克隆抗体分别在硝酸纤维膜上划线并依次形成检测线T1线、检测线T2线和质控线C线制得。采用本发明的试剂条，实现了对血清中卵泡刺激素与促黄体生成素的联合定量检测，不仅提供了便捷、准确的检测方法，还为寻找高敏感度、特异度肿瘤标志物及血清参考值范围提供理论依据，以利于早期卵巢癌的辅助诊断，对于卵巢癌的诊断研究具有显著的应用意义。

Description

定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条及其使用 方法
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，以及该试剂条的使用方法。
背景技术
卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤，其中浆液性肿瘤最为常见，据统计，70％的浆液性卵巢癌患者就诊时已处于晚期，因此提高卵巢癌患者的早期诊断率十分必要，而目前在卵巢癌的早期诊断技术方面存在诸多不足，如卵巢癌在无转移即只局限于卵巢时，超声及其他影像学方法较难诊断；当前对卵巢癌的确诊主要依赖于病理活检，但活检存在有创性及不适于大规模筛查的缺点；另外，在卵巢癌的诊断和评估预后的肿瘤标志物中，血清CA125及血清HE4的作用最为重要，但其敏感度、特异度相对较低。
随着流行病学的研究发现，体内卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)的水平有可能参与卵巢癌的发展。体外实验证实FSH、LH能够促进卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭，抑制卵巢癌细胞凋亡，诱导卵巢上皮组织发生上皮间质转化；上皮性卵巢癌患者血清及囊性肿物液体内的FSH、LH值均明显高于其他对照组；复发组卵巢癌患者血清FSH水平显著高于原发组等；都提示着FSH、LH参与卵巢癌的发展。目前国内外对于FSH、LH与卵巢癌的研究主要侧重于机制方面，而对于血清FSH、LH与卵巢癌临床病理特征、患者预后及两者联合检测预测卵巢癌价值的研究较少。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，该试剂条可用于同时定量检测血清中卵泡刺激素与促黄体生成素水平，而且检测方法便捷、检测结果准确，对于卵巢癌的诊断研究具有显著的应用意义。
为实现上述目的，本发明提供的定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，包括结合垫、NC膜，所述结合垫由鼠抗α-FSH单克隆抗体与胶体金标记形成结合物并喷涂于玻璃纤维膜上制得；所述NC膜由鼠抗β-LH单克隆抗体、鼠抗β-FSH单克隆抗体及抗鼠IgG多克隆抗体分别在硝酸纤维膜上划线并依次形成检测线T1线、检测线T2线和质控线C线制得；
所述鼠抗α-FSH单克隆抗体、鼠抗β-LH单克隆抗体和鼠抗β-FSH单克隆抗体的制备均通过采用杂交瘤技术和有限稀释法对细胞株进行克隆筛选，并在制备过程采用免疫抗原及与卵泡刺激素、促黄体生成素两种激素结构分别相似的促甲状腺素和人绒毛膜促性腺激素进行筛选；获得的杂交瘤细胞注射至小鼠体内取得腹水，再以辛酸-硫酸铵法进行各单克隆抗体的纯化，最后经双抗体夹心ELISA筛选得到鼠抗α-FSH单克隆抗体与β-LH单克隆抗体、鼠抗α-FSH单克隆抗体与β-FSH单克隆抗体的配对抗体。
本发明的定量联合检测卵泡刺激素(FSH)与促黄体生成素(LH)的试剂条，其结合垫上喷涂的与胶体金标记形成结合物的抗体物质，及NC膜上检测线T1线、T2线分别选取的抗体物质，是构成试剂条的关键，依据FSH与LH两种激素在分子结构的特性，选择鼠抗α-FSH单克隆抗体、鼠抗β-LH单克隆抗体和鼠抗β-FSH单克隆抗体三种高特异性单克隆抗体分别作为胶体金标记结合物、检测线标记物，并以抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线C线，通过抗体间的相互匹配及与待检测物的结合，不仅能够完成对血清中FSH与LH水平的联合检测，还可以消除联合检测中FSH与LH的相互干扰，实现两种激素水平的准确定量，从而为血清中FSH与LH的检测提供了便捷、准确的方法，进而为寻找高敏感度、特异度肿瘤标志物及血清参考值范围提供理论依据，以利于早期卵巢癌的辅助诊断。而三种单克隆抗体的制备，在采用杂交瘤技术和有限稀释法的克隆、筛选过程，除使用免疫抗原筛选外，还采用了与卵泡刺激素、促黄体生成素两种激素结构相似的促甲状腺素和人绒毛膜促性腺激素进行筛选，从而显著提高各单克隆抗体的特异性，以满足试剂条对定量联合检测的需求。
作为对上述技术方案的限定，所述结合垫上的结合物中每毫升胶体金标记鼠抗α-FSH单克隆抗体的质量为25～35μg。
作为对上述技术方案的限定，所述NC膜上的质控线C线包被抗鼠IgG多克隆抗体浓度为0.3～0.6mg/mL；检测线T1线包被鼠抗β-LH单克隆抗体浓度为0.8～1.2mg/mL，检测线T2线包被鼠抗β-FSH单克隆抗体浓度为1.2～1.8mg/mL。
进一步限定结合垫、NC膜上各抗体的包被量，以使血清FSH与LH水平的定量测定更准确，消除数据偏差。
作为对上述技术方案的限定，所述鼠抗α-FSH单克隆抗体、鼠抗β-LH单克隆抗体和鼠抗β-FSH单克隆抗体均经由以下方法获得：
a、单克隆抗体的制备与纯化：分别以人α-FSH蛋白、人β-LH蛋白和人β-FSH蛋白作为免疫抗原，免疫6周龄健康BALB/c雌性小鼠，采用杂交瘤技术制备、筛选单克隆抗体细胞株，在筛选过程中还选用与卵泡刺激素、促黄体生成素两种激素结构分别相似的促甲状腺素和人绒毛膜促性腺激素作为非特异性抗原进行筛选；筛选得到的特异性抗体细胞株注射到小鼠体内制备腹水，再将腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得单克隆抗体；
b、单克隆抗体的筛选：经步骤a得到的单克隆抗体细胞株，需经ELISA检测效价均在20*104以上，亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG2b；经蛋白纯化，得到纯化后蛋白含量为18.8～35.4mg/ml；经ELISA相加试验检测得到配对抗体，要求相加指数AI均在95％以上。
采用杂交瘤技术，分别以人α-FSH蛋白、人β-LH蛋白和人β-FSH蛋白作为免疫抗原，制备鼠抗α-FSH单克隆抗体、鼠抗β-LH单克隆抗体和鼠抗β-FSH单克隆抗体三种具有很高特异性的抗体，再选用与卵泡刺激素、促黄体生成素两种激素结构分别相似的促甲状腺素和人绒毛膜促性腺激素作为非特异性抗原进行筛选，通过此筛选步骤可提高制备的单克隆抗体的特异性，最后经ELISA相加试验得到配对抗体，使抗体结合抗原的不同构象表位且距离很远，更适合于试纸条的制备。
作为对上述技术方案的限定，所述试剂条主要由背衬、样品垫、结合垫、NC膜及吸收垫经组装、切割制得。
采用本发明的结合垫与NC膜，再结合背衬、样品垫、吸收垫等结构，组装、切割制得双抗夹心胶体金免疫层析试剂条，便于试剂条的应用。
作为对上述技术方案的限定，所述试剂条对卵泡刺激素的检测范围为10～200mIU/mL，对促黄体生成素的检测范围为10～200mIU/mL。
本发明的试剂条对FSH与LH的浓度检测范围较宽，最低检测浓度均可达10mIU/mL，利于检测得到准确的由血清FSH、LH诊断浆液性卵巢癌患者的最佳临界值。
同时，本发明还提供了一种定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条的使用方法，使用如上所述的试剂条用于对血清中卵泡刺激素与促黄体生成素进行定量联合测定，检测操作包括以下步骤：
取100μL待检测血样滴加到试剂条的样品垫，然后将试剂条插置于胶体金分析仪上，经10min后读取一条质控线和两条检测线对应的OD值，根据OD值分别计算卵泡刺激素与促黄体生成素的浓度结果。
作为对上述技术方案的限定，所述卵泡刺激素与促黄体生成素浓度的计算分别依据得到的标准卵泡刺激素浓度与OD值对应的线性方程式、标准促黄体生成素浓度与OD值对应的线性方程式进行计算。
同时，本发明还提供了利用试剂条对血清FSH、LH进行定量联合测定的使用方法，借助两种激素稀释度、浓度分别与OD值的相关性，实现定量检测。
综上所述，采用本发明的技术方案，获得的定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，选择鼠抗α-FSH单克隆抗体与胶体金标记形成结合物喷涂在玻璃纤维膜上构成结合垫，同时选择由鼠抗β-LH单克隆抗体、鼠抗β-FSH单克隆抗体及抗鼠IgG多克隆抗体分别在硝酸纤维膜上划线并依次形成检测线T1线、检测线T2线和质控线C线以构成NC膜，实现对血清中FSH与LH水平的联合定量检测，不仅提供了便捷、准确的检测方法，还为寻找高敏感度、特异度肿瘤标志物及血清参考值范围提供理论依据，以利于早期卵巢癌的辅助诊断，对于卵巢癌的诊断研究具有显著的应用意义。
附图说明
图1为本发明所述定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条的结构示意图；
图2为本发明所述各单克隆抗体的制备过程示意图；
图3为本发明涉及的FSH、LH稀释度(n)与OD值的关系图；
图4为本发明涉及的FSH、LH浓度与OD值的标准曲线图；
图中：1、背衬；2、NC膜；3、吸收垫；4、结合垫；5、检测线T1线；6、检测线T2线；7、质控线C线；8、样品垫。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本实施例涉及一种定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条及其制备。
定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，结构可如图1所示，由背衬1、样品垫8、结合垫4、NC膜2及吸收垫3等结构，经组装、切割制得双抗夹心胶体金免疫层析试剂条，其技术核心在于结合垫与NC膜；
所述结合垫4由鼠抗α-FSH单克隆抗体与胶体金标记形成结合物并喷涂于玻璃纤维膜上制得，每毫升胶体金标记鼠抗α-FSH单克隆抗体浓度为30μg；
所述NC膜2由鼠抗β-LH单克隆抗体、鼠抗β-FSH单克隆抗体及抗鼠IgG多克隆抗体分别在硝酸纤维膜上划线并依次形成检测线T1线5、检测线T2线6和质控线C线7制得，检测线T1线包被鼠抗β-LH单克隆抗体浓度为1mg/mL，检测线T2线包被鼠抗β-FSH单克隆抗体浓度为1.5mg/mL，质控线C线包被抗鼠IgG浓度为0.5mg/mL，抗鼠IgG多克隆抗体使用市售品；
所述鼠抗α-FSH单克隆抗体、鼠抗β-LH单克隆抗体和鼠抗β-FSH单克隆抗体均分别采用杂交瘤技术和有限稀释法制备与纯化，然后经双抗体夹心ELISA筛选得到鼠抗α-FSH单克隆抗体与β-LH单克隆抗体的配对抗体，及鼠抗α-FSH单克隆抗体与β-FSH单克隆抗体的配对抗体；所述鼠抗α-FSH单克隆抗体、鼠抗β-LH单克隆抗体和鼠抗β-FSH单克隆抗体的制备、纯化、筛选过程包括以下步骤：
a、单克隆抗体的制备与纯化：如图2所示，分别以人α-FSH蛋白、人β-LH蛋白和人β-FSH蛋白作为免疫抗原，免疫6周龄健康BALB/c雌性小鼠，采用杂交瘤技术制备、筛选单克隆抗体细胞株，在筛选过程中选用与卵泡刺激素、促黄体生成素两种激素结构相似的促甲状腺素和人绒毛膜促性腺激素作为非特异性抗原进行筛选，然后将筛选出的实验命名1F5E2B12C4、6C6F12E12、3D11G12A6的特异性抗体细胞株注射到小鼠体内制备腹水，再将腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体；
b、单克隆抗体的筛选：经步骤a得到的单克隆抗体细胞株，需经ELISA检测效价均在20*104以上，亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG2b；经蛋白纯化，得到纯化后蛋白含量为18.8～35.4mg/ml；经ELISA相加试验检测得到配对抗体，要求相加指数AI均在95％以上。其抗体所结合抗原的不同构象表位且距离很远，适合于双抗夹心胶体金免疫层析试纸条的制备。
实施例二
本实施例涉及本发明试剂条对血样检测的灵敏度验证及联合检测标准曲线的绘制。
模拟添加有FSH、LH的血样，初始浓度为200mIU/mL，按2n(n＝0，1，2……)倍比稀释，稀释后浓度分别为200mIU/mL、100mIU/mL、50mIU/mL、25mIU/mL、12.5mIU/mL、6.25mIU/mL，并设定空白0mIU/mL，然后进行FSH、LH的联合测定。
联合测定操作：用吸管各取稀释血样及空白样100μL分别滴加在7个样品垫上，然后插置在胶体金分析仪上，经10min后，将仪器连接至电脑，读取相应的OD值。
根据检测数据绘制出FSH、LH不同稀释度与OD值的关系图，如图3所示，以及FSH、LH不同浓度与OD值的标准曲线图，如图4所示。由此可见，样品中FSH、LH的浓度与OD值成正比，因此可由待检测样品OD值计算出血样中FSH、LH的物质含量。
经检测，本试剂条对FSH的检测范围为10～200mIU/mL，其最低检测浓度达10mIU/mL；对LH的检测范围为10～200mIU/mL，其最低检测浓度达10mIU/mL。
实施例三
本实施例涉及使用本发明试剂条对患者血样的检测结果验证。
Figure BDA0001648704890000081
通过患者血样检测得到血清FSH、LH诊断浆液性卵巢癌患者的最佳临界值分别为29.12m IU/ml、26.76m IU/ml。
综上所述，采用本发明的技术方案获得的定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，通过选择结合垫上胶体金标记结合物的抗体物质，及NC膜上检测线T1线、T2线及质控线C线的抗体物质，实现了对血清中FSH与LH水平的联合定量检测，提供了一种便捷、准确的检测方法，以利于早期卵巢癌的辅助诊断。

Claims (6)

1.一种定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，包括结合垫、NC膜，其特征在于：所述结合垫由鼠抗α-FSH单克隆抗体与胶体金标记形成结合物并喷涂于玻璃纤维膜上制得；所述NC膜由鼠抗β-LH单克隆抗体、鼠抗β-FSH单克隆抗体及抗鼠IgG多克隆抗体分别在硝酸纤维膜上划线并依次形成检测线T1线、检测线T2线和质控线C线制得；
所述鼠抗α-FSH单克隆抗体、鼠抗β-LH单克隆抗体和鼠抗β-FSH单克隆抗体的制备均通过采用杂交瘤技术和有限稀释法对细胞株进行克隆筛选，并在制备过程采用免疫抗原及与卵泡刺激素、促黄体生成素两种激素结构分别相似的促甲状腺素和人绒毛膜促性腺激素进行筛选；获得的杂交瘤细胞注射至小鼠体内取得腹水，再以辛酸-硫酸铵法进行各单克隆抗体的纯化，最后经双抗体夹心ELISA筛选得到鼠抗α-FSH单克隆抗体与鼠抗β-LH单克隆抗体、鼠抗α-FSH单克隆抗体与鼠抗β-FSH单克隆抗体的配对抗体。
2.根据权利要求1所述的定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，其特征在于：所述结合垫上的结合物中每毫升胶体金标记鼠抗α-FSH单克隆抗体的质量为25～35μg。
3.根据权利要求1所述的定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，其特征在于：所述NC膜上的质控线C线包被抗鼠IgG多克隆抗体浓度为0.3～0.6mg/mL；检测线T1线包被鼠抗β-LH单克隆抗体浓度为0.8～1.2mg/mL，检测线T2线包被鼠抗β-FSH单克隆抗体浓度为1.2～1.8mg/mL。
4.根据权利要求1所述的定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，其特征在于：所述鼠抗α-FSH单克隆抗体、鼠抗β-LH单克隆抗体和鼠抗β-FSH单克隆抗体均经由以下方法获得：
a、单克隆抗体的制备与纯化：分别以人α-FSH蛋白、人β-LH蛋白和人β-FSH蛋白作为免疫抗原，免疫6周龄健康BALB/c雌性小鼠，采用杂交瘤技术制备、筛选单克隆抗体细胞株，在筛选过程中还选用与卵泡刺激素、促黄体生成素两种激素结构分别相似的促甲状腺素和人绒毛膜促性腺激素作为非特异性抗原进行筛选；筛选得到的特异性抗体细胞株注射到小鼠体内制备腹水，再将腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得单克隆抗体；
b、单克隆抗体的筛选：经步骤a得到的单克隆抗体细胞株，需经ELISA检测效价均在20*104以上，亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG2b；经蛋白纯化，得到纯化后蛋白含量为18.8～35.4mg/ml；经ELISA相加试验检测得到配对抗体，要求相加指数AI均在95％以上。
5.根据权利要求1所述的定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，其特征在于：所述试剂条主要由背衬、样品垫、结合垫、NC膜及吸收垫经组装、切割制得。
6.根据权利要求1所述的定量联合检测卵泡刺激素与促黄体生成素的试剂条，其特征在于：所述试剂条对卵泡刺激素的检测范围为10～200mIU/mL，对促黄体生成素的检测范围为10～200mIU/mL。
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