CN108642151A - 一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的文库浓度测定方法 - Google Patents

Abstract

本申请的目的是公开一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法，包括步骤一：稀释待测样品，准备标准品，并将两者都低温保存；步骤二：取离心管，在管盖上做好标记，按照下表中的反应体系配制反应混合液，配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系，反应混合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物，配制完成后，将反应混合液振荡，瞬时离心至管底；步骤三：将所述步骤二中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中，向标准品反应孔中分别加入2L的标准品；步骤四：密封所述反应板，使离心反应板，将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR反应，得到文库浓度测定结果；操作简单、流程科学，标准明确，实践操作效果好。

Description

一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法

技术领域

本发明属于无创产前筛查检测领域，具体是指一种胎儿染色体非整倍体 检测中DNA的文库浓度测定方法。

背景技术

染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言细胞中的某一 条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显的发病率和死亡率有着密切 的关系。新生儿中染色体异常的发病率为l/160，其中21三体(唐氏综合征)、 18三体(爱德华氏综合征)和13三体(帕陶氏综合征)是三种最主要常染色体非 整倍体疾病，在新生儿中发病率分别为1/800～1/600、1/7000～1/3500和 1/6000～1/5000。针对染色体疾病的产前检测主要以血清学筛查、羊水穿刺为 主主。但血清学筛查准确度较低，具有5％的假阳性率及20-409％漏诊率；羊 水穿刺虽然准确度较高，但是对孕妇具有创伤性，有19％6的流产风险，不 便于大规模的产前检测。

1997年，Lo等人研究证实在孕妇的血浆中存在有胎儿的游离DNA片段， 为无创DNA产前检测技术提供了依据。通过高通量测序技术可以对这些胎 儿游离DNA进进行检测，利利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行 分析，最终得出胎儿患有21三体、18三体和13三体综合征的风险率。

本检测采用博奥基因“晶芯胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试 剂盒(半导休测序法)”基于高通量测序基本原理，在孕妇血浆中的游离DNA 片段两端加上通用的测序接头，构建好可以用于测序的测序文库。利用乳液 PCR技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，通过对阳性模板进行富集以 达到测序要求。利用半导体测序系统通过在半导体芯片的微孔中固定DNA 链，DNA聚合酶以单链DNA为模板，按碱基互补原理，合成互补的DNA链。DNA链每延伸一个碱基时，就会释释放一个质子，导致局部pH变化， 离子传感器检测pH变化，并将化学信信号转换成数字信号，从而可以实时 判读碱基，最终获得每个DNA片段段的碱基序列。利用生物信息分析把这 些序列定位到人类基因组参考图谱上，计算出样本的游离DNA序列被分配 到每条染色体上的具体数值比例。当胎儿的某条染色体数目增加时，其对应 的游离DNA序列数量会小幅增加，通过半导体测序技术和生物信息学数据 分析可以检测出这种微量变化，从而获得染色体数目的信息，进而实现对21 三体综合征，18三体综合征和13三体综合征进行快速的产前辅助诊断。

因此，高效、准确的检测判断胎儿染色体是否为非整倍体就显得极为重 要，同时也成为了无创产前筛查技术的关键。

按照目前现有的文库浓度测定方法，测定难度大、不准确合理。

因此，如何研发一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定 方法，能够解决上述问题，便成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本申请解决的主要问题是提供一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的 文库浓度测定方法，操作简单、流程科学，标准明确，实践操作效果好，以 解决一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法成本高、流 程不科学，标准不明确，实践操作效果不佳、操作难度高、难以复制操作的 技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种胎儿染色体非整倍体检测中 DNA的文库浓度测定方法，其特征在于，包括：

步骤一：稀释待测样品，准备标准品，并将两者都低温保存；

步骤二：取离心管，在管盖上做好标记，按照下表中的反应体系配制反 应混合液，配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系，反应混 合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物，配制完成后， 将反应混合液振荡10秒，瞬时离心至管底；

步骤三：将所述步骤二中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中， 向标准品反应孔中分别加入2L的标准品，每个反应板同时设置无模板对照 反应孔，孔中加入2uL无核酸酶水；

步骤四：使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板，使用离心机离心 反应板，将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR 反应，得到文库浓度测定结果。

进一步的，所述步骤四中设置程序具体包括：

步骤1：在Plate Setup界界面，选好标准品孔和样本孔，重复系数均为 2；

步骤2：在荧光定量PCR扩增仪上设置程序：先95℃1分钟；后95℃15 秒，65℃15秒，72℃30秒循环30次；再后95℃15秒，65℃1分钟，95℃15 秒；

步骤3：在Melting Curve Stage阶段中设置“65℃1分钟，95℃15秒”， 65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线，如有收集熔解曲线方式选项， 则选择Step and hold方式；

步骤4：设置反应体系为20uL，单击RUN开始进行qPCR反应。

进一步的，所述步骤二1中还包括：分别输入10倍梯度稀释的标准品一、 标准品二、标准品三和标准品四的浓度分别为：0.135、0.0135、0.00135、 0.000135。

进一步的，所述步骤2还包括：同时设置在72℃30秒这个阶段收集荧光 信号。

进一步的，所述步骤一具体包括：根据样本数量，取相应数量的1.5mL 离心管，标记样本编号；分别吸取599uL无核酸酶水至每个离心管中；将待 测文库的样品原管涡旋振荡30秒混匀，瞬时离心后，分别移取1uL样品溶 液至相对应599uL无核酸酶水的离心管中，涡旋振荡1分钟，瞬时离心至管 底。将已稀释的样品置于4℃或冰上；

取出标准品S1S4，将其置于冰盒上，融化后充分振荡混匀，置于4℃或 冰上。

进一步的，所述步骤二中，所述定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物 和P2引物单次反应所需用量分别为10uL、7.2uL、0.4uL和0.4uL，MIX体 系总量为18uL。

本发明提供的文库浓度测定方法在末端修复、连接接头、PCR扩增阶段 前后都进行纯化，且末端修复、连接接头后纯化DNA不与磁珠分离，简化了 操作步骤，节省了时间。

本申请提供的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法操作 简单便利并且灵活、降低测序成本，减少测序流程，提高劳动效率，流程科 学，标准明确，实践操作效果好。

具体实施方式

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技 术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明 书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能 上的差异来作为区分的准则。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式， 然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。 本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例一：

一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法，包括：

步骤一：稀释待测样品，准备标准品，并将两者都低温保存；

步骤二：取离心管，在管盖上做好标记，按照下表中的反应体系配制反 应混合液，配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系，反应混 合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物，配制完成后， 将反应混合液振荡10秒，瞬时离心至管底；

步骤三：将所述步骤二中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中， 向标准品反应孔中分别加入2L的标准品，每个反应板同时设置无模板对照 反应孔，孔中加入2uL无核酸酶水；

步骤四：使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板，使用离心机离心 反应板，将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR 反应，得到文库浓度测定结果。

所述步骤四中设置程序具体包括：

步骤1：在Plate Setup界界面，选好标准品孔和样本孔，重复系数均为 2；

步骤2：在荧光定量PCR扩增仪上设置程序：先95℃1分钟；后95℃15 秒，65℃15秒，72℃30秒循环30次；再后95℃15秒，65℃1分钟，95℃15 秒；

步骤3：在Melting Curve Stage阶段中设置“65℃1分钟，95℃15秒”， 65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线，如有收集熔解曲线方式选项， 则选择Step and hold方式；

步骤4：设置反应体系为20uL，单击RUN开始进行qPCR反应。

所述步骤二1中还包括：分别输入10倍梯度稀释的标准品一、标准品二、 标准品三和标准品四的浓度分别为：0.135、0.0135、0.00135、0.000135。

所述步骤2还包括：同时设置在72℃30秒这个阶段收集荧光信号。

所述步骤一具体包括：根据样本数量，取相应数量的1.5mL离心管，标 记样本编号；分别吸取599uL无核酸酶水至每个离心管中；将待测文库的样 品原管涡旋振荡30秒混匀，瞬时离心后，分别移取1uL样品溶液至相对应 599uL无核酸酶水的离心管中，涡旋振荡1分钟，瞬时离心至管底。将已稀 释的样品置于4℃或冰上；

取出标准品S1S4，将其置于冰盒上，融化后充分振荡混匀，置于4℃或 冰上。

所述步骤二中，所述定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物 单次反应所需用量分别为10uL、7.2uL、0.4uL和0.4uL，MIX体系总量为18uL。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理 解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除， 而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内， 通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改 动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护 范围内。

Claims (6)

1.一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法，其特征在于，包括：

步骤一：稀释待测样品，准备标准品，并将两者都低温保存；

步骤二：取离心管，在管盖上做好标记，按照下表中的反应体系配制反应混合液，配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系，反应混合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物，配制完成后，将反应混合液振荡，瞬时离心至管底；

步骤三：将所述步骤二中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中，向标准品反应孔中分别加入2L的标准品，每个反应板同时设置无模板对照反应孔，孔中加入2uL无核酸酶水；

步骤四：使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板，使用离心机离心反应板，将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR反应，得到文库浓度测定结果。

2.根据权利要求1所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法，其特征在于，所述步骤四中设置程序具体包括：

步骤1：在Plate Setup界界面，选好标准品孔和样本孔，重复系数均为2；

步骤2：在荧光定量PCR扩增仪上设置程序：先95℃1分钟；后95℃15秒，65℃15秒，72℃30秒循环30次；再后95℃15秒，65℃1分钟，95℃15秒；

步骤3：在Melting Curve Stage阶段中设置“65℃1分钟，95℃15秒”，65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线，如有收集熔解曲线方式选项，则选择Step and hold方式；

步骤4：设置反应体系为20uL，单击RUN开始进行qPCR反应。

3.根据权利要求2所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法，其特征在于，所述步骤二1中还包括：分别输入10倍梯度稀释的标准品一、标准品二、标准品三和标准品四的浓度分别为：0.135、0.0135、0.00135、0.000135。

4.根据权利要求3所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法，其特征在于，所述步骤2还包括：同时设置在72℃30秒这个阶段收集荧光信号。

5.根据权利要求1所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：根据样本数量，取相应数量的1.5mL离心管，标记样本编号；分别吸取599uL无核酸酶水至每个离心管中；将待测文库的样品原管涡旋振荡30秒混匀，瞬时离心后，分别移取1uL样品溶液至相对应599uL无核酸酶水的离心管中，涡旋振荡1分钟，瞬时离心至管底。将已稀释的样品置于4℃或冰上；

取出标准品S1S4，将其置于冰盒上，融化后充分振荡混匀，置于4℃或冰上。

6.根据权利要求1所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法，其特征在于，所述步骤二中，所述定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物单次反应所需用量分别为10uL、7.2uL、0.4uL和0.4uL，MIX体系总量为18uL。