CN108642151A - 一种胎儿染色体非整倍体检测中dna的文库浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本申请的目的是公开一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法,包括步骤一:稀释待测样品,准备标准品,并将两者都低温保存;步骤二:取离心管,在管盖上做好标记,按照下表中的反应体系配制反应混合液,配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系,反应混合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物,配制完成后,将反应混合液振荡,瞬时离心至管底;步骤三:将所述步骤二中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中,向标准品反应孔中分别加入2L的标准品;步骤四:密封所述反应板,使离心反应板,将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR反应,得到文库浓度测定结果;操作简单、流程科学,标准明确,实践操作效果好。
Description
技术领域
本发明属于无创产前筛查检测领域,具体是指一种胎儿染色体非整倍体 检测中DNA的文库浓度测定方法。
背景技术
染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言细胞中的某一 条或几条染色体数目增加或减少,与婴幼儿期显的发病率和死亡率有着密切 的关系。新生儿中染色体异常的发病率为l/160,其中21三体(唐氏综合征)、 18三体(爱德华氏综合征)和13三体(帕陶氏综合征)是三种最主要常染色体非 整倍体疾病,在新生儿中发病率分别为1/800~1/600、1/7000~1/3500和 1/6000~1/5000。针对染色体疾病的产前检测主要以血清学筛查、羊水穿刺为 主主。但血清学筛查准确度较低,具有5%的假阳性率及20-409%漏诊率;羊 水穿刺虽然准确度较高,但是对孕妇具有创伤性,有19%6的流产风险,不 便于大规模的产前检测。
1997年,Lo等人研究证实在孕妇的血浆中存在有胎儿的游离DNA片段, 为无创DNA产前检测技术提供了依据。通过高通量测序技术可以对这些胎 儿游离DNA进进行检测,利利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行 分析,最终得出胎儿患有21三体、18三体和13三体综合征的风险率。
本检测采用博奥基因“晶芯胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试 剂盒(半导休测序法)”基于高通量测序基本原理,在孕妇血浆中的游离DNA 片段两端加上通用的测序接头,构建好可以用于测序的测序文库。利用乳液 PCR技术对测序文库进行扩增,形成测序模板,通过对阳性模板进行富集以 达到测序要求。利用半导体测序系统通过在半导体芯片的微孔中固定DNA 链,DNA聚合酶以单链DNA为模板,按碱基互补原理,合成互补的DNA链。DNA链每延伸一个碱基时,就会释释放一个质子,导致局部pH变化, 离子传感器检测pH变化,并将化学信信号转换成数字信号,从而可以实时 判读碱基,最终获得每个DNA片段段的碱基序列。利用生物信息分析把这 些序列定位到人类基因组参考图谱上,计算出样本的游离DNA序列被分配 到每条染色体上的具体数值比例。当胎儿的某条染色体数目增加时,其对应 的游离DNA序列数量会小幅增加,通过半导体测序技术和生物信息学数据 分析可以检测出这种微量变化,从而获得染色体数目的信息,进而实现对21 三体综合征,18三体综合征和13三体综合征进行快速的产前辅助诊断。
因此,高效、准确的检测判断胎儿染色体是否为非整倍体就显得极为重 要,同时也成为了无创产前筛查技术的关键。
按照目前现有的文库浓度测定方法,测定难度大、不准确合理。
因此,如何研发一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定 方法,能够解决上述问题,便成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本申请解决的主要问题是提供一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的 文库浓度测定方法,操作简单、流程科学,标准明确,实践操作效果好,以 解决一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法成本高、流 程不科学,标准不明确,实践操作效果不佳、操作难度高、难以复制操作的 技术问题。
为了解决上述技术问题,本发明公开了一种胎儿染色体非整倍体检测中 DNA的文库浓度测定方法,其特征在于,包括:
步骤一:稀释待测样品,准备标准品,并将两者都低温保存;
步骤二:取离心管,在管盖上做好标记,按照下表中的反应体系配制反 应混合液,配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系,反应混 合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物,配制完成后, 将反应混合液振荡10秒,瞬时离心至管底;
步骤三:将所述步骤二中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中, 向标准品反应孔中分别加入2L的标准品,每个反应板同时设置无模板对照 反应孔,孔中加入2uL无核酸酶水;
步骤四:使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板,使用离心机离心 反应板,将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR 反应,得到文库浓度测定结果。
进一步的,所述步骤四中设置程序具体包括:
步骤1:在Plate Setup界界面,选好标准品孔和样本孔,重复系数均为 2;
步骤2:在荧光定量PCR扩增仪上设置程序:先95℃1分钟;后95℃15 秒,65℃15秒,72℃30秒循环30次;再后95℃15秒,65℃1分钟,95℃15 秒;
步骤3:在Melting Curve Stage阶段中设置“65℃1分钟,95℃15秒”, 65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线,如有收集熔解曲线方式选项, 则选择Step and hold方式;
步骤4:设置反应体系为20uL,单击RUN开始进行qPCR反应。
进一步的,所述步骤二1中还包括:分别输入10倍梯度稀释的标准品一、 标准品二、标准品三和标准品四的浓度分别为:0.135、0.0135、0.00135、 0.000135。
进一步的,所述步骤2还包括:同时设置在72℃30秒这个阶段收集荧光 信号。
进一步的,所述步骤一具体包括:根据样本数量,取相应数量的1.5mL 离心管,标记样本编号;分别吸取599uL无核酸酶水至每个离心管中;将待 测文库的样品原管涡旋振荡30秒混匀,瞬时离心后,分别移取1uL样品溶 液至相对应599uL无核酸酶水的离心管中,涡旋振荡1分钟,瞬时离心至管 底。将已稀释的样品置于4℃或冰上;
取出标准品S1S4,将其置于冰盒上,融化后充分振荡混匀,置于4℃或 冰上。
进一步的,所述步骤二中,所述定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物 和P2引物单次反应所需用量分别为10uL、7.2uL、0.4uL和0.4uL,MIX体 系总量为18uL。
本发明提供的文库浓度测定方法在末端修复、连接接头、PCR扩增阶段 前后都进行纯化,且末端修复、连接接头后纯化DNA不与磁珠分离,简化了 操作步骤,节省了时间。
本申请提供的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法操作 简单便利并且灵活、降低测序成本,减少测序流程,提高劳动效率,流程科 学,标准明确,实践操作效果好。
具体实施方式
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技 术人员应可理解,硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明 书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式,而是以组件在功能 上的差异来作为区分的准则。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式, 然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的,并非用以限定本申请的范围。 本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例一:
一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法,包括:
步骤一:稀释待测样品,准备标准品,并将两者都低温保存;
步骤二:取离心管,在管盖上做好标记,按照下表中的反应体系配制反 应混合液,配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系,反应混 合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物,配制完成后, 将反应混合液振荡10秒,瞬时离心至管底;
步骤三:将所述步骤二中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中, 向标准品反应孔中分别加入2L的标准品,每个反应板同时设置无模板对照 反应孔,孔中加入2uL无核酸酶水;
步骤四:使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板,使用离心机离心 反应板,将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR 反应,得到文库浓度测定结果。
所述步骤四中设置程序具体包括:
步骤1:在Plate Setup界界面,选好标准品孔和样本孔,重复系数均为 2;
步骤2:在荧光定量PCR扩增仪上设置程序:先95℃1分钟;后95℃15 秒,65℃15秒,72℃30秒循环30次;再后95℃15秒,65℃1分钟,95℃15 秒;
步骤3:在Melting Curve Stage阶段中设置“65℃1分钟,95℃15秒”, 65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线,如有收集熔解曲线方式选项, 则选择Step and hold方式;
步骤4:设置反应体系为20uL,单击RUN开始进行qPCR反应。
所述步骤二1中还包括:分别输入10倍梯度稀释的标准品一、标准品二、 标准品三和标准品四的浓度分别为:0.135、0.0135、0.00135、0.000135。
所述步骤2还包括:同时设置在72℃30秒这个阶段收集荧光信号。
所述步骤一具体包括:根据样本数量,取相应数量的1.5mL离心管,标 记样本编号;分别吸取599uL无核酸酶水至每个离心管中;将待测文库的样 品原管涡旋振荡30秒混匀,瞬时离心后,分别移取1uL样品溶液至相对应 599uL无核酸酶水的离心管中,涡旋振荡1分钟,瞬时离心至管底。将已稀 释的样品置于4℃或冰上;
取出标准品S1S4,将其置于冰盒上,融化后充分振荡混匀,置于4℃或 冰上。
所述步骤二中,所述定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物 单次反应所需用量分别为10uL、7.2uL、0.4uL和0.4uL,MIX体系总量为18uL。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例,但如前所述,应当理 解本申请并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除, 而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述申请构想范围内, 通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改 动和变化不脱离本申请的精神和范围,则都应在本申请所附权利要求的保护 范围内。
Claims (6)
1.一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法,其特征在于,包括:
步骤一:稀释待测样品,准备标准品,并将两者都低温保存;
步骤二:取离心管,在管盖上做好标记,按照下表中的反应体系配制反应混合液,配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系,反应混合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物,配制完成后,将反应混合液振荡,瞬时离心至管底;
步骤三:将所述步骤二中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中,向标准品反应孔中分别加入2L的标准品,每个反应板同时设置无模板对照反应孔,孔中加入2uL无核酸酶水;
步骤四:使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板,使用离心机离心反应板,将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR反应,得到文库浓度测定结果。
2.根据权利要求1所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法,其特征在于,所述步骤四中设置程序具体包括:
步骤1:在Plate Setup界界面,选好标准品孔和样本孔,重复系数均为2;
步骤2:在荧光定量PCR扩增仪上设置程序:先95℃1分钟;后95℃15秒,65℃15秒,72℃30秒循环30次;再后95℃15秒,65℃1分钟,95℃15秒;
步骤3:在Melting Curve Stage阶段中设置“65℃1分钟,95℃15秒”,65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线,如有收集熔解曲线方式选项,则选择Step and hold方式;
步骤4:设置反应体系为20uL,单击RUN开始进行qPCR反应。
3.根据权利要求2所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法,其特征在于,所述步骤二1中还包括:分别输入10倍梯度稀释的标准品一、标准品二、标准品三和标准品四的浓度分别为:0.135、0.0135、0.00135、0.000135。
4.根据权利要求3所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法,其特征在于,所述步骤2还包括:同时设置在72℃30秒这个阶段收集荧光信号。
5.根据权利要求1所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法,其特征在于,所述步骤一具体包括:根据样本数量,取相应数量的1.5mL离心管,标记样本编号;分别吸取599uL无核酸酶水至每个离心管中;将待测文库的样品原管涡旋振荡30秒混匀,瞬时离心后,分别移取1uL样品溶液至相对应599uL无核酸酶水的离心管中,涡旋振荡1分钟,瞬时离心至管底。将已稀释的样品置于4℃或冰上;
取出标准品S1S4,将其置于冰盒上,融化后充分振荡混匀,置于4℃或冰上。
6.根据权利要求1所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的文库浓度测定方法,其特征在于,所述步骤二中,所述定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物单次反应所需用量分别为10uL、7.2uL、0.4uL和0.4uL,MIX体系总量为18uL。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102517390A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-06-27 | 厦门大学 | 基于实时荧光pcr的染色体非整倍体检测试剂盒 |
CN105239164A (zh) * | 2015-07-22 | 2016-01-13 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种胎儿游离dna文库定量的标准品及其制备方法 |
CN105624798A (zh) * | 2016-02-19 | 2016-06-01 | 北京乐普基因科技股份有限公司 | 一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用 |
CN106755350A (zh) * | 2016-12-02 | 2017-05-31 | 苏州首度基因科技有限责任公司 | cfDNA文库qPCR定量标准品的制备方法 |
-
2018
- 2018-05-19 CN CN201810484120.1A patent/CN108642151A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102517390A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-06-27 | 厦门大学 | 基于实时荧光pcr的染色体非整倍体检测试剂盒 |
CN105239164A (zh) * | 2015-07-22 | 2016-01-13 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种胎儿游离dna文库定量的标准品及其制备方法 |
CN105624798A (zh) * | 2016-02-19 | 2016-06-01 | 北京乐普基因科技股份有限公司 | 一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用 |
CN106755350A (zh) * | 2016-12-02 | 2017-05-31 | 苏州首度基因科技有限责任公司 | cfDNA文库qPCR定量标准品的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CHIU RW等: "Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma", 《PROC ACAD SCI US》 * |
张媛媛等: "无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查与结果分析", 《山东医药》 * |
陈晨等: "胎儿游离DNA在染色体非整倍体疾病无创产前筛查中的应用", 《中国优生与遗传杂志》 * |
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