CN108642085A - 携带bcma突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents

携带bcma突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108642085A
CN108642085A CN201810599943.9A CN201810599943A CN108642085A CN 108642085 A CN108642085 A CN 108642085A CN 201810599943 A CN201810599943 A CN 201810599943A CN 108642085 A CN108642085 A CN 108642085A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bcma
viral vectors
recombined glandulae
glandulae correlation
carrying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810599943.9A
Other languages
English (en)
Inventor
刘未辰
卢敬
杨曼
高倩
冯力
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing An Chen Rui Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing An Chen Rui Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing An Chen Rui Biological Technology Co Ltd filed Critical Beijing An Chen Rui Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201810599943.9A priority Critical patent/CN108642085A/zh
Publication of CN108642085A publication Critical patent/CN108642085A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明是一种携带BCMA突变的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，本发明的AAV/BCMA是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入BCMA抗原基因得到野生型重组腺相关病毒载体，再通过点突变得到重组腺相关病毒载体。本发明的重组腺相关病毒载体及其衍生产品可用来制备细胞药物，治疗多发性骨髓瘤。

Description

携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法 与应用
【技术领域】
本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带 BCMA突变基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
【背景技术】
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段LTR(上游5’端片段，下游3’端片段)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子。
AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒) 的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV 可分为12种血清型(AAV-1～AAV-12)。其中，2型腺相关病毒载体 (AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)。
如何构建各种新的可用于制备治疗疾病的药物的重组腺相关病毒及其相关产品是本领域技术人员努力的方向。
B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)，又称CD269，由184个氨基酸残基组成，其胞内区含80个氨基酸残基，胞外区序列很短，只有一个糖类识别结构域为B细胞表面分子。
BCMA属于缺少信号肽的I型跨膜信号蛋白，是肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)一员，它可分别与B细胞激活因子BAFF或增殖诱导配体(aproliferation induced ligand，APRIL)两种配体相结合。在正常组织中，BCMA表达于成熟B细胞和浆细胞表面，BCMA基因剔除小鼠免疫系统表现正常，有正常的脾结构，B淋巴细胞的发育正常，但浆细胞数量明显减少，证明BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用，其机制主要包括BCMA与BAFF蛋白结合，并上调抗凋亡基因Bcl-2，Mcl-1及Bclw等，维持细胞生长。BCMA在不同分化阶段的人恶性B细胞系中的表达量是随着细胞分化程度的提高而提高。这侧面反映了BCMA是选择性表达的细胞受体。BCMA的过表达会引起蛋白激酶B、NF-κB和MAPK信号的产生,从而增强了多发性骨髓瘤细胞的增殖与存活。因此，BCMA已作为一个新的药物靶点用于诊断并治疗多发性骨髓瘤。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是：提出一种安全性高、携带B细胞成熟抗原(BCMA)基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno- associated virus，rAAV)载体及其构建方法与其在免疫治疗中的应用。
本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
本发明提供了一种携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为BCMA突变抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
本发明通过对该蛋白142位用PCR法定点突变，使得其在转染后能够改变与BAFF相互作用能力，并且通过改变活化下游通路能力改变诱导B细胞增殖的能力比例，从而降低致癌风险，实现预防和治疗多发性骨髓瘤的作用。
已知的腺相关病毒载体具有巨噬细胞病毒(CMV)启动子，为提高目的基因的转录水平，还进一步将BCMA H142G突变抗原基因插入后成功构建的质粒的启动子替换为p5启动子、β-肌动蛋白启动子、 SV40早期启动子中的任意一种。
本发明还提供一种携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入BCMA突变抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。
本发明所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因BCMA与被切断的AAV载体DNA进行连接，得到携带 BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为p5启动子或者下述启动子中的一种：β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。
本发明还提供了一种携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，包括BCMA重组腺相关病毒的质粒载体、BCMA重组腺相关病毒的病毒载体、被所述BCMA重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述BCMA重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述BCMA重组腺相关病毒的病毒载体由所述BCMA重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。
本发明还提供了一种携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品的制备方法，BCMA重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如上述携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到BCMA重组腺相关病毒的质粒载体；BCMA重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述BCMA重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper 质粒共转染AAVp细胞得到BCMA重组腺相关病毒的病毒载体； BCMA重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备：用所述BCMA 重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染单核细胞、树突状细胞或T淋巴细胞得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系、T淋巴细胞系。
一种如上所述的携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的产品在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将 AAV/BCMA的病毒载体感染或转染患者的单核细胞。或将转化有 BCMA的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞回输肿瘤患者。
上述药物的用量一般为100μl/5×106个单核细胞/每次，每月2次，疗程通常为6个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。
为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行组合治疗。
本发明与现有技术对比的有益效果是：
本发明提供了一种安全性高、携带B细胞成熟抗原(BCMA)基因的重组腺相关病毒。在本发明的重组腺相关病毒(AAV/BCMA) 载体可将其携带的BCMA突变抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，存在BCMA突变抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在体外和患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于多发性骨髓瘤的细胞免疫治疗。本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
【附图说明】
图1：BCMA野生型和突变体BCMA H142G质粒转染HEK293细胞电泳测试结果
【具体实施方式】
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
1,构建重组腺相关病毒质粒
S1：改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI 和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；
S2：逆转录PCR后，用引物1：
ATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTC和引物2：
GATCGAGATCTTTACCTAGCAGAAATTGATTTCTCTATCTCCGT AGC扩增得到BCMA核心致癌cDNA；
S3：将步骤S2中BCMA cDNA进行酶切反应，之后和步骤S1 产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和BCMA基因的重组腺相关病毒载体；
S4：使用引物3：GTCGACTCTGACGGTTGCTTTCCACTC进行点突变PCR，将BCMA基因突变为BCMA H142G突变抗原基因；
S5：将CMV启动子用酶切连接的方法替换为SV40早期启动子，得到携带B细胞成熟抗原(BCMA)基因的重组腺相关病毒。
2，细胞杀伤实验
AAV/BCMA系统可以在动物细胞培养基中被供体的树突细胞吞噬，进而经由免疫递呈活化供体的T细胞，并诱发对携带有BCMA 抗原的癌症细胞系U266/70的免疫反应治疗有效性可通过对携带 BCMA的U266/70细胞的体外杀伤实验证实。通过CTL细胞杀伤实验测试实施例1制备得到重组载体的效果。
具体地，包括以下步骤：
根据SK-BR-3/U266两种细胞系HLA抗原表型，筛选携带HLA-2 基因的志愿者作为免疫细胞供体。
1)抽取供体50ml血液，分离其中的单核细胞与T细胞前体细胞；
2)细胞计数后，用单核细胞：AAV/BCMA H142G＝1：1000的比例加入6孔板一孔中，并加入适当细胞因子的2ml 1640培养基培养 7天，观察细胞状态及时更换培养基。单核细胞经过刺激成为识别了BCMA的成熟树突细胞。同时用AAV GFP诱导产生不识别BCMA 的树突细胞做对照；
3)T细胞前体细胞，加入适当细胞因子的2ml 1640培养基培养7 天，观察细胞状态及时更换培养基；
4)按照1：1000的比例混合2)和3)的产物细胞。再用加入适当细胞因子的1640培养基培养7天，得到成熟的CD4+T细胞；
5)以40：1的比例用分别诱导的CD4+T细胞对携带BCMA的 U266细胞进行杀伤实验；
6)细胞杀伤6小时后，加入MTS试剂检测细胞活性。
MTS试剂作用4小时后，将细胞培养板放入酶标仪，在波长490nm 处测定吸光度，记录测定结果。
细胞杀伤测试结果如表1，
表1 U266细胞杀伤试验测试结果
空白组 U266 AAV GFP AAV BCMA GFP+U266 BCMA+U266
149 2365 936 1001 3047 1947
153 2214 865 938 3089 1989
143 2548 928 980 3111 2021
细胞杀伤率计算公式为
杀伤率＝1-(效应细胞BCMA+靶细胞U266-混合细胞BCMA和U266) /(效应细胞BCMA+靶细胞U266)
经换算，BCMA的CTL杀伤实验结果见表2：
表2 U266细胞杀伤试验结果
空白组 AAV-GFP组 BCMA组
细胞杀伤率 —— 1.84％ 39.80％
根据表2所示，试验结果表明BCMA H142G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体通过树突细胞诱导的杀伤率为39.80％，远高于对照组GFP杀伤U266的1.84％。
3，突变后致癌性风险测试
1)体外培养HEK293；
2)以1：100比例稀释三种腺相关病毒GFP，BCMA WT，BCMA H142G(病毒滴度每毫升5×1010)加入上述细胞，培养3天；
3)收集细胞后，立即加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，破碎细胞收集蛋白质；
4)western blot检测NFKB2含量随着不同病毒感染的变化，结果如附图1所示。
根据试验结果，BCMA H142G相较于野生型BCMA，诱导产生的 NF-KB2蛋白明显减少，因此突变后的基因与NF-KB2蛋白的结合能力下降，诱导B淋巴细胞增殖的能力减弱，致癌风险更低，可以用于腺相关病毒免疫治疗，治疗多发性骨髓瘤。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京安斯晨睿生物科技有限公司
<120> 携带BCMA H142G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 555
<212> DNA
<213> BCMA H142G突变基因序列(B-Cell Maturation Antigen)
<400> 4
atgttgcaga tggctgggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgct 60
tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgttat 120
tgtaatgcaa gtgtgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cgattctctg gacctgtttg 180
ggactgagct taataatttc tttggcagtt ttcgtgctaa tgtttttgct aaggaagata 240
aactctgaac cattaaagga cgagtttaaa aacacaggat caggtctcct gggcatggct 300
aacattgacc tggaaaagag caggactggt gatgaaatta ttcttccgag aggcctcgag 360
tacacggtgg aagaatgcac ctgtgaagac tgcatcaaga gcaaaccgaa ggtcgactct 420
gaccattgct ttccactccc agctatggag gaaggcgcaa ccattcttgt caccacgaaa 480
acgaatgact attgcaagag cctgccagct gctttgagtg ctacggagat agagaaatca 540
atttctgcta ggtaa 555

Claims (7)

1.一种携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，切除腺相关病毒中病毒包装识别位点内全部基因，插入BCMA抗原基因，定点突变，替换CMV启动子，得到重组腺相关病毒载体；其中，突变位点为142位，由组氨酸突变为甘氨酸，编码碱基由CAT突变为GGT，所述病毒包装识别位点为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的是p5启动子，猴空泡病毒40(SV40)早期启动子或beta肌动蛋白启动子。
2.一种含有权利要求1所述携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，包括重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。
3.制备权利要求1所述携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：
S1：改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；
S2：逆转录PCR后，扩增得到BCMA核心致癌cDNA；
S3：将步骤S2中BCMA cDNA进行酶切反应，之后和步骤S1产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和BCMA基因的重组腺相关病毒载体；
S4：使用点突变PCR技术，将BCMA基因突变为BCMA H142G突变抗原基因；
S5：将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中包括以下步骤：
1)从表达BCMA的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；
2)以所述总cDNA为模板，在用引物1：ATGTTGCAGATGGCTGGG CAG TGCTC和引物2：GATCGAGATCTTTACCTAGCAGAAATTG ATTTCTCTATCTCCGTAGC的引导下进行PCR扩增，得到BCMA抗原的DNA。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤S4的操作方法为：使用引物3：GTCGACTCTGACGGTTGCTTTCCACTC进行点突变PCR，将BCMA基因突变为BCMAH142G突变抗原基因。
6.一种用于多发性骨髓瘤的细胞免疫治疗药物，其特征在于：活性成分为权利要求1所述的携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，或者由权利要求3～5任一项所述的构建方法制得的重组腺相关病毒载体，或权利要求2所述的携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品。
7.一种权利要求1所述的携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者权利要求2所述的产品在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
CN201810599943.9A 2018-06-11 2018-06-11 携带bcma突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 Pending CN108642085A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810599943.9A CN108642085A (zh) 2018-06-11 2018-06-11 携带bcma突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810599943.9A CN108642085A (zh) 2018-06-11 2018-06-11 携带bcma突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108642085A true CN108642085A (zh) 2018-10-12

Family

ID=63752540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810599943.9A Pending CN108642085A (zh) 2018-06-11 2018-06-11 携带bcma突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108642085A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005075511A1 (en) * 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
CN102268457A (zh) * 2007-04-23 2011-12-07 核力康健生物医药技术(天津)有限公司 一种afp重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN105087647A (zh) * 2015-06-17 2015-11-25 深圳益世康宁生物科技有限公司 一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN105777911A (zh) * 2016-04-12 2016-07-20 上海优卡迪生物医药科技有限公司 抗bcma嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN107206076A (zh) * 2014-12-05 2017-09-26 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向b‑细胞成熟抗原的抗体及其用途
CN107827989A (zh) * 2017-10-18 2018-03-23 银丰生物工程集团有限公司 靶向骨髓瘤bcma抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005075511A1 (en) * 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
CN102268457A (zh) * 2007-04-23 2011-12-07 核力康健生物医药技术(天津)有限公司 一种afp重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN107206076A (zh) * 2014-12-05 2017-09-26 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向b‑细胞成熟抗原的抗体及其用途
CN105087647A (zh) * 2015-06-17 2015-11-25 深圳益世康宁生物科技有限公司 一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN105777911A (zh) * 2016-04-12 2016-07-20 上海优卡迪生物医药科技有限公司 抗bcma嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN107827989A (zh) * 2017-10-18 2018-03-23 银丰生物工程集团有限公司 靶向骨髓瘤bcma抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
邓少丽 等: "BCMA基因5'上游序列定点删除突变对启动子活性的影响", 《中国现代医学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102268458B (zh) 一种ba46重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
US7740837B2 (en) Genetically modified cells expressing a TGF beta inhibitor, the cells being lung cancer cells
CN113402617B (zh) 蛋白复合物及其应用
CN109789177A (zh) 腺病毒和免疫调节剂组合治疗
CN109265561B (zh) 抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用
WO2024113777A1 (zh) 转基因免疫细胞及其应用
WO2021136040A1 (zh) 一种共表达免疫调节分子的嵌合抗原受体t细胞的制备及其应用
WO2020248486A1 (zh) 以Tcm为主要效应成分的CAR-T制备方法及其应用
WO2024113649A1 (zh) 提高nk细胞存活和抗肿瘤活性的方法及其应用
CN107699591A (zh) 一种敲除pd‑1的t细胞制备方法及其应用
CN116490217A (zh) 新型PiggyBac转座子系统及其用途
WO2022222846A1 (zh) 靶向cd19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用
CN105985984B (zh) 携带pap抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用
CN105087648B (zh) 携带mage-a3抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用
CN105087647B (zh) 一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN112795584B (zh) 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用
CN116143943B (zh) 一种靶向baffr嵌合抗原受体、car-t细胞及应用
CN108642085A (zh) 携带bcma突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN109923121A (zh) 多肽及其应用
CN108866098A (zh) 携带mage-a4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN109963862A (zh) 多肽及其应用
CN110167956A (zh) 多肽及其应用
CN108893490A (zh) 携带ceacam8突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN110982841A (zh) 重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒aav8-pd1及其应用
EP4335448A1 (en) Modified oncolytic parvovirus h-1pv with an enhanced fitness and superior anticancer activity

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181012