CN108642072A - Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用 - Google Patents

Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用。所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。本发明在PGBTNH2载体中连入的目的基因Sep15的C端的his‑tag标签不会表达，从而使酶切后Sep15能与带有his‑tag标签的GB‑1分离，即通过该表达载体进行转化、培养、酶切等步骤即可分离出较纯的Sep15蛋白。

Description

Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用。
背景技术
Sep15蛋白是一种硒蛋白，其分子质量为15KDa；Sep15蛋白跟多种疾病相关。在现有的研究和专利中，有大量的硒蛋白体内实验和阿尔兹海默病的研究，但并无Sep15蛋白重组表达以及在体外实验的研究，也无其对Tau R2(一种Tau蛋白，含量最高的微管蛋白)、Abeta(又称Aβ，一种淀粉样多肽)聚集的影响的研究。Tau蛋白或Abeta的聚集同AD的相关性更高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用，旨在解决现有技术Sep15蛋白表达载体及其纯化技术有限的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种Sep15蛋白的表达载体，所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。
本发明另一方面提供一种Sep15蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
将本发明上述的表达载体转入大肠杆菌中，得到转化菌种；
将所述转化菌种进行诱导培养后，得到培养菌液；
将所述培养菌液超声处理，然后离心分离得到上清液；
将所述上清液进行酶切处理，然后层析分离得到所述Sep15蛋白。
本发明最后还提供一种上述表达载体在Tau蛋白和/或Abeta的聚集反应的检测中的应用。
本发明提供的Sep15蛋白的表达载体基于重组构建PGBTNH2载体得到，PGBTNH2载体上含有GB-1助溶标签，C端及N端均含有his-tag标签，而在PGBTNH2载体中连入的目的基因Sep15含有终止密码，所以其C端的his-tag标签不会表达，从而使酶切后Sep15能与带有his-tag标签的GB-1分离，即通过该表达载体进行转化、培养、酶切等步骤即可分离出较纯的Sep15蛋白。同时，通过研究证明Sep15蛋白可以抑制Tau蛋白以及Abeta的聚集反应，因此本发明的Sep15蛋白的表达载体可用于检测Tau蛋白和/或Abeta的聚集反应。
附图说明
图1为本发明实施例1中PGBTNH2质粒载体图谱：
图2为本发明实施例1中亲和层析柱纯化重组蛋白结果检测图；
图3为本发明实施例1中纯化后SDS-PAGE电泳结果图(酶切前)；
图4为本发明实施例1中BSA法蛋白浓度定量标准曲线图(酶切前)；
图5为本发明实施例1中酶切鉴定电泳结果图；
图6为本发明实施例1中镍柱亲和层析过柱结果图(酶切后)
图7为本发明实施例1中纯化后SDS-PAGE电泳结果图(酶切后)；
图8为本发明实施例1中第二次蛋白浓度测定标准曲线图；
图9为本发明实施例1中胶内酶切后质谱鉴定结果图；
图10为本发明实施例2中Tau R2聚集实验结果图；
图11为本发明实施例3中Abeta1-42聚集实验结果图；
图12为本发明实施例3含有其他蛋白的Abeta1-42聚集实验结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种Sep15蛋白的表达载体，所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。
PGBTNH2质粒信息如图1所示；目的基因Sep15插入位置是载体图中MCS(多克隆位点)。本发明实施例提供的Sep15蛋白的表达载体通过重组构建PGBTNH2载体得到，PGBTNH2质粒上含有GB-1助溶标签，C端及N端均含有his-tag标签，又在载体中连入的目的基因Sep15(含有终止密码)，所以其C端的his-tag标签不会表达，从而使酶切后Sep15能与带有his-tag标签的GB-1分离。与PGBTNH载体相比较，PGBTNH2载体能排除多克隆位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间的84bp多余片段的影响因素，且通过亲和层析Sep15蛋白能与GB-1分开，即分离出较纯的Sep15。
另一方面，本发明实施例还一种Sep15蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
S01：将上述表达载体转入大肠杆菌中，得到转化菌种；
S02：将所述转化菌种进行诱导培养后，得到培养菌液；
S03：将所述培养菌液超声处理，然后离心分离得到上清液；
S04：将所述上清液进行酶切处理，然后层析分离得到所述Sep15蛋白。
本发明实施例的纯化方法使用了本发明实施例提特有的Sep15蛋白的表达载体，该表达载体表达酶切后Sep15蛋白能与带有his-tag标签的GB-1分离，即通过该表达载体进行转化、培养、酶切等步骤即可分离出较纯的Sep15蛋白。纯化出的Sep15蛋白可用于体外实验，便于研究Sep15蛋白的功能及应用。
进一步地，上述步骤S02中，所述诱导培养的步骤包括：将所述转化菌种进行摇床扩摇培养至OD值为0.6-0.8，然后加入诱导剂，再进行摇床诱导培养。该OD值表明：此时为大肠杆菌的对数生长期，更适用于诱导表达。
更进一步地，所述摇床扩摇培养的条件包括：35-37℃恒温摇床3-4h；优选为：220rpm、37℃恒温摇床中摇菌3.5h。所述摇床诱导培养的条件包括：15-16℃恒温摇床12-24h。优选为：置于16℃条件下，220rpm摇床中摇菌12h。优选地，所述诱导剂为IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)。
进一步地，上述步骤S03中，所述超声处理的条件包括：4-6℃超声25-30min；可优选30min，即将菌液倒入烧杯中，可置于冰上，超声30min；该条件下的破碎效果最佳，可得到更多的含有Sep15蛋白的重组蛋白。所述离心处理的条件包括：7000-8000rpm离心25-30min。优选为：在4℃条件下，8000rpm离心30min至上清液澄清。更优选地，为得到更多的目标蛋白，在超声处理之前，可培养菌液置于预冷后的离心机中，4℃，8000rpm，离心15min；然后弃上清液，用balance buffer(具体成分见下述说明书中)将沉淀重悬。
进一步地，上述步骤S04中，所述酶切处理的步骤包括：按照4U/ml的比例向所述上清液中加入凝血酶，酶切40-48h。优选地，于室温中酶切48h。
进一步地，上述步骤S04中，所述层析分离为镍柱亲和层析分离。所述镍柱亲和层析分离的步骤包括：用50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L的咪唑浓度梯度溶液进行梯度洗脱。通过梯度洗脱，可得到更纯的Sep15蛋白。
最后，本发明实施例还提供一种上述本发明的Sep15蛋白的表达载体在Tau蛋白和/或Abeta的聚集反应的检测中的应用。在该应用中，所述检测的方法优选为ThT(硫磺素-T，一种阳离子荧光试剂)荧光光谱法。
本发明实施例初次在体外检测出Sep15蛋白具有抑制Tau蛋白(优选为Tau R2蛋白)、Abeta(优选为Abeta1-42)聚集的作用，如此，可对后续Sep15蛋白与Tau、Abeta相关病理的研究提供思路。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
一、本发明实施例使用的菌株和载体：
实验中所用的大肠杆菌菌株见表1。表达质粒说明：因Sep15蛋白为硒蛋白，其中含有硒代半胱氨酸为终止密码子的一种，为了在体外表达正常进行，对其硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸，后与PGTNH2载体连接构建完成。PGBTNH2质粒载体图谱如图1所示。
本实施例中：质粒于-20℃保藏。菌种保藏方法有：(1)在超净工作台中，取840ml过夜培养的菌液于EP管中，再加入160ul 50％的甘油，用作保种。(2)放入-80℃冷藏待用。另外，蛋白冻干保藏方法有(长期存放)：(1)将Sep15蛋白液分装到EP管中，每管1ml，写好标签。(2)放入-80℃冷藏过夜。(3)将样品放入冷冻干燥机中干燥，干燥完后放于4℃保存。
表1
二、主要化学试剂及试剂盒
本发明实施例使用的主要化学试剂及生产厂家见表2。
表2
三、主要仪器及用具
本发明实验中主要的仪器设备型号及生产厂家见表3。
表3
四、培养基及试剂的配制
1.培养基的配制
(1)LB培养基(1L)：10g蛋白胨(Trypeptone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，10gNaCl，pH7.2，高压灭菌。
(2)LA培养基：已灭菌的LB培养基中按1/1000的比例，加入浓度为100mg/mL的氨苄抗生素(Amp)，使终浓度为100ug/ml。
2.缓冲液及试剂的配制
(1)氨苄青霉素(Amp)贮存液(100mg/mL)：100mg Amp溶于1mL ddH2O中，0.22mmol/L滤膜过滤，-20℃保存。
(2)IPTG贮存液(0.024mg/mL)：1.2g IPTG溶于50mL ddH2O中。0.22μm滤膜过滤后，-20℃保存。
(3)磷酸缓冲液PBS(10×，1L):80g NaCl,2g KCl,14.4g Na2HPO4，2.4g KH2PO4，PH:7.4定容至1L。
(4)EDTA(1mmol/L):0.186gEDTA溶于ddH2O中，定容至500ml。
(5)CaCl2(300mmol/L)：0.333g CaCl2溶于10mlddH2O中。
(6)ZnSO4(300mmol/L)：0.863g ZnSO4·7H2O溶于10mlddH2O中。
(7)CuCl2(300mmol/L)：0.512g CuCl2·2H2O溶于10mlddH2O中。
(8)圆二色谱磷酸盐缓冲液：K2HPO4:400ml水中加入4.5644g；KH2PO4:20ml水中加入0.13609g。以K2HPO4:KH2PO4＝95％:5％，得终浓度5mM。
3.SDS-PAGE电泳试剂的配制
(1)30％聚丙烯酰胺凝胶储备液：0.8g双丙烯酰胺(Bis)，29.2g丙烯酰胺(Acr)溶于ddH2O中，定容至100mL，0.22μm过滤，4℃保存。
(2)10％过硫酸铵溶液(AP)：0.1g过硫酸铵溶于1mL ddH2O中(现配现用)。
(3)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液，1.5mol/L pH＝8.8)：18.15g Tris溶于80mLddH2O中，加4mL HCl(6mol/L)，pH＝8.8，定容至100mL。
(4)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液，0.5mol/L pH＝6.8)：6g Tris溶于80mLddH2O中，加8mL HCl(6mol/L)，pH＝6.8，定容至100mL。
(5)10％SDS溶液：5g SDS溶于ddH2O中，定容至50mL。
(6)SDS-PAGE电泳液(10X,500ml):15.15g Tris，72.05g甘氨酸，5g SDS溶液，定容至500mL。
(7)考马氏蓝染色液：0.1g考马斯亮蓝，45mL甲醇溶液，10mL冰乙酸，定容至100mL。
表4为SDS-PAGE凝胶电泳组分。
表4
4.亲和层析试剂的配制
(1)Balance Buffer(500mL)：11.7g NaCl，3.03g Tris，pH＝8.0。定容至500mL。
(2)Washing Buffer(50mM咪唑)(500mL)：11.7g NaCl，3.03g Tris,1.71g咪唑，pH＝8.0，定容至500mL。
(3)Washing Buffer(100mM咪唑)(500ml)：11.7g NaCl，3.03g Tris，3.41g咪唑，pH＝8.0，定容至500ml。
(4)Washing Buffer(200mM咪唑)(500ml)：11.7g NaCl，3.03g Tris，6.81g咪唑，pH＝8.0，定容至500ml。
(5)Elution Buffer(300mM咪唑)(500ml)：11.7g NaCl，3.03g Tris，10.21g咪唑，pH＝8.0，定容至500ml。
(6)NaOH溶液(0.5mol/L)：20.0g NaOH，溶于ddH2O中，定容至1L。
(7)20％乙醇(1L)：200mL的无水乙醇，定容至1L。
5.tua R2聚集实验试剂配制
(1)ThT母液：0.0032g+10mL Tris(pH 7.4)(浓度：1mM)；
(2)DTT母液：0.0154g+1mL Tris(pH 7.4)(浓度：100mM)；
(3)肝素钠母液：0.0030g+1mL Tris(pH 7.4)(浓度：200μM)；
(4)Tau母液：0.0015g+0.5mL Tris(pH 7.4)(浓度：200μM)。
6.Abeta1-42样品制备步骤
(1)1mg Abeta1-42粉末，加入2mlHFIP(六氟异丙醇)，震荡溶解过夜；
(2)样品取出后，水浴超声15-20min；
(3)氮气吹干；
(4)加入适量DMSO充分溶解样品，水浴超声15-20min
(5)于-80℃保存备用。
实施例1Sep15蛋白的诱导表达及纯化
1、摇菌
(1)准备已转化的菌种(-80℃冰箱)，Amp(100mg/ml)，50ml LB培养基等材料。
(2)在已灭菌的超净工作台中，向50mlLB培养基中加入50ulAmp,使其变成LA培养基，在LA培养基中加入1ml已转化的菌种。
(3)放入37℃，220rpm摇床中摇菌过夜。
2、扩摇，保种及IPTG诱导
(1)准备50ml已转化菌种，Amp(100mg/ml),1L LA培养基，50％甘油等材料。
(2)在超净工作台中，取840ml过夜培养的菌液于EP管中，再加入160ul50％的甘油，用作保种。另取1ml菌液于另一EP管中，记作未诱导。
(3)在1L LB培养基中加入1mlAmp，使其变成LA培养基，将过夜培养的50ml菌液倒入1L LA培养基中，于220rpm 37℃恒温摇床中摇菌约3.5小时，测定OD值。
(4)当测得OD值在0.6-0.8之间时，表明此时为大肠杆菌的对数生长期，在超净工作台中向1L培养基中加入800ulIPTG诱导表达。
(5)置于16℃，220rpm摇床中摇菌过夜。
3、离心及超声破碎
(1)离心机预冷(4℃)，将经诱的菌液分装入离心瓶中，配平。
(2)将分装好的菌液置于预冷后离心机中，4℃，8000rpm，离心15min。
(4)弃上清液，用balance buffer将沉淀重悬，加入的balance buffer，总量大约为100ml。
(5)安装好超声仪的枪头，设置好参数，超声2s，停3s，功率为25％。先超声ddH2O5min左右以清洗枪头。
(6)将菌液倒入烧杯中，置于冰上，超声30min。
(7)超声完全后，将超声后的菌液分装到50ml离心管中。
(8)离心机预冷(4℃)。
(9)4℃，8000rpm离心30min至上清液澄清。
(10)将上清液转至新的50mL离心管中，记为样品，于4℃冰箱保存。
4、镍柱亲和层析纯化蛋白(酶切前)
(1)将样品及配制好的亲和层析试剂分别用0.45μm滤膜过滤。
(2)连接好镍柱，打开电脑及快速蛋白层析系统，打开UNICORN软件。
(3)点击Pump,设置Flow为3ml/min，按insert确认，点击other，选择PauseTimer可设置停止时间。亲和层析过程中注意使pressure不可超过0.5。
(4)洗柱子过程按下表5所示进行，每次换液时必须按pause,换好后按continue继续，全部样洗完后按End结束。
(5)除了蛋白样品流速为1ml/min，及0.5M NaOH的为2ml/min外，其余的流速都设置为3ml/min。
亲和层析使用的步骤见下表5，图2为该步骤亲和层析柱纯化重组蛋白的检测结果图。在图2中，波峰1为上样峰；波峰2为穿透峰，预计该蛋白成分主要为不与镍柱结合的杂蛋白；波峰3为50mM咪唑吸收峰，预计为杂蛋白；波峰4为100mM咪唑吸收峰，预计含有少量目标蛋白(即重组蛋白：sep15-GB1-His-tag)；波峰5为200mM咪唑吸收峰，预计为目标蛋白的主要洗脱浓度；波峰6为300mM咪唑吸收峰，吸收峰较弱，预计已无或少量目标蛋白。
表5
5、SDS-PAGE电泳验证(酶切前)
(1)组装1nm胶板，加入ddH2O静置5min以检漏，检漏完后倒掉ddH2O，用滤纸吸干。
(2)配制12％分离胶，加入胶板至3/4处，并用酒精均匀封液以压平分离胶，静置20min后,分离胶与酒精之间有明显界线，均匀加入配置好的浓缩胶，用枪头赶走气泡，插入梳子。
(3)从过柱收集的上样峰，穿透峰,50mM咪唑，100mM咪唑，200mM咪唑，300mM咪唑分别吸出10ul到新的EP管中，各加入2ul 5Xprotein loading混匀，100℃煮沸10min，再5000rpm离心2min，加样前混打均匀。
(4)组装电泳仪，将10X电泳液稀释成1X的，倒入电泳内槽中检漏，捡漏完后轻轻拔掉梳子，在第一孔道加入5ul的Protein Market，之后依次加入样品。
(5)盖上电泳盖，打开电源，设置80V,25min，之后换成120V，跑约50min至Market跑开。
(6)关闭电源，取出胶，切去浓缩胶部分，将分离胶部分放入饭盒中，倒入适量染色液，放入微波炉中，中低火加热2min。
(7)将染色好的胶转移到另一容器以洗脱染色液，加入适量的水，于微波炉中，中低火加热10min，换水再加热约10min至脱色完全。
(8)在凝胶成像系统中拍照，观察。
图3为纯化后的蛋白的SDS-PAGE电泳结果图(酶切前)；图3中，M为Marker泳道；1为上样峰泳道；多为非特异性蛋白，该峰蛋白成分与原样蛋白相同；2为穿透峰泳道，该峰蛋白成分与原样蛋白相同；3为50mM咪唑洗脱峰泳道，含有较多杂蛋白，在25kda左右有微弱条带，属于目标蛋白；4为100mM咪唑洗脱峰泳道，含有部分杂蛋白，在25kda左右有显著条带，属于目标蛋白；5为200mM咪唑洗脱峰泳道，在25kda左右有显著条带，属于目标蛋白；6为300mM咪唑洗脱峰泳道，在25kda左右有较显著条带，属于目标蛋白。
6、透析(酶切前)
(1)透析袋的前处理：剪取适量长度，在含有2％NaHCO3的EDTA(1mM，PH＝8)中煮沸10min,用水彻底清洗，再放入EDTA(1mM,PH＝8)中煮沸10min，在800ml ddH2O中搅拌10min，重复搅拌2次。
(2)将10X PBS稀释成1X的PBS，倒入2L烧杯中，将透析袋抚平，对折，用夹子夹住一端，用5ml大枪将图3中200mM咪唑洗脱峰泳道对应的蛋白溶液加入透析袋中(图3观察后，我们发现了200mM咪唑里洗脱的蛋白质较纯，且蛋白条带在25kda大小，我们认为那是目标蛋白，所以对该管收集的溶液进行了透析，目的是为了除去该溶液内的咪唑成分，使蛋白不至于在咪唑溶液中析出变性)，抚平端口，用夹子夹好。
(3)将磁力转子放入烧杯中，放入4℃冰箱搅拌透析，转速以透析袋均匀转动为标准。
(4)每三小时换一次透析液(PBS)，共透析三次。
(5)透析后取5ml最后一次透析的PBS待蛋白定量时可用。收集蛋白液于4℃冰箱保存，透析袋用蒸馏水彻底清洗干净后放于50％乙醇中，4℃保存。
7、BSA法蛋白浓度定量(酶切前)
(1)按照A液：B液＝50:1的比例配制工作液，将2mg/ml的BSA稀释成0.5mg/ml。将透析后的蛋白原样取20ul稀释5倍，取10ul稀释10倍待用。
(2)按照表6所示的标准曲线梯度浓度试剂加入量，在96孔板中加样制作标准曲线，每样加3个平行以减少误差。
(3)依次加入20ul蛋白原样、1/10蛋白原样、1/30蛋白原样(均定容到20ul)，每样3个平行，各加入200ul工作液。
(4)放入37℃恒温箱中反应30min
(5)于酶标仪中测量在595nm处的分光光度值，并计算浓度，结果见表7。
由表7中的数据在Excel软件中作图得到标准曲线如图4所示，标准曲线公式：y＝0.85096x-0.20378，其中R2＝0.99497，R2＞0.99，说明实验数据可靠，误差极小。表8为样品酶切前定量595nm吸光值数据；表8中1/5样品浓度的吸光值在标准曲线范围内，将其带入标准曲线公式，得原样品浓度为0.217mg/ml，蛋白液总体积约为56ml，得目标蛋白总量为12.16mg(含Sep15蛋白的重组蛋白)。
表6
表7
表8
8、酶切蛋白与SDS-PAGE跑胶验证
(1)BSA法定量蛋白浓度后，取10ul蛋白液，记为未酶切，剩余的按照4U/ml的比例向蛋白液中加入凝血酶于室温中酶切48小时。
(2)取10ul已酶切蛋白液，加入2ul 5Xprotein loading混匀，100℃煮沸10min,再5000rpm离心2min，加样前混打均匀。未酶切的10ul蛋白液同法处理。
(3)跑胶验证酶切是否完全。
图5为酶切鉴定结果，图5中M为Marker泳道，1为酶切后蛋白泳道，在11kDa上下共有两条条带，一条为15kDa左右，即Sep15蛋白，另一条为酶切下的GB-1部分；2为酶切前蛋白泳道，在25kDa处有1个条带，泳道1与泳道2对比说明酶切成功。
9、镍柱亲和层析柱纯化蛋白(酶切后)
(1)将样品及配制好的亲和层析试剂分别用0.45μm滤膜过滤。
(2)连接好镍柱，打开电脑及快速蛋白层析系统，打开UNICORN软件。
(3)点击Pump,设置Flow为3ml/min，按insert确认，点击other,选择PauseTimer可设置停止时间。亲和层析过程中注意不要使pressure超过0.5。
(4)洗柱子过程按下表9所示进行，每次换液时必须按pause，换好后按continue继续，全部样洗完后按End结束。
(5)除了蛋白样品流速为1ml/min，及0.5M NaOH的为2ml/min外，其余的流速都设置为3ml/min。
图6为镍柱亲和层析过柱结果图(酶切后)；图中，波峰1(91～130ml)为上样峰，预计为目标Sep15蛋白；波峰2(131～165ml)为穿透峰①，预计含部分目标Sep15蛋白；波峰3(166～181ml)为穿透峰②，预计含微量目标Sep15蛋白；波峰4(197～408ml)为50mM咪唑吸收峰，预计含微量目标Sep15蛋白及酶切下来的GB-1部分；波峰5(421～486ml)为300mM咪唑吸收峰，预计该蛋白成分与原蛋白成分相同。
表9
10、SDS-PAGE电泳验证(酶切后)
(1)配好1mm，15孔的胶备用。
(2)从过柱收集的上样峰，穿透峰，50mM咪唑，300mM咪唑分别吸出10ul到新的EP管中，各加入2ul 5Xprotein loading混匀，100℃煮沸10min,5000rpm离心2min，加样前混打均匀。
(3)组装电泳仪，将10X电泳液稀释成1X的，倒入电泳内槽中检漏，捡漏完后轻轻拔掉梳子，在第一孔道加入5ul的Protein Market，之后依次加入样品。
(4)盖上电泳盖，打开电源，设置80V，25min，之后换成120V，跑约50min至Market跑开。
(5)关闭电源，取出胶，切去浓缩胶部分，将分离胶部分放入饭盒中，倒入适量染色液，放入微波炉中，中低火加热2min。
(6)将染色好的胶转移到另一容器以洗脱染色液，加入适量的水，于微波炉中，中低火加热10min，换水再加热约10min至脱色完全。
(7)在凝胶成像系统中拍照，观察。
图7为纯化后SDS-PAGE电泳结果图(酶切后)；图7中，M为Marker泳道；1为上样峰泳道；条带显示在11kda上方有明显条带，为目标Sep15蛋白；2为穿透峰①泳道，在11kda上方有明显条带，为目标Sep15蛋白；3为穿透峰②泳道，在11kda上方有微弱条带，属于目标Sep15蛋白；4为50mM咪唑洗脱峰①泳道，5为50mM咪唑洗脱峰②泳道，6为50mM咪唑洗脱峰③泳道，它们在11kda左右有两条微弱条带，属于酶切后的目标Sep15蛋白及切下的GB-1部分；7为50mM咪唑洗脱峰④泳道，在11kda下方有微弱条带，属于切下的GB-1部分；8为300mM咪唑洗脱峰泳道，在25kda左右，11kda左右共有三条有微弱条带，预计该峰成分与原蛋白成分相同。
表10为标准曲线595nm吸光值；由表10中数据在Excel软件中作图得到标准曲线，如图8所示，标准曲线公式：y＝1.6912x-0.31084，其中R2＝0.99362，R2＞0.99，说明实验数据可靠，误差极小。表11为样品第二次定量595nm吸光值数据；表11中1/5样品浓度在595nm下吸光值为0.224，在标准曲线有效值内，代入计算，得原样品浓度为0.34mg/ml，蛋白总体积约为15ml，共得5.1mg目标蛋Sep15蛋白。
表10
表11
11、胶内酶切后质谱鉴定
(1)切下要回收检测的胶块，水洗胶块两次，吸走液体。
(2)胶块脱色：加考染脱色液100uL，室温脱色1h左右，直至胶块的颜色完全褪去，水洗胶块两次，将脱色后染料洗去，吸走液体。
(3)胶块脱水：加50％ACN，脱水后吸出，再加100％ACN让胶块脱水，吸走液体。
(4)还原烷基化
①加50uL 10mM DTT溶液(溶于25mM NH4HCO3)，56℃水浴50min后离心，吸走液体。
②加50uL 55mM IAA溶液(溶于25mM NH4HCO3)，避光反应15min，吸走液体。
③加100uL水洗胶块，将反应剩余液体吸走。
④胶块脱水：加50％ACN，脱水后吸出，再加100％ACN让胶块脱水，吸走液体。
(5)加入胶酶5-10uL，让胶块充分吸涨至颜色变透明(约20min)，再加
覆盖液。
(6)37℃水浴过夜16h。
(7)MALDI-MS分析：直接取酶解液上清。
图9为胶内酶切后质谱鉴定图，通过搜库得出：质谱分析结果表明胶内蛋白与库中的Sep15蛋白有95％的匹配率。
实施例2ThT荧光光谱法检测Sep15对Tau R2蛋白聚集反应的影响
1、将上述纯化的Sep15蛋白溶于Tris Buffer中
取500uL Sep15溶液、2mL Tris Buffer加入至超滤瓶中，取另一只空管加水配平后4℃离心，设置转速5000rmp，浓缩至500uL。
2、配制检测液，见下表12；
表12
每组配制总体积600μL，分3孔重复，分别加入至荧光96孔板中，每孔上样190μL。
3、ThT荧光光谱法检测
开启多功能酶标仪，打开电脑软件，设置参数(检测波长：EX 440nm、EM485nm，孵育温度：37℃，实验时长：48小时)，将板放入仪器内，进行检测。
图10为Tau R2聚集实验检测结果图；图中，除空白对照外，其余组的吸光度均随着检测时间的延长而逐渐升高，达到一定峰值后趋于稳定。第2组与第3组对比可知，加入肝素钠后溶液吸光度值明显升高；第3组与第4组对比可知，加入Sep15后被测液体吸光度值上升速度明显下降；而第3组与第5组对比可知，加入SelR被测液体吸光度值没有明显变化。
实施例3ThT荧光法检测Abeta1-42聚集过程
1、相关溶液：
ThT母液：1mmol/L溶于PBS(0.0032g溶于10ml)(现配现用，震荡混匀，过滤去掉絮状杂质)；
Abeta1-42母液：200umol/L溶于DMSO；
Sep15蛋白母液：500umol/L溶于PBS(7.5mg/ml)。
2、在96孔板中，分别加入ThT，Abeta1-42(蛋白)使其终浓度分别为20uM,20uM(1uM)，最后用PBS补齐使总体积为200ul
3、加入荧光光度计中，37℃激发波长为444nm，发射波长485nm，每隔5测1次，共进行12小时测定，作图。
图11为Abeta1-42聚集实验；图11中可以看到在加入Sep15后，Abeta1-42聚集的曲线较于对照组聚集程度降低显著。图12为含有其他蛋白的Abeta1-42聚集实验图；图12中加入SelR(硒蛋白R)和BSA(胎牛血清蛋白)作为其他蛋白对照，可以看出，只有加入了Sep15的组别，聚集情况显著下降。以上研究表明，ThT荧光强度与Abeta1-42纤维聚集形成的含量呈正相关。
由实验结果图可知，纯化过程中设置的洗脱梯度可以很好的分离纯化目标蛋白。由酶切前蛋白定量得：含Sep15蛋白的重组蛋白总量为12.61mg，此时的重组蛋白大小为25kDa，即酶切前重组蛋白为：0.4864umol，酶切后定量得Sep15蛋白总量为5.1mg，此时的蛋白大小为15kDa，即酶切后Sep15蛋白总量为0.34umol。即酶切转化率为(0.34/0.4864)*100％＝69.9％，即酶切损失率为1-69.9％＝30.1％。由于Tau蛋白在体外不会自发聚集，故加入肝素钠促进Tau蛋白聚集。已知硫黄素T(Thioflavin T,ThT)对蛋白质单体只有极弱的亲和力，但可以在数秒内特异嵌入聚集体的β片层中，荧光强度增加数倍。研究表明，ThT荧光强度与Tau蛋白聚集程度成正相关。实验结果表面，加入Sep15蛋白后吸光度上升速度明显下降，即Sep15可以抑制Tau蛋白的聚集，而SelR则对Tau蛋白的聚集不产生显著影响。ThT荧光强度与Aβ42纤维聚集形成的含量呈正相关。结果中显示Abeta1-42在加入SelF后吸光度值应有所下降，即Sep15对Abeta1-42聚集反应有一定的抑制作用，而同为硒蛋白的selR就无明显变化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Sep15蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。
2.一种Sep15蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的表达载体转入大肠杆菌中，得到转化菌种；
将所述转化菌种进行诱导培养后，得到培养菌液；
将所述培养菌液超声处理，然后离心分离得到上清液；
将所述上清液进行酶切处理，然后层析分离得到所述Sep15蛋白。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述诱导培养的步骤包括：将所述转化菌种进行摇床扩摇培养至OD值为0.6-0.8，然后加入诱导剂，再进行摇床诱导培养。
4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述摇床扩摇培养的条件包括：35-37℃恒温摇床3-4h；和/或
所述摇床诱导培养的条件包括：15-16℃恒温摇床12-24h。
5.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述超声处理的条件包括：4-6℃超声25-30min；和/或
所述离心分离的条件包括：7000-8000rpm离心25-30min。
6.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述酶切处理的步骤包括：按照4U/ml的比例向所述上清液中加入凝血酶，酶切40-48h。
7.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述层析分离为镍柱亲和层析分离。
8.如权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述镍柱亲和层析分离的步骤包括：用50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L的咪唑浓度梯度溶液进行梯度洗脱。
9.如权利要求1所述的表达载体在Tau蛋白和/或Abeta的聚集反应的检测中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测的方法为ThT荧光光谱法。
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