CN100999551A - 小蛋白结构域在大肠杆菌中的高效表达和纯化系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适合用于产生小肽的多肽，本发明还提供了一种用于小肽表达的载体。本发明的系统解决了小肽难于表达且易降解的问题，改善了小肽的表达效率，增加了小肽的可溶性和稳定性。

Description

小蛋白结构域在大肠杆菌中的高效表达和纯化系统

技术领域

本发明涉及基因技术领域，更具体地，本发明涉及一种蛋白表达和纯化的系统。

背景技术

真核细胞中，蛋白一般较大并且由许多结构域或模块组成。蛋白结构域具有多样性和特异性，并在结构和功能上成为相对独立的单位。由此，孤立的小蛋白结构域在结构和功能研究，特别是NMR结构的阐明方面非常普遍。

然而，小结构域的制备仍然存在几个技术瓶颈，例如，合成肽的价钱昂贵，并且产量相对低，特别对于大于50个残基的较大的肽。重组表达体对于得到小结构域是一个选择性的对策，但表达量通常较低。以大肠杆菌融合的办法表达肽区是近年来较常用的方法，诸如谷胱甘肽S-转移酶(GST)[K.L.Guan，J.E.Dixon，Eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli：an improved thrombincleavage and purification procedure of fusion proteins with glutathioneS-transferase，Anal.Biochem.192(1991)262-267.]，麦芽糖-结合蛋白质(MBP)[C.D.Guan等，Vectors that facilitate the expression and purification of foreignpeptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein，Gene 67(1988)21-30.]和硫氧还蛋白(Trx)[E.R.LaVallie，等，A thioredoxin gene fusionexpression system that circumvents inclusion body formation in the E.colicytoplasm，Biotechnology 11(1993)187-193.]，它可以改善表达水平，增加靶肽的稳定性和可溶性，并防止靶肽被细胞蛋白酶水解。便于纯化的亲和标签和蛋白酶解或化学裂解的切割位点[D.A.Lindhout等，High-yield expression ofisotopically labeled peptides for use in NMR studies，Prot.Sci.12(2003)1786-1791.]，有助于得到天然的具有生物活性的的肽段。几个研究群体已经报导了疏水蛋白融合表达系统的成功构造，但多数融合蛋白以形成包涵体告终[D.H.Jones等，Expression and membrane assembly of a transmembrane region fromNeu，Biochemistry 39(2000)1870-1878；M.Sharon，等，Expression，purification，and isotope labeling of a gp120 V3 peptide and production of a Fab from a HIV-1neutralizing antibody for NMR studies，Prot.Exp.Purif.24(2002)374-383.]。

此外，以包涵体形式存在的蛋白的纯化需引入一个额外的步骤，即使用化学变性剂得到靶肽产物。对于含有甲硫氨酸的肽产物，不能选择溴化氰(CNBr)裂解法。通常多数已使用的GST、MBP或者Trx融合伴侣因为很大，所以既不能得到高产量的靶肽，留有融合伴侣时又不能进行生化鉴定。

综上，在后基因组时代，集于大蛋白的小结构域的研究是重要的，但是在进行结构和生物学研究过程中，结构域的低表达水平，不溶性和不稳定性一直是阻碍该项技术发展的瓶颈。因此，目前现有技术中迫切需要一种可高效表达和/或纯化小蛋白的系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可高效表达和/或纯化小蛋白的系统，所述系统解决了小肽表达时溶解性差且易降解的问题。

在本发明的第一方面，提供一种下式所示的多肽，

A-B-C          (式I)

式中，

A是GB1标签；

B是长度为10-300个氨基酸的小肽；

C是长度为4-10个组氨酸的组氨酸标签。

在另一优选例中，所述的小肽的长度为20-200个氨基酸。

在另一优选例中，所述的GB1标签即链球菌G蛋白的免疫球(蛋白)功能区。

在本发明的一个优选例中，在式I中，A和B之间还包括F元件，并且，F元件是蛋白酶切割位点。

在本发明的另一优选例中，在A和F元件之间还包括E元件，并且，E元件是1-10个氨基酸的接头。

在本发明的第二方面，提供一种分离核酸分子，它编码前面任一所述的多肽。

在本发明的第三方面，提供一种表达载体，含有前面所述的核酸分子。

在本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，它含有前面所述的表达载体，或者在其基因组中整合有前面所述的核酸分子。

在本发明的第五方面，提供一种生产小肽的方法，包括步骤：

(a)培养前面所述的宿主细胞，从而表达前述的多肽，

(b)分离出(a)中表达的多肽。

在本发明的一个优选例中，在步骤(b)之后还包括步骤：

(c)用蛋白酶对分离的式I所示的多肽进行切割，从而释放出式II所示的多肽，

B-C    (式II)

式中，

B是长度为10-300个氨基酸的小肽；

C是长度为4-10个组氨酸的组氨酸标签；

(d)分离出式II所示的多肽。

在另一优选例中，当需要将式I中B-C与A进行分离时，包括步骤：在式I中的A和B之间设置F，并且，F是蛋白酶切割位点；以及，用蛋白酶切割使B-C与A分离。

在另一优选例中，当需要将式I中B-C与A进行分离时，包括步骤：在式I中的A和B之间设置F，并且，F是蛋白酶切割位点；在A和F之间设置E，并且E是1-10个氨基酸的接头；以及，用蛋白酶切割使B-C与A分离。

在本发明的第六方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有启动子，并且在启动子之后从5’端至3’端依次含有以下元件：

(1)GB1标签；

(2)用于插入小肽编码序列的小肽插入位点，所述小肽的长度为10-300个氨基酸；

(3)4-8个组氨酸的组氨酸标签的功能位点；

(4)终止密码子。

在另一优选例中，所述的小肽插入位点为含有1-10种限制性内切酶的酶切位点。

在另一优选例中，所述的小肽插入位点为多克隆位点。

在另一优选例中，所述的小肽插入位点中含有BamHI和XhoI的酶切位点。

在另一优选例中，所述的组氨酸标签为6个组氨酸。

在另一优选例中，在小肽插入位点插入小肽的编码序列后，所述的表达载体表达前面所述的多肽。

在另一优选例中，所述的表达载体源自pET载体、PCDEF载体、PGEX4T-1载体、pCDNA、或各种强启动子载体。更特别的，如pET-22b载体。

在另一优选例中，在(1)和(2)之间，还包括：(b)蛋白酶切割位点。

在另一优选例中，所述的蛋白酶可以是任何一种专一性蛋白水解酶。比如，所述的蛋白酶切割位点包括但不限于：凝血酶切割位点、V8酶切割位点、Glu-C酶切割位点、Arg-C酶切割位点等。

在另一优选例中，在(1)和(b)之间，还包括：(a)1-10个氨基酸的接头。

在另一优选例中，所述的小肽的长度为20-200个氨基酸。

在本发明的第七方面，提供用于生产长度为10-300个氨基酸的小肽。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1 pGBTNH载体示意图。PGBTNH由pET表达载体改建而成，在pET表达载体的可诱导的T₇RNA聚合酶启动子之后，依次为GB1标签，接头，凝血酶切割位点，多克隆位点(MCS)和羧基端的6个组氨酸标签。

图2 细胞裂解后溶菌产物的SDS-PAGE图。(A)GB1-CUEb；(B)GB1-WW1；(C)GB1-UIM；(D)GB1-DATc。泳道1，分子质量标准参照物；泳道2，IPTG诱导前全细胞的溶解产物；泳道3，IPTG诱导后全细胞的溶解产物；泳道4，溶菌产物的沉淀；泳道5，上清液。箭头指出了融合蛋白的表达位置。

图3 接头区对凝血酶切割的影响。(A)GB1-CUEa融合蛋白的凝血酶的切割；(B)GB1-CUEb融合蛋白的凝血酶的切割。泳道1和4，分子质量标准参照物；泳道2，切割前的GB1-CUEa蛋白；泳道3，切割后的GB1-CUEa蛋白；泳道5，切割前的GB1-CUEb蛋白；泳道6，切割后的GB1-CUEb蛋白。对照表明接头的位置和长度影响着凝血酶切割的效率和特异性。

图4 GB1融合蛋白的凝血酶切割。(A)GB1-WW1；(B)GB1-UIM；(C)GB1-DATc。泳道2，切前；泳道3，切后；(C)的泳道4是切割产物的上清，泳道5是沉淀。

图5 CUEb结构域的纯化和CD光谱。(A)使用Ni-NTA色谱的GB1-CUEb的纯化。泳道2，沉淀；泳道3，上清；泳道4，穿出；泳道5，20mM咪唑冲洗；泳道6，250mM咪唑洗脱。(B)GB1-CUEb的凝血酶切割。蛋白在缓冲液B中加入凝血酶在4℃以不同的时间间隔孵育。泳道2-6，分别孵育0，30，60，120和240分钟。(C)使用Ni-NTA色谱的CUEb肽段的纯化。泳道2，切前的GB1-CUEb蛋白；泳道3，切割2小时；泳道4，上样；泳道5，穿出；泳道6，20mM咪唑冲洗；泳道7，已结合在Ni-NTA柱的CUEb肽段经250mM咪唑洗脱。(D)CUEb结构域的远紫外CD谱。

图6 WW1结构域的纯化和生化鉴定。(A)GB1-WW1蛋白的凝血酶切割和经Ni-NTA色谱纯化的WW1肽段。泳道2，切前的GB1-WW1蛋白；泳道3，切割4小时；泳道4，上样；泳道5，穿出；泳道6，已结合在Ni-NTA柱的WW1肽段经250mM咪唑洗脱。(B)WW1肽段的质谱图。质谱分析WW1的分子量为5145.4Da，与期待的氨基酸序列相似(5148.5Da)。(C)氮标的WW1结构域的HSQC谱图。共振峰的高分散性表明WW1结构域有很好的折叠。

图7 α-Syn_31-109片断的表达和纯化。(A)细胞裂解后的SDS-PAGE图。泳道2，IPTG诱导前全细胞的溶解产物；泳道3，IPTG诱导后全细胞的溶解产物；泳道4，沉淀；泳道5，上清。(B)GB1-α-Syn_31-109经凝血酶切割。泳道2，GB1对照；泳道3，无组氨酸标签的融合蛋白经离子交换色谱的纯化；泳道4，凝血酶的切割。

图8 本发明的小肽表达和/或纯化系统的示意图。其中，用虚线表示的斜线框(接头)或竖线框(蛋白酶切割位点)表示可选择插入的位点。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现在适当的表达载体中加入链球菌G蛋白的免疫球(蛋白)功能区(GB1)标签和/或组氨酸(His)标签，在GB1标签之后或在GB1和His两种标签之间插入靶肽(小肽)的基因，可高效地表达和/或纯化靶肽。基于此完成了本发明。

如本发明所用，术语“小肽”、“小蛋白”、“小结构域”、或“小蛋白结构域”可互换使用，都指具有10-300个氨基酸的蛋白或多肽；更优选的，为具有20-200个氨基酸的蛋白或多肽；最优选的，为具有35-150个氨基酸的任何一种蛋白或多肽。

更具体地，本发明的小肽表达和/或纯化系统的示意图见图8。

本发明人选择了含有56个氨基酸的链球菌G蛋白的B1免疫球蛋白结合区域(GB1)[参见Goward，C.R.；Murphy，J.P.；Atkinson，T.；Barstow，D.A.Biochem J(1990)，267，171-177.；Y.Cheng等，An efficient system for small proteinexpression and refoding，Biochem.Biophys.Res.Commun.317(2004)401-405]作为融合的表达和纯化系统的一部分。以GB1作为融合伴侣。与其它先前用过的表达系统相比，本发明所用的融合伴侣非常小并且高度可溶，所以能够生产高可溶性和稳定性的融合蛋白，并且对用于生化鉴定的小结构域有着特别的优点。GB1融合的方法也能够在不影响自身结构的同时增加融合靶肽的表达产量，稳定性和可溶性。

在本发明的一种优选方式中，在GB1和靶肽基因插入位点之间，还设计了蛋白酶切位点，通过高特异性的蛋白酶切割，GB1标签便可去除。在本发明的一个优选例中，所述的蛋白酶为凝血酶。凝血酶切割后，甘氨酸和丝氨酸两个残基被留在靶肽的氨基端，插入到GB1标签和凝血酶切割位点间的含有丝氨酸和甘氨酸残基(图1)的接头可以增加酶切效率。

在本发明的一种优选方式中，在靶肽基因插入位点之后，还设计了组氨酸标签，通过比如亲和层析等手段便可方便地纯化所述的靶肽。比如，在本发明的一个实施方式中，使用Ni-NTA亲和色谱可将被组氨酸标签的靶肽进一步纯化。

尽管在以往的多肽表达试验中，已经使用过组氨酸作为标签，但是技术人员只是将组氨酸构建在质粒的氨基端或在GB1和靶肽段的中间，而试验发现，组氨酸在质粒的氨基端大大影响靶肽表达量，组氨酸在GB1和靶肽段中间大大增加纯化过程降解的可能性。至今没有人将组氨酸标签构建在靶肽段的羧基端。本发明人将组氨酸标签构建在靶肽段的羧基端所构建的pGBTNH载体有高效表达水平并通常能够使融合蛋白保持高稳定性。

在另一种方式中，可在靶肽基因的末端设计终止子，使最后获得的蛋白上没有组氨酸标签。

此外，可选择的，可在GB1和靶肽段间设计一段接头序列，接头的设计非常重要，一般针对所需表达的蛋白的特点来进行设计，接头太短可能降低酶切效率，而接头太长可能增加降解。

本发明的表达和纯化小肽的系统可适用于表达和纯化任何一种具有10-300个氨基酸(更优选的，为30-200个氨基酸；最优选的，为35-150个氨基酸)的肽。通常，所述的小肽序列中不含有对应于F元件的蛋白酶酶切位点。代表性的小肽包括(但并不限于)：CUEa、CUEb、WW1、WW2、UIM、DATc、α-Syn_31-109或α-Syn_61-95。

在本发明中，用于克隆入式I所示多肽的表达载体可以来源于不同种类的现有载体。应理解，只要能够克隆入式I所示的多肽、并且可表达式I所示多肽或其部分的表达载体都可应用于本发明。在本发明中，优选表达量高的表达载体，包括(但不限于)：pET系列载体、或各种强启动子载体。表达载体中，除了含有本发明所述的GB1标签、小肽插入位点、和/或蛋白酶切割位点、接头、组氨酸标签以外，一般自身还携带了启动子、抗性筛选位点、酶切位点等，通常载体的构建和选择是现有技术中普通人员所熟知的。

含有式I所示多肽的表达载体可转入宿主细胞中进行表达；或者在宿主细胞的基因组中整合编码所述多肽的核酸分子，再表达所述多肽。应理解，任何一种可载入表达载体并表达出多肽或其基因组中能够整合编码所述多肽的核酸分子并表达出多肽的宿主细胞在本发明中都是可用的，包括但不限于大肠杆菌。

在本发明的一个优选实施例中，本发明人构建了两个基于pET-22b表达载体的旨在表达小肽的载体系统，在这两个载体系统中，编码融和蛋白的载体pGBTNH含有凝血酶切割位点和接头，而载体pGBH却没有。载体pGBTNH用于表达含有GB1标签，接头，凝血酶切割位点，靶肽和羧基端含有6个组氨酸标签的融合蛋白(图1)。根据它们自身的特点可知，pGBTNH适合生产经融合蛋白酶切后可溶性好和稳定的肽段；pGBH适合生产不可溶和不稳定的肽段。此外，如果要求靶肽的羧基端为没有组氨酸标签的天然形式，可以在融合蛋白的靶肽段基因后通过插入终止密码子获得。本发明的系统不仅有意义地增加了表达产量，而且改善了蛋白的可溶性和稳定性。在本发明的具体实施方式中，被推测在真核细胞中有重要功能的八个肽区都能以GB1融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。

在本发明的后续的实施例中，本发明人使用了不同的肽和小结构域测试本发明构建的小肽表达系统。所述的肽和小结构域包括：CUE，Tollip蛋白中与泛素相互作用的结构域，含有43个残基并可能含有3个α螺旋，已证实结合泛素到内质网并被降解[K.Burns等，Tollip，a new component of the IL-1RIpathway，links IRAK to the IL-1 receptor，Nat.Cell Biol.2(2000)346-351.]；WW1和WW2，FBP-11蛋白中含有33个残基的β折叠结构，与富含脯氨酸的肽段相互作用行使不同的细胞功能[P.W.Faber等，Huntingtin interacts with a family ofWW domain proteins，Hum.Mol.Genet.7(1998)1463-1474.]；UIM，S5a蛋白中与泛素相互作用的基序，与单泛素或多泛素链及许多细胞蛋白的类泛素结构域相结合[K.Hofmann，L.Falquet，A ubiquitin-interacting motif conserved incomponents of the proteasomal and lysosomal protein degradation systems，TrendsBiochem.Sci.，26(2001)，347-350.]；DATc，含有38个氨基酸残基的多巴胺转运蛋白的羧基端胞质尾区[S.Shimada，S.Kitayama，C.L.Lin，A.Patel，E.Nanthakumar，P.Gregor，M.Kuhar，G.Uhl，Cloning and expression of acocaine-sensitive dopamine transporter complementary DNA，Science 254(1991)576-578.]；α-突触核蛋白(α-Syn)核心区负责α-Syn的积聚[H.Miake，H.Mizusawa，T.Iwatsubo，M.Hasegawa，Biochemical characterization of the corestructure of alpha-synuclein filaments，J.Biol.Chem.277(2002)19213-19219.]。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明人成功开发了应用于小结构域或肽段的结构功能分析的高效表达纯化系统。此系统改善了靶肽段的表达效率，增加了可溶性和稳定性。

(2)高可溶性的GB1标签也适用于生化鉴定方面的不溶性肽段。因此，本发明为蛋白水平的小结构域或模块的结构测定和功能分析提供了一个广泛的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

常规的PCR、酶切、连接、转化、电泳、质粒抽提、抗性选择、细菌培养等操作是本领域现有技术人员所熟知的，并且也可参照《分子克隆：实验室指南》中所列举的，在本发明中不作详细描述。

应理解，在实施例或实验材料和方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据所需获得的本发明结果而加以变化。并且，这些参数并非用来限定与本发明申请专利范围均等的原理，而是应用正常操作技术下所得到的较佳数据。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1构建表达载体pGBTNH和pGBH

GB1融合表达载体pGBTNH和pGBH，以GB1基因(A.M.Gronenborn等，A novel，highly stable fold of the immunoglobulin binding domain of streptococcal proteinG，Science 253(1991)657-661)作为模板，基于pET-22b载体(Novagen)构建而成。pGBTNH载体的结构见图1，在诱导的T₇RNA聚合酶启动子(图中略)之后，依次包括GB1标签，接头，凝血酶切割位点，多克隆位点和羧基端的6个组氨酸标签。pGBH除没有接头和凝血酶切割位点外，其它结构与pGBTNH相同。并且，pGBTNH，编码含有星号(图1)前的SSGLVPR片断的氨基酸序列。PGBH，编码不包括星号前的氨基酸序列。

在构建pGBTNH质粒时，编码凝血酶切割位点和接头的DNA片断，通过使用如下引物，以GB1序列和pET-22b载体为模板，利用常规PCR技术[R.Higucchi等，A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNAfragments：study of protein and DNA interactions，Nucleic Acids Res.16(1988)7351-7367.]扩增获得。

上游引物(SEQ ID NO：1)：

5’-ggagatata catatgcagtacaagcttgctctg-3’(下划线为Nde I酶切位点)；和

下游引物(SEQ ID NO：2)：

5’-ggcg ggatccgcgtggcaccagaccagaagattcggttaccgtgaagg-3’(下划线为BamH I酶切位点)。

采用如下引物，以GB1序列和pET-22b载体为模板，采用常规PCR技术获得pGBH。

上游引物(SEQ ID NO：3)：

5’-ggagatata catatgcagtacaagcttgctctg-3’(下划线为Nde I酶切位点)；和

下游引物(SEQ ID NO：4)：

5’-ggcg ggatccttcggttaccgtgaagg-3’(下划线为BamH I酶切位点)。

引物的限制酶切位点的DNA序列标注了下划线。PCR产物被限制性内切酶Nde I和BamH I消化并克隆到pET-22b载体。这些质粒的编码框被基因测序证实正确。

实施例2小结构域或片断的制备

本实施例选择了八个小结构域或片段来进行试验。编码各小结构域或片断的八个cDNA片断由PCR扩增获得，各小结构域或片段的来源如下：

CUE结构域(CUEa，CUEb)来自人的Tollip蛋白；

WW1和WW2结构域来自人的FBP-11蛋白；

UIM来自人的S5a蛋白；

DATc来自鼠多巴胺转运蛋白的羧基端胞质尾区；

α-Syn_31-109和α-Syn_61-95来自人的α-Syn(α-突触核蛋白)。

采用常规的方法，将上述PCR产物克隆入如实施例1制备的细菌表达载体pGBTNH或pGBH的BamH I和Xho I的克隆位点，见表1。

表1  本发明使用的结构肽区和相关信息

肽段名称	蛋白来源	GenBank登录号	残基编号	蛋白功能
					CUEa*	Tollip	NM_019009	229-271	与泛素结合
CUEb	Tollip	NM_019009	224-271	与泛素结合
					WW1	FBP-11	AF049528	145-177	与富含脯氨酸的肽段结合
WW2	FBP-11	AF049528	186-218	与富含脯氨酸的肽段结合
					UIM	S5a	U24704	196-307	与泛素结合
DATc	DAT	NM_012694	582-619	DAT的胞质尾区
					α-Syn31-109	α-synuclein	AY892800	31-109	抗蛋白酶解的核心
α-Syn61-95	α-synuclein	AY892800	61-95	α-Syn的NAC区

*CUE，结合泛素到内质网降解；WW，重复的色氨酸结构域；UIM，泛素相互作用基序；DAT，多巴胺转运蛋白；DATc，DA的胞质尾区；α-Syn(α-synuclein)，α-突触核蛋白；Tollip，Toll相互作用蛋白；FBP-11，formin(形成素)结合蛋白11；S5a，蛋白酶体的多泛素链结合蛋白；NAC，非淀粉状蛋白成分。

实施例3 GB1融合蛋白的表达和纯化

采用常规的转化方法，将实施例2中获得的含有结构肽基因的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。

融合蛋白的表达和纯化见以下步骤：

将10mL过夜菌转接到1L的LB培养基并在37℃振荡。当菌体的OD₆₀₀到约0.7时，加入0.1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导蛋白表达，并放于摇床在22℃振荡12小时。菌体离心收集(5000rpm，10分钟，4℃)，用缓冲液A(50mM磷酸，300mM NaCl，pH8.0，0.5mM PMSF(苯甲基磺酰氟化物))重悬，超声裂解并离心(15,000rpm，15分钟，4℃)。溶解物，上清液和沉淀均用SDS-PAGE(15％胶)分析并用考马斯染色。然后上清液加到之前被缓冲液A平衡好的Ni-NTA亲和柱(Qiagen)。逐渐增加咪唑浓度冲洗柱子后，最后用250mM咪唑将GB1融合蛋白洗脱下来。在缓冲液B(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，2.5mM CaCl₂，pH8.0)中于4℃透析16小时。

对于没有组氨酸标签的融合蛋白，蛋白的纯化使用离子交换色谱。含有GB1融合蛋白的上清液加到之前用缓冲液C(50mM Tris-HCl，pH8.8，0.1mM EDTA)平衡好的Q Sepharose Fast Flow柱。被结合到树脂上的的蛋白质用相同的缓冲液在0.5mL/分钟的流速下以0-500mM NaCl梯度洗脱。得到的目的融合蛋白放到用于凝血酶切割的缓冲液B中透析。

图2是利用pGBTNH载体在大肠杆菌中以GB1融合蛋白的形式表达所得的SDS-PAGE图片。其中，A为GB1-CUEb；B为GB1-WW1；C为GB1-UIM；D为GB1-DATc。泳道1，分子质量标准参照物；泳道2，IPTG诱导前全细胞的溶解产物；泳道3，IPTG诱导后全细胞的溶解产物；泳道4，溶菌产物的沉淀；泳道5，上清液。箭头指出了融合蛋白的表达位置。可见所述结构域以融合的形式高效表达，并且绝大部分融合蛋白存在于上清部分，表明标记GB1的肽段以可溶性形式存在。

本发明人也对靶肽在其它没有GB1标签的表达系统进行了比较，但实验证明这些小肽很难在许多诸如pET系列这样的载体中得以表达。因此，本发明所述的表达系统为小肽段的生化和功能研究提供了可能。

实施例4 GB1融合蛋白的凝血酶切割和结构肽的纯化

在缓冲液B中使用牛凝血酶(Sigma)将GB1标签从GB1融合蛋白中去除。一般，对于1mg的融和蛋白，GB1-CUEb用5单位的凝血酶在4℃孵育4小时；GB1-WW1，GB1-WW2和GB1-UIM分别用10单位的凝血酶在22℃孵育4小时；GB1-DATc用10单位的凝血酶在22℃孵育2小时；α-Syn_31-109用5单位的凝血酶在22℃孵育1小时。通过加入2mM PMSF将反应终止，反应产物的切割效率通过SDS-PAGE来分析。

然后靶肽段经过Ni-NTA亲和柱纯化并通过FPLC系统(快速蛋白液相色谱)用XK 16/70 Superdex-75制备级凝胶过滤柱(Amersham Biosciences)在缓冲液D(15mM磷酸钠，100mM NaCl，pH6.5，1mM DTT(1，4-二硫苏糖醇))中监控。使用SDS-PAGE(15％胶)和MALDI-TOF质谱(Bruker)的方法测量肽段的分子量。

CUE是一个Tollip蛋白上非常紧凑的结构域。当本发明人将含有43个残基的CUEa结构域插入到pGBTNH载体时，GB1-CUEa融合蛋白不能被凝血酶切割，见图3A，其中泳道1和4为分子质量标准参照物；泳道2为切割前的GB1-CUEa蛋白；泳道3为切割后的GB1-CUEa蛋白；泳道5为切割前的GB1-CUEb蛋白；泳道6为切割后的GB1-CUEb蛋白。然而，在载体的接头区加入更多的5个残基(在本实施例中，所述接头是CUE的一部分序列(224-228号残基))时，CUEb结构域就容易的从GB1-CUEb蛋白上切下来，见图3B。由此可得，可变的接头区对酶的切割是重要的。

GB1-WW1，GB1-UIM和GB1-DATc蛋白可完全被凝血酶切开，见图4。其中，A为GB1-WW1；B为GB1-UIM；C为GB1-DATc；泳道2为酶切前；泳道3为酶切后；C的泳道4是切割产物的上清，泳道5是沉淀。WW1(图4A)和UIM(图4B)都可以Ni-NTA亲和的方法除去GB1片断并以可溶的形式获得。然而，酶切后的DATc肽段以沉淀的形式存在(图4C)。DAT羧基端的胞质尾区DATc由许多疏水残基组成。DATc的不溶性使它很难得到特征性的结构。

为了结构分析，本发明人也将DATc克隆到不必切掉GB1标签的pGBH载体(以实施例中所述的方法获得pGBH载体，将DATc克隆到pGBH载体的BamH I和Xho I位点中)，在大肠杆菌中以GB1融合蛋白的形式表达，由于GB1的协助溶解，解决了DATc的可溶性问题。

实施例5 CUE结构域的制备和鉴定

1.圆二色谱(CD谱)测定方法

肽段的远紫外CD谱在室温下于Jasco-715圆二色仪上测定。保温前后的样品均用缓冲液调节至0.2mg/mL后测定。远紫外CD谱的各项参数为：采用0.1cm光径的CD杯，光栅宽度为1nm，反应时间0.25秒，扫描速度20nm/分钟，扫描范围250～190nm，扫描重复3次并记录相对毫度值平均值。得到的CD谱要减去缓冲液本底。为使CD谱光滑，还要进一步做降噪处理。

2.CUE结构域的制备和鉴定

CUE是一个与泛素相互作用的结构域。pGBTNH载体的应用性通过CUEb融合GB1标签得以评估。本发明人也试验了CUE结构域在只有6个组氨酸标签融合的pET-22b载体中的表达，表达水平很低。然而，通过使用pGBTNH载体表明，CUEb的结构肽区在表达量和可溶性方面有着巨大的改善(图2A)。

在大肠杆菌培养液中，GB1-CUEb融合蛋白的高表达可溶形式经Ni-NTA色谱纯化和BCA蛋白分析试剂盒确定，每升的产量约50mg，纯度可达到95％。

图5A证实GB1-CUEb蛋白的分子量即试验所需要的13KDa。通过凝血酶2到4小时的切割，分子量为6.5和5.5KDa的两部分分别显示在胶片上(图5B)。因为分子量为5.5-KDa的CUEb结构域其羧基端仍含有6个组氨酸标签，所以可结合到Ni-NTA树脂(图5C)。CUEb肽结构域可以在大肠杆菌培养液中经凝胶过滤进一步纯化，且每升的终产量为18mg，纯度大于95％。

远紫外CD谱确认了CUEb结构域的天然构象(图5D)。CD谱图上222nm和208nm展现的双负峰显示了典型的α螺旋优势结构。

实施例6 WW1结构域的制备和鉴定

1.¹H-¹⁵N HSQC NMR谱(HSQC谱)测定方法

补加¹⁵NH₄Cl(1g/L)(Cambridge Isotope Laboratories)到M9基本培养基作为制备¹⁵N标记结构肽的唯一氮源。其纯化及凝血酶切割与未标记时的操作步骤类似。样品在缓冲液E(90％H₂O/10％D₂O containing 15mM sodiumphosphate，100mM NaCl，pH6.5，1mM DTT)中被浓缩到1.0mM。经INOVA 600兆赫的光谱仪得到的HSQC谱要求在25℃下操作。

2.WW1结构域的制备和鉴定

图6A表明WW1结构域的酶切产物经Ni-NTA色谱纯化。令人关注的是，已纯化的WW1片断在胶片上的表观分子量约12KDa，而GB1-WW1蛋白的融合形式为14KDa。质谱分析给出了5145.4Da的分子量(图6B)，与从氨基酸序列(包括6个组氨酸标签)期待的结果一致(5148.5Da)。

由此证明，本发明人通过融合表达和凝血酶切割获得的WW肽段适于生化鉴定。WW1结构域的¹H-¹⁵N HSQC谱呈现的高分散性可使主链酰胺上的所有共振峰被识别(图6C)，说明小的WW1结构域以可溶形式被适当地折叠为丰富的二级结构。

实施例7无组氨酸标记肽的制备

一些试验中，由于组氨酸标签可能对其生化特性产生影响，因此没有组氨酸标记肽的制备就很必要。

在本实施例中，本发明人构建了两个表达质粒，即基于pGBTNH质粒但没有组氨酸标签的α-Syn的抗酶解片断(31-109)和NAC肽段(61-95)。构建方法如实施例1和实施例2，区别在于通过在所述片段之后设计终止子来构建没有组氨酸标签的α-Syn的抗酶解片断(31-109)和NAC肽段(61-95)

图7A显示，与前述质粒类似，融和蛋白在大肠杆菌中高效表达且可溶性很高。本发明人经离子交换色谱纯化了GB1-α-Syn_31-10融合蛋白，并经凝血酶切割去除GB1标签(图7B)。用于积聚研究的α-Syn_31-109肽段经进一步纯化获得。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                  序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>小蛋白结构域在大肠杆菌中的高效表达和纯化系统

<130>060025

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

ggagatatac atatgcagta caagcttgct ctg                                 33

<210>2

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

ggcgggatcc gcgtggcacc agaccagaag attcggttac cgtgaagg                 48

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

ggagatatac atatgcagta caagcttgct ctg                                33

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ggcgggatcc ttcggttacc gtgaagg                                        27

Claims (10)

1.一种下式所示的多肽，

                  A-B-C    (式I)

式中，

A是GB1标签；

B是长度为10-300个氨基酸的小肽；

C是长度为4-10个组氨酸的组氨酸标签。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，在式I中，A和B之间还包括F元件，并且，所述的元件F是蛋白酶切割位点。

3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，在A和F元件之间还包括E元件，所述的E元件是1-10个氨基酸的接头。

4.一种分离核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1-3任一所述的多肽。

5.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的表达载体，或者在其基因组中整合有权利要求4所述的核酸分子。

7.一种生产小肽的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的多肽，

(b)分离出(a)中表达的多肽。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(b)之后还包括步骤：

(c)用蛋白酶对分离的式I所示的多肽进行切割，从而释放出式II所示的多肽，

                      B-C    (式II)

式中，

B是长度为10-300个氨基酸的小肽；

C是长度为4-10个组氨酸的组氨酸标签；

(d)分离出式II所示的多肽。

9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有启动子，并且在启动子之后从5’端至3’端依次含有以下元件：

(1)GB1标签；

(2)用于插入小肽编码序列的小肽插入位点，所述小肽的长度为10-300个氨基酸；

(3)4-8个组氨酸的组氨酸标签的功能位点；

(4)终止密码子。

10.权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于生产长度为10-300个氨基酸的小肽。

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