CN108635508A - 金钗石斛生物总碱在制备抗衰老药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了金钗石斛生物总碱在制备抗衰老药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明从提取制备金钗石斛生物总碱，测量其含量，通过秀丽隐杆线虫抗衰老药效学实验、对半乳糖所致衰老小鼠模型的影响、对SAMP8小鼠脑衰老的保护作用及机制研究，证明石斛生物总碱可以改善SAMP8小鼠的学习记忆减退，增强运动耐量，减弱SAMP8小鼠脑萎缩情况，减少神经元丢失，实验结果效果与抗衰老药二甲双胍相似，提示石斛生物总碱亦具有抗衰老作用，其作用机制与上调抗衰老蛋白Klotho表达，减少Aβ的聚集和诱导自噬活性有关。充分证明了金钗石斛生物总碱用于制备抗衰老药物的效果。

Description

金钗石斛生物总碱在制备抗衰老药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为金钗石斛生物总碱的提取和其在制备抗衰老药物中的应用。

背景技术

衰老(senescence)又称老化，是一切多细胞生物随着时间的推移，自发的必然过程，在机体和组织的各级水平出现有害的改变，并表现出功能、适应性和抵抗力的减退过程，可分为生理性衰老和病理性衰老两类，生理性衰老是指生物体自成熟期开始，随增龄发生的、受遗传因素影响的、渐进的全身复杂的形态结构与生理功能不可逆的退行性变化，也称正常衰老。病理性衰老是指由于疾病或异常因素，所导致的衰老加速，也称异常衰老。衰老与老年性疾病有着密不可分的关系，衰老程度越严重，患病的机率越大。衰老是一个持续动态的、缓慢渐进的过程。这个过程从生长期结束后逐渐开始，它的影响要到老年期通过人体系统功能失调、器官功能衰退、细胞变性及蛋白质和酶活性变化逐渐表现出来。主要表现为机体对环境刺激的适应能力减弱甚至丧失，出现多种组织器官功能的衰退。

目前研究提出的衰老机制主要理论包括：免疫紊乱学说、遗传突变学说、自由基损伤学说、端粒丢失学说、体细胞突变学说、Aβ级联反应学说、线粒体功能紊乱学说、自噬功能受损学说等。

目前对于衰老的治疗主要包括非药物治疗和药物治疗两个方面。非药物治疗强调长期参加健身运动、多吃含核酸食物以及饥饿等，但依从性较差。研发延缓衰老药物一直备受关注，但至今依然没有药政管理部门批准的抗衰老药物。我国是中草药大国，中草药具有多成分、多靶点特点,在治疗很多慢性疾病方面有其独到优势。因此，从中草药中寻求有效抗衰老药物具有重要意义。

金钗石斛是我国传统医学中的名贵中药材，被誉为“神仙草”。据《神农本草经》中记载，金钗石斛有养胃生津、滋阴清热、润肺止咳和明目等功效。现代医学研究表明金钗石斛的主要化学成分有多糖、生物碱、菲类、酚类、香豆素、甾体、维生素、氨基酸、挥发油等。生物碱使其特征性成分，主要有抗白内障、免疫调节、降血糖、抗肿瘤、兴奋胃肠道、抗氧化、抗疲劳等。

发明内容

本发明的目的在于研究论证金钗石斛生物总碱在用于制备抗衰老药物中的应用的作用。

所述金钗石斛选用一年生或二年生。

所述金钗石斛生物总碱经脂溶性提取和水溶性提取而得。

所述金钗石斛生物总碱溶剂制剂的浓度为0.35-35μg/ml。

所述金钗石斛生物总碱的剂量为每天20-360mg/kg。

本发明从提取制备金钗石斛生物总碱，测量其含量，通过秀丽隐杆线虫抗衰老药效学实验、对半乳糖所致衰老小鼠模型的影响、对SAMP8小鼠脑衰老的保护作用及机制研究，证明石斛生物总碱可以改善SAMP8小鼠的学习记忆减退，增强运动耐量，减弱SAMP8小鼠脑萎缩情况，减少神经元丢失，实验结果效果与抗衰老药二甲双胍相似，提示石斛生物总碱亦具有抗衰老作用，其作用机制与上调抗衰老蛋白Klotho表达，减少Aβ的聚集和诱导自噬活性有关。充分证明了金钗石斛生物总碱用于制备抗衰老药物的效果。

附图说明

图1为本发明中石斛碱标准品气相谱图。

图2为两年生金钗石斛气相谱图。

图3为两年生铁皮石斛气相谱图。

图4为不同浓度DNLA给药对秀丽隐杆线虫生命周期的影响。

图5为不同浓度DNLA给药在35℃热应激条件下秀丽隐杆线虫生命周期的影响。

图6为高剂量金钗石斛生物总碱明显减弱D-半乳糖所致衰老小鼠免疫器官和组织的萎缩及病变(胸腺组织)。

图7为高剂量金钗石斛生物总碱明显减弱D-半乳糖所致衰老小鼠免疫器官和组织的萎缩及病变(皮肤组织)。

图8为金钗石斛生物总碱对各组小鼠肾组织的p21表达情况的影响。

图9为石斛生物总碱对SAMP8小鼠Morris水迷宫学习记忆功能的影响。

图10为石斛生物总碱对SAMP8小鼠学习记忆障碍的影响。

图11为石斛生物总碱对SAMP8小鼠运动功能的影响。

图12为石斛生物总碱对SAMP8小鼠脑组织湿重比的影响。

图13为石斛生物总碱对SAMP8小鼠β-半乳糖苷酶的影响。

图14为石斛生物总碱对SAMP8小鼠的海马和皮质神经元的影响。

图15为石斛生物总碱对SAMP8小鼠神经元的影响。

图16为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质Klotho蛋白水平的影响。

图17为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质Aβ_1-42和APP蛋白水平的影响。

图18为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质BACE1和PS1蛋白水平的影响。

图19为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质IDE和NEP蛋白水平的影响。

图20为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质LC3B、Beclin1和P62蛋白水平的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。

实施例一：金钗石斛生物总碱的提取方法

1.金钗石斛生物总碱的提取方法

1.1脂溶性总生物碱的提取

精密称取石斛样品粉末5g分别放置于250ml具塞锥形瓶中，加适量浓氨水，润湿，密闭放置30min，加氯仿100ml，回流提取2h，抽滤，回收氯仿，即得。

1.2水溶性总生物碱的提取

精密称取石斛各样品粉末5g分别放置于250ml具塞锥形瓶中，加适量浓氨水，润湿，放置30min，加正丁醇100ml，回流提取2h，抽滤，回收正丁醇，即得。

1.3石斛总生物碱的鉴别

用微量点样器吸取各样品液和石斛碱对照液20μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以V_氯仿:V_甲醇＝5:1为展开剂，展开后，用碘化铋钾试液喷雾显色，日光下观察，各斑点颜色均成橘红色。

1.4石斛总生物碱及石斛碱的含量测定

1.4.1标准曲线的制备

精密称取石斛碱对照品1mg，置100ml容量瓶，加氯仿至刻度。精取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分别置于分液漏斗中，精密加入氯仿至10.0ml，加入pH 4.5缓冲液5.0ml和0.04％溴甲酚绿溶液2.0ml，剧烈振摇3min，静置30min。使分层取氯仿液5.0ml，加0.01mol/L NaOH-无水乙醇溶液1.0ml，摇匀。以氯仿10.0ml，同法操作，作为空白对照，于620nm处测得吸收度。

1.4.2石斛总生物碱样品的测定

样品处理步骤：精密称取石斛各样品粉末0.5g分别放至于25ml具塞锥型瓶中，加浓氨水6滴，润湿，密闭放置30min，加氯仿10ml，回流提取2h，冷却后补充氯仿至原重，过滤。金钗石斛：取续滤液1.0ml于10ml容量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，从中吸取2.0ml置25ml容量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀(稀释125倍)，作为样品液。铁皮石斛：取续 滤液2.0ml于分液漏斗中，加氯仿液8.0ml(稀释5倍)，作为样品液。以氯仿10.0ml，同法操作，做空白对照。于波长620nm处分别测得吸光度。同时精密量取石斛碱对照品溶液(25μg/ml)2.0ml，置25ml容量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，量取其中10ml(含石斛碱20μg)，置于分液漏斗中，同法操作，测得吸光度。按下式计算样品中总生物碱的含量。

总生物碱的含量％＝(样品液吸收度×20μg×稀释倍数)/(标准品吸光度×样品重)×100％。

1.4.2石斛碱样品的测定

样品处理步骤：称取石斛样品各1g，置于索氏提取器中，加入75％酸性乙醇(pH＝3)250ml，80℃提取6h后，pH值调至7，减压浓缩回收乙醇，再调节pH值至10，80ml氯仿萃取5次，减压浓缩回收氯仿，最后用氯仿定溶至10ml。

色谱条件：色谱柱为毛细管柱，安捷伦6890N DB-5，30.0m×320μm×0.25μm，载气为He，流速为0.7ml/min，进样温度260℃，柱温以5℃/min的速度从150℃升至250℃(起止均稳定5min)，氢火焰离子化检测器检测，检测器温度为280℃，样品进样量为1μl。

2.含量测定

2.1石斛总生物碱含量的测定

结果表明，一年生金钗石斛总生物碱含量最高，随着年份的增长，其含量依次递减；三年生铁皮石斛总生物碱含量最高，其一年生、两年生总生物碱含量接近，见表1。

表1样品测定结果

Tab.1The results of contents sample

2.2石斛碱单体含量的测定

从测定结果和气相图谱均可看出，金钗石斛含有较多的石斛碱，而铁皮石斛中几乎不含有石斛碱。其中一年生、两年生金钗石斛石斛碱含量接近，而三年生减低约一倍，见表2。

表2样品测定结果

Tab.2The results of contents sample

附图1为斛碱标准品气相谱图Fig.1Gas Chromatogram of standard substanceof dendrobine

附图2为两年生金钗石斛气相谱图Fig.2Gas Chromatogram of Dendrobiumnobile

附图3为两年生铁皮石斛气相谱图Fig.3Gas Chromatogram of D.officinaleKimura et Migo。

实施例二:金钗石斛生物总碱抗衰老药效学实验

一、材料和方法

1.实验材料

1.1主要仪器：-80℃低温冰柜(日本三洋公司)，Milli QA纯水处理器(Millipore公司)，LRH-250型生化培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，MJ系列霉菌培养箱(北京北方利辉实验仪器设备有限公司)，TS系列恒温摇床(北京北方利辉实验仪器设备有限公司)等。

1.2试剂和药品：

金钗石斛总生物碱：研究原料药材为遵义赤水产8年生金钗石斛，将原料药材粉碎后，以溶剂法分离提取总生物碱，UPLC-MS测定其纯度为78.9％。胰蛋白胨(北京索莱宝科技有限公司)、琼脂粉(北京索莱宝科技有限公司)、酵母粉(OXOID)、甘油(北京索莱宝科技有限公司)、5-氟-2-脱氧尿苷(北京索莱宝科技有限公司)、DMSO(北京索莱宝科技有限公司)等。

1.3实验动物

野生型秀丽隐杆线虫(N2)，雌雄同体，由中国科学院昆明植物研究所罗怀容教授提供，20℃培养。

2.实验方法

2.1实验分组：①DMSO溶剂对照组、金钗石斛总生物碱0.0035、0.035、0.35、3.5、35μg/ml组

②DMSO溶剂对照组+热应激胁迫组、热应激胁迫+金钗石斛总生物碱0.0035、0.035、0.35、3.5、35μg/ml组

2.2同期化秀丽隐杆线虫

ddH₂O(已灭菌)8ml冲洗N2线虫平板，尽量将卵全部洗脱；收集到8ml洗脱液转移到1.5ml离心管；向管中加入新配制的裂解液(5MNaOH:次氯酸钠＝1：1)2ml(洗脱液：裂解液＝4：1)混匀，可见离心管内出现许多泡沫，继续混匀并观察，在显微镜下观察5min，线虫裂解一半以上，呈断节状；1150g离心2min；管底有淡黄色沉淀，倒去全部液体，加入10ml无菌ddH2O重悬；1150g离心2min；倒去全部液体用8ml无菌M9重悬管底沉淀，混匀，20℃ 培养箱培养9小时以上，离心管至于冰上10min，1800g离心2min收集L1期线虫，NGM培养基上培养52-56小时后用于衰老相关实验。

2.3寿命实验

同期化至L4后期或成虫早期线虫用于寿命实验，每组3皿NGM培养基，每皿30条线虫，挑取转移当天记为寿命实验第0天，前八天每隔一天转板一次，之后每3-4天转板一次，第十天开始计数线虫死亡情况，直至各组线虫全部死亡。

2.4热应激实验

同期化至同期化至L4后期或成虫早期线虫用于寿命实验，每组3皿NGM培养基，每皿30条线虫，挑取转移当天记为寿命实验第0天，线虫培养至第五天开始热应激实验，35℃热激，每2h计数一次线虫死亡数量，直至各组线虫全部死亡。

3.数据的统计分析

实验数据用SPSS17.0统计软件统计，所有数据以(Mean±SE)表示，多组间比较采用ONE-WAY ANOVA处理，方差齐使用LSD法，方差不齐使用Dunnett’T₃法，P<0.05认为有差异，P<0.01认为有显著性差异。

二、结果

2.1寿命实验结果

见附图4：不同浓度DNLA给药对秀丽隐杆线虫生命周期的影响。

图4显示与1/1000DMSO溶剂对照组比较，0.35μg/ml和35μg/mlDNLA给药能延长秀丽隐杆线虫的生命周期，延长率分别为37.02％和23.84％。

2.2 35℃热应激结果

见附图5不同浓度DNLA给药在35℃热应激条件下秀丽隐杆线虫生命周期的影响。

图5中显示在35℃热应激条件下，与1/1000DMSO溶剂对照组相比，DNLA各浓度给药组线虫生存曲线明显右移。

实施例三：金钗石斛生物总碱对半乳糖所致衰老小鼠模型的影响

本实验通过观察金钗石斛生物总碱对金钗石斛生物总碱的防治作用，并探索其作用机制，从而为金钗石斛生物总碱用于抗衰老的开发研究提供基础药理学依据。

一、材料和方法

1.实验材料

1.1实验仪器：721型紫外-可见分光光度计：上海申化仪表自控公司；BI2000Morris水迷宫：成都泰盟科技有限公司；DT-6小鼠跳台测试仪：成都泰盟科技有限公司；BA-6小鼠避暗测试仪：成都泰盟科技有限公司；-80℃低温冰柜：德国Forma Scientic公司；Milli QA纯水处理器：Millipore公司；3K30型高速冷冻离心机：德国Sigma公司；高压消毒锅：TOMY公司；电子分析天平：北京赛多利斯电子天平有限公司；SHHW电热恒温三用水浴锅：北京永光明 医疗仪器厂；Leica光学显微镜：德国Leica Microsystems Ltd；Model 550型酶标仪：美国BIO-Tek公司。

1.2试剂和药品

金钗石斛生物总碱：由贵州省基础药理重点实验室提取(含量为78.8％)；超微量ATP酶(Na⁺K⁺)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20080312)；谷胱甘肽-过氧化物酶测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20080311；丙二醛(MDA)测试盒：南京建成生物工程研究所，批号：20080430；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒：南京建成生物工程研究所，批号：20080310；双缩尿测蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20080315；p21免疫组化抗体：武汉博士德有限公司；羊抗兔二抗试剂盒：武汉博士德有限公司；DAB显色剂：武汉博士德有限公司。

1.3实验动物

雄性昆明种小鼠，清洁级，体重20-22g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，许可证号：0002429。饲养环境安静，室温22-23℃，光照/暗时间为12/12h循环，各组实验小鼠自由进食、饮水。

2.实验方法

2.1实验分组

小鼠分笼饲养，自由进食饮水。在实验环境下给予适应性喂养1周后，随机分为5组，每组15只。分组及处理方法为：

(1)空白组(Control group,C):每日注射等量生理盐水一次，灌胃生理盐水一次。

(2)模型组(Model group,M):每日颈背部皮下注射D-半乳糖(120mg/kg)一次，灌胃生理盐水一次。

(3)金钗石斛生物总碱低剂量组(Low dose Dendrobium nobile polyose group,LDNP):每日颈背部皮下注射D-半乳糖(120mg/kg)一次，灌胃80mg/kg。

(4)金钗石斛生物总碱中剂量组(Middle dose Dendrobium nobile polyosegroup,MDNP):每日颈背部皮下注射D-半乳糖(120mg/kg)一次，灌胃160mg/kg。

(5)金钗石斛生物总碱高剂量组(High dose Dendrobium nobile polyosegroup，HDNP):每日颈背部皮下注射D-半乳糖(120mg/kg)一次，灌胃320mg/kg。

2.2Morris水迷宫

2.2.1Morris水迷宫实验

小鼠空间辨别学习记忆是检测空间定向、反映时间、视知觉和结构应用等能力，从而评价其认知水平的一种行为模式，是一类关于场景和事件的学习记忆。常用于检测空间辨别学 习记忆能力的装置有Morris水迷宫、多向选择迷宫、放射臂迷宫、循环平台等。Morris水迷宫是英国心理学家GM.Morris于1981年发明并用于学习记忆的研究中，基本原理是动物利用空间信息的辨别能力对其认知行为做出评价。

2.2.2水迷宫的组成

水迷宫由圆形水池、安全岛和记录系统三部分组成。圆形水池根据原Morris水迷宫设计的基础加以改进而成。水池直径80cm，高38cm，水深30cm，水温26±1℃，用牛奶使池水浑浊。池壁标记四个入水点，将水池分为四个均等的象限，任选一象限中点放置安全岛。安全岛(即平台)直径12cm，高28cm，没于水下1cm。记录系统为成都泰盟公司提供的BI2000系统中的行为学检测模块。

2.2.3检测方法

检测前一天，将小鼠置于无安全岛的水池中游泳2min，使其无法逃脱水难。训练时将小鼠置于放置安全岛的池中游泳并用BI2000图像处理系统中的行为学模块自动记录游泳时间。每次实验安全岛固定在同一位置，入水点可以更改。检测小鼠找到安全岛的时间(逃避潜伏期)。用药后成绩测试，于制模给药60天进行，实验共六天。具体方法如下：定位航行实验，每天上下午各测试一次，检测小鼠找到安全岛的时间，取最后三天的成绩比较。

2.3跳台

2.3.1跳台装置

跳台装置设计为40cm×10cm×10cm被动回避反应箱，四周用黑色塑料板分隔，箱底为可通电的铜栅，反应箱的右前角置一直径和高为10cm的绝缘的橡皮垫，作为小鼠回避电击的安全台，由一调节器调节电压提供交流电。

2.3.2检测方法

最后一天灌胃和注射D-半乳糖2h后，进行学习与记忆训练实验，次日测定记忆成绩。实验时将小鼠放入此装置中适应5min后，轻放于平台上，当小鼠从跳台上跳下四肢接触铜栅时，即给予36V交流电刺激，其受电击后正常反应是跳到安全台上躲避电击，记录其跳至安全台上的潜伏期，以此作为学习成绩。24h后进行测试，将小鼠放至平台上，记录其第一次跳下受电击的时间(潜伏期)作为记忆保持功能评价的指标。

2.4暗室

2.4.1实验装置

实验装置为为30cm×10cm×11cm被动回避式条件反射箱，分明暗两室，暗室底部有铜栅，通36V电流，明暗两室之间有一直径为3cm的洞口。

2.4.2检测方法

实验前将小鼠放入此装置中适应5min，实验时将小鼠头部背着洞口放入明室，其一进入暗室即受到电击，为错误反应。记录5min内小鼠进入暗室的潜伏期，以此作为学习成绩。24h后进行测验，记录5min内小鼠进入暗室的潜伏期，以此作为记忆保持功能评价的指标。

2.5小鼠胸腺和脾脏湿重指数的测定

小鼠处死前称重，处死后分别取出胸腺和脾脏，称重，胸腺(或脾脏)指数＝胸腺(或脾脏)重(mg)/小鼠体重(g)。

2.6血浆中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

2.6.1丙二醛(MDA)含量的测定

原理：MDA可与硫代巴比妥酸结合，形成红色产物。此红色产物在532nm处有最大吸收峰。

计算公式：

MDA(nmol/ml)＝(测定管OD值－测定空白管OD值)/(标准管OD值－标准空白管OD值)×标准品浓度(10nmol/ml)×样本测试前稀释倍数。

2.6.2超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

原理：超氧化物歧化酶对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，而亚硝酸盐在显色剂作用下呈现紫红色，可测定吸光度求出其活力。

计算公式：

SOD(U/mgprot)＝(对照管OD值－测定管OD值)/对照管OD值/50％×反应液总体积/取液量(ml)×样品本测试前的稀释倍数。

2.7肝脏及脑组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、超微量ATPase(Na⁺K⁺)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定。

实验结束后，处死小鼠，取脑和肝组织，称重，按1:10(每克组织中加10ml冷生理盐水)加生理盐水，用超声粉碎机匀浆组织(5s/次，间隔10s，共5次，匀浆过程始终处于冰水中)，组织匀浆分成数份，-80℃保存。

2.7.1脑组织、肝组织蛋白含量测定

原理：凡分子中含有两个氨基甲酰基的化合物都能与碱性酮溶液作，形成紫色复合物，这一反应称为双缩尿反应，蛋白质分子中有许多肽键都能起此反应，各种蛋白显色程度基本相同。

计算公式：

蛋白含量(mg/ml)＝(测定管OD-空白管OD)/(标准管OD-空白管OD)×蛋白标准浓度(mg/ml)。

2.7.2脑组织、肝组织丙二醛含量的测定

原理：MDA可与硫代巴比妥酸结合，形成红色产物。此红色产物在532nm处有最大吸收峰。

计算公式：

MDA(nmol/mgprot)＝(测定管OD值－测定空白管OD值)/(标准管OD值－标准空白管OD值)×标准管溶度(nmol/ml)/样品蛋白含量(mg/ml)。

2.7.3脑组织、肝组织超氧化物歧化酶活性的测定

原理：超氧化物歧化酶对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，而亚硝酸盐在显色剂作用下呈现紫红色，可测定吸光度求出其活力。

计算公式：

SOD(U/mgprot)＝(对照管OD值－测定管OD值)/对照管OD值/50％×反应液总体积/取液量(ml)/样品蛋白含量(mg/ml)。

2.7.4脑组织、肝组织超微量ATP酶(Na⁺K⁺)的测定

原理：ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。

计算公式：

组织中ATPase活力(U/mgprot)＝(测定管OD-对照管OD)/(标准管OD-空白管OD)×标准管浓度(0.02μmol/ml)×6×7.8/匀浆蛋白含量。

2.7.5脑组织、肝组织谷胱甘肽-过氧化物酶含量的测定

原理：谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成水及氧化型谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。

计算公式：

组织GSH-Px酶活力＝(非酶管OD-酶管OD)/(标准管OD-空白管OD)×标准管浓度(20μmol/L)×稀释倍数/反应时间/(取样量×样本蛋白含量)。

2.8胸腺、脾脏、皮肤组织的病理标本制备

处死小鼠，取出胸腺、脾脏和皮肤组织。将其放入10％中性福尔马林溶液中固定24h，然后用流水冲洗24h，各级酒精逐级脱水和二甲苯透明。常规石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,H.E.)染色。

2.8.1免疫组化法检测小鼠肾组织p21的表达

取肾组织，甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋后，做病理切片，免疫组化染色。p21蛋白染色需用枸橼酸盐缓冲液微波加热修复抗原10min，p21抗体稀释1:50，最后显色，苏木素复染，用PBS液取代一抗作阴性对照。

3数据的统计分析

实验数据用SPSS13.0统计软件统计，所有数据以(Mean±SE)表示，多组间比较采用ONE-WAY ANOVA处理，方差齐使用LSD法，方差不齐使用Dunnett’T₃法，P<0.05认为有差异，P<0.01认为有显著性差异。

二、结果

1.行为学指标检测

1.1D-半乳糖诱导衰老小鼠的学习记忆损害模型及石斛多糖对其的影响

水迷宫实验表明，D-半乳糖诱导小鼠衰老模型60天，模型组与空白组比较，前者在定位航行实验中逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。

石斛生物总碱灌胃60天，与模型组比较，定位航行实验中逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。且随着用药剂量的增加，逃避潜伏期缩短呈剂量依赖性。(见下表)

表3石斛生物总碱对D-半乳糖诱导的学习记忆缺陷小鼠水迷宫逃避潜伏期的影响(Mean±SE)

^#P<0.05,VS control group；*P<0.05VS model group

1.2跳台实验

跳台实验表明，D-半乳糖制模60天，在记忆能力测试中，与空白组比较，模型组小鼠跳下跳台的潜伏期明显缩短(P<0.05)，石斛多糖灌胃60天能延长小鼠潜伏期(P<0.05)，且随着用药剂量的增加对改善模型小鼠记忆能力呈剂量依赖性(P<0.05)。(见表)

表4跳台实验检测石斛生物总碱对D-半乳糖诱导的学习记忆缺陷小鼠潜伏期的影响(Mean±SE)

^#P<0.05,VS control group；*P<0.05VS model group

1.3暗室实验

暗室实验表明，D-半乳糖制模60天后，在记忆能力测试中，与空白组比较，模型组小鼠进入暗室的潜伏期明显缩短(P<0.05)，石斛多糖灌胃60天，与模型组比较，其能延长小鼠潜伏期(P<0.05)，且随着用药剂量的增加对改善模型小鼠记忆能力呈剂量依赖性(P<0.05)。(见下表)

表5暗室实验检测石斛生物总碱对D-半乳糖诱导的学习记忆缺陷小鼠潜伏期的影响(Mean±SE)

^#P<0.05,VS control group；*P<0.05VS model group

2.石斛生物总碱对D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型胸腺和脾脏指数的影响

D-半乳糖制模60天后，与空白组比较，模型组小鼠的胸腺和脾脏湿重指数显著增高(P<0.05)。与模型组比较，石斛生物总碱能够显著降低模型组小鼠胸腺和脾脏湿重指数(P<0.05)。(见下表)

表6金钗石斛生物总碱对D-半乳糖诱导的衰老小鼠胸腺和脾脏指数的影响(Mean±SE)

^#P<0.05,VS control group；*P<0.05VS model group；**P<0.01VS model group

3.石斛生物总碱对小鼠血浆、肝脏及脑组织中MDA含量、SOD、GSH-Px以及Na⁺-K⁺-ATP酶活性的测定

模型组小鼠血浆、肝脏及脑组织中MDA含量明显升高，SOD、GSH-Px及Na⁺-K⁺-ATP酶活性均明显下降。石斛生物总碱能降低血浆、肝脏及脑组织中MDA含量和增加SOD、GSH-Px及Na⁺-K⁺-ATP酶活性。(表7.1-7.3)

表7生化指标(Mean±SE)

^#P<0.05,VS control group；*P<0.05VS model group；**P<0.01VS model group

5.2金钗石斛生物总碱对D-半乳糖诱导的衰老小鼠肝脏组织中SOD、MDA、GSH-Px、Na⁺-K⁺-ATP酶的影响(Mean±SE)

^#P<0.05,VS control group；*P<0.05VS model group；**P<0.01VS model group

5.3金钗石斛生物总碱对D-半乳糖诱导的衰老小鼠脑组织中SOD、MDA、GSH-Px、Na⁺-K⁺-ATP的影响(Mean±SE)

^#P<0.05,VS control group；*P<0.05VS model group；**P<0.01VS model group

4.胸腺、皮肤的病理形态学变化

胸腺、皮肤组织HE染色结果显示，空白组小鼠胸腺、皮肤组织的结构及形态均正常，而D-半乳糖有诱导的衰老小鼠皮/髓比例变小，皮质变薄，髓质区扩大。皮髓交界模糊，皮质区淋巴减少，排列分散，上皮细胞相对增多；皮肤表皮及真皮萎缩变薄，表皮突消失，胶原纤维断裂，分布不均匀，皮下结构疏松。高剂量金钗石斛生物总碱均可明显减弱D-半乳糖所致衰老小鼠免疫器官和组织的萎缩及病变。实验结果见附图6、7。

5.金钗石斛生物总碱对各组小鼠肾组织的p21表达情况的影响

免疫组化染色，光镜下可见p21蛋白主要定位于细胞质中，呈粗大的棕黄色颗粒状，部分细胞核质同时p21蛋白染色阳性。以上各组p21的免疫组化染色表明：模型组p21高表 达，空白组p21表达呈阴性，石斛多糖组与模型组相比，p21表达均降低，见附图8。

三、结论

1.金钗石斛生物总碱对D-半乳糖诱导的衰老小鼠学习记忆减退有保护作用。

2.金钗石斛生物总碱能够有效降低衰老小鼠血浆中的MDA含量，提高SOD的酶活性；降低肝脏和脑组织中的MDA含量，提高SOD、GSH-Px以及Na⁺-K⁺-ATP酶的活性。

3.金钗石斛生物总碱可以改善衰老小鼠免疫器官和组织的病理变化。

4.金钗石斛生物总碱可以降低衰老小鼠肾脏组织中p21的表达。

实施例四：金钗石斛生物总碱对SAMP8小鼠脑衰老的保护作用及机制研究

1材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1实验动物

SPF级雄性SAMR1小鼠(许可证号为：SCXK(京)2011-0012)，购于北京大学医学部。SPF级雄性SAMP8小鼠(许可证号为：SCXK(京)2014-0004)，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。自由饮食，光照每12h明暗交替，相对湿度45-55％，室温21-25℃。

1.1.2主要实验试剂

表8主要实验试剂

1.1.3主要仪器

表9主要实验仪器

1.1.4主要溶液配置

1)4％多聚甲醛溶液：称取4g多聚甲醛加入PBS溶液中，调节pH值为7.4，定容至100mL。

2)PBS溶液：称取NaCl 8.0g，KCl 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.48g，KH₂PO₄ 0.20g，加双蒸水定容至1L。

3)10％AP：10g AP加入100mLH₂O中。

4)30％的蔗糖溶液：30g蔗糖加入100mLddH₂O中溶解。

5)20％Tween20：20mLTween20加ddH₂O至100mL。

6)10×电泳缓冲液：甘氨酸188g、Tris 30.2g、SDS 10g、加ddH₂O 1000mL溶解，临用稀释成1×工作液。

7)10×TBS缓冲液：NaCl 180.06g、Tris 24.23g加ddH₂O 1000mL，混匀溶解，临用稀释成1×工作液。

8)10×电转缓冲液：甘氨酸150.2g、Tris 30.2g、加ddH₂O至1000mL，混匀溶解，临用稀释成1×工作液。

9)1％的甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝0.5g溶于50mL70％的乙醇中，过滤。

1.2实验方法

1.2.1实验分组及给药

6月龄SAMP8小鼠随机分为4组：模型组、石斛生物总碱低剂量组(20mg/kg)、石斛生物总碱高剂量组(40mg/kg)、二甲双胍组(80mg/kg)，同月龄SAMR1小鼠作为对照组。每天一次连续灌胃6个月至12月龄，灌胃体积为0.1mL/10g，药物用含1％吐温80的双蒸水(v/v)为溶媒配制，取材前行为学检测小鼠学习记忆和运动功能。

1.2.2行为学检测

1)Morris水迷宫

Morris水迷宫是由直径为1200cm，高为40cm的圆形黑色水盆、红外线摄像追踪系统、计算机及配套软件、直径10cm的黑色平台组成。通过计算机系统将圆形水盆分为四个象限并任选一个象限作为目标象限，将安全平台放入目标象限，加水至超过平台1-2cm，水温21-23℃。实验时将小鼠面向盆壁分别从非平台的任一象限入水，记录小鼠找到平台的时间，即为逃避潜伏期(s)，若60s内未能找到，则逃避潜伏期为60s，并引导至平台停留20s，连续进行5天训练，最后一天撤去平台进行空间探索实验。

2)Y迷宫

Y迷宫由三个相同的臂(40cm×8cm×15cm)、红外线摄像追踪系统、计算机及配套软件组成，每个臂之间的夹角为120°，将Y迷宫置于安静的房间，小鼠面朝中心放置在一个臂的末端，每只小鼠自由探索10min。在一系列探索中，小鼠身体完全进入臂内记为一次标准的进入，动物一次进入3个不同的臂内定义为一次成功的探索。交替正确率(％)＝正确选择次数/(总穿臂次数－2)×100％。

3)新物体识别

新物体识别是由2个大小相同的反应箱(40cm×40cm×40cm)、红外线摄像追踪系统、计算机及配套软件组成，物体A(5cm×5cm×5cm)为绿色正方体，物体B(5cm×5cm×5cm)为棕色圆柱体。将两个反应箱置于安静的房间，第一天两个相同的A物体分别放在2个反应箱的相同角落，小鼠置于反应箱中自由活动10min。第二天，将其中一个A物体换为B物体，自由活动10min，记录小鼠自由接触两个物体的时间。

4)旷场

旷场是由4个大小相同的反应箱(40cm×40cm×40cm)、红外线摄像追踪系统、计算机及配套软件组成，将4个反应箱置于安静的房间，通过计算机系统将反应箱分为中间区域和外周区域，摄像头同时追踪4只小鼠分别在各个反应箱内的自由活动情况，活动时间为10min，记录小鼠在两个区域活动的路程。

5)转棒

转棒实验检测小鼠的运动功能。转棒仪有6个标准通道，可同时容纳6只小鼠同时进行实验，采用红外技术检测小鼠是否落棒，可定时及自由调节转速。实验时，每只小鼠以5rpm/min的转速开始，每隔1min加5rpm即第二分钟转速为10rpm/min，以此类推，记录小鼠从转棒上掉下的时间(s)作为潜伏期，若运动时间大于5min则以5min(300s)记。小鼠进行3天的训练，每天2次，以第三天2次的测试结果计算平均值进行统计。

1.2.3取材及标本制备

行为学检测结束后，每组取3只小鼠眼眶取血后脱臼处死，开胸暴露心脏，用预冷的4％ 多聚甲醛和0.1M PBS液通过透心灌注直至小鼠四肢及脑组织僵硬后取大脑，放入4％的多聚甲醛溶液中，固定48小时，脱水，石蜡包埋，石蜡组织块连续切片，切片厚为5μm，用于H&E染色和尼氏染色。其余小鼠同样眼眶采血并脱臼处死，剥离大脑海马和皮质放入EP管中，﹣80℃保存备用。剥离海马和皮质后的其他部分脑组织放入4％多聚甲醛溶液中，固定48h后，30％的蔗糖溶液脱水48h，冰冻切片，切片厚20μm，用于β-半乳糖苷酶染色。

1.2.4组织形态学检测

1.2.4.1脑组织β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)

1)脑组织样本冰冻固定在冰冻切片机上，连续切片，每组准备6片，厚度为20μm，放入PBS缓冲液中4℃保存；

2)实验时取出切片贴附于防脱玻片上，将切片置于室温下，加预冷的GENMED清理液(Reagent A)，清理液铺满整个切片表面；

3)移除切片上的GENMED清理液(Reagent A)；

4)滴加预冷的GENMED固着液(Reagent B)，使固着液铺满整个切片表面；

5)室温下孵育10min；

6)移除切片上的GENMED固定液(Reagent B)；

7)滴加GENMED酸性液(Reagent C)，使酸性液铺满整个切片表面；

8)室温下孵育5min；

9)移除切片上的GENMED酸性液(Reagent C)；

10)重复实验步骤7至9两次；

11)滴加预热的GENMED染色工作液，使工作液铺满整个切片表面。染色工作液按(GENMED染色液(Reagent E)：GENMD稀释液(Reagent D)＝1:19配置，置于37℃恒温水槽里预热；

12)在37℃湿润培养箱中孵育(不超过24h)，直至组织切片呈现蓝色；

13)移除切片上的GENMED染色工作液；

14)滴加GENMED清理液(Reagent A)，使清理液铺满整个切片表面；

15)移除切片上的GENMED清理液(Reagent A)；

16)晾干，封片；

17)在光学显微镜下观察，拍照并保存，每张切片选择400倍下3个不同视野拍摄，衰老特异性β-半乳糖苷酶活性的表达呈蓝色，计数蓝色颗粒数并取平均值。

1.2.4.2H&E染色

1)5.0μm厚的石蜡切片，60℃烤片40min

2)脱蜡：10min二甲苯(Ⅰ)，10min二甲苯(Ⅱ)，5min无水乙醇，5min 95％乙醇，5min80％乙醇，水洗10min；

3)苏木素染色15min，水洗1min；

4)盐酸乙醇分化3s；

5)自来水冲洗10min；

6)伊红染色2min，水洗10min；

7)常规脱水：80％乙醇数秒，95％乙醇30s，无水乙醇(Ⅰ)1min，无水乙醇(Ⅱ)1min；

8)晾干，稀释的中性树胶液封片，光学显微镜观察脑组织海马CA1区和皮质并拍照保存。

1.2.4.3尼氏染色

1)5.0μm厚的石蜡切片，60℃烤片40min；

2)脱蜡：二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min，水洗10min；

3)染色：甲苯胺蓝溶液滴加在切片上，60℃孵育15min，水冲洗5min；

4)乙醇梯度脱水→晾干→封片→光学显微镜下观察海马CA1区和皮质神经元情况，每张切片选择400倍下3个不同视野拍摄，计数完整细胞结构数并取平均值。

1.2.5Western blot检测

1.2.5.1胶的配制

表10分离胶和浓缩胶配制(单位：mL)

Western blot分析方法采用前期课题组的方法。每组取4只小鼠的海马和皮质组织通过RIPA裂解液裂解后12000rpm离心15min，取上清液BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，上样蛋白量根据样品浓度将上样量定为每孔30ug·10ul。8％SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)，70V约1h左右后，加压至110V，待溴酚蓝至下层胶底线时停止；电转(30min，25v，1.0A)，TBST洗膜，3×10min；5％的脱脂牛奶室温封闭2h，TBST洗膜，3×10min；一抗过夜(Aβ_1-42 1:1000、APP 1:1000、PS1 1:1000、BACE1 1:1000、LC3B 1:1000、P62 1:1000、Beclin1 1:1000、NEP 1:1000、Klotho 1:1000、IDE 1:1000、GAPDH 1：2000)，4℃，16h，TBST洗膜，3×10min；二抗室温反应1h，TBST洗膜，3×10min；BIO-RAD凝胶成像系统成像，采用ECL法显色，曝光保存，结果用Quantity One软件分析。

1.3统计学方法

实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果采用均数±标准差的形式表示，水迷宫结果用重复测量数据的方式分析，其他结果均用单因素方差分析(ANOVA)，方差齐采用LSD法，方差不齐用Dunnett’T3法，P﹤0.05认为有统计学差异。

2结果

2.1石斛生物总碱对SAMP8小鼠学习记忆的影响

2.1.1Morris水迷宫

Morris水迷宫检测SAMP8小鼠学习记忆功能。实验结果显示，与SAMR1相比，定向航行SAMP8小鼠的逃避潜伏期有所延长(P<0.05)，空间探索中原平台象限停留时间缩短(P<0.05)，石斛生物总碱及二甲双胍给药后，SAMP8小鼠逃避潜伏期缩短，原平台象限停留时间延长(P<0.05)。提示石斛生物总碱能改善SAMP8小鼠的学习记忆功能。

图9为石斛生物总碱对SAMP8小鼠Morris水迷宫学习记忆功能的影响.A.逃避潜伏期，B.原平台象限停留时间，与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比， ^#P﹤0.05。

2.1.2Y迷宫和新物体识别

Y迷宫的自发探索交替行为检测小鼠短期的空间学习记忆，如图，SAMP8小鼠的自发探索交替行为正确率明显降低(P<0.05)，石斛生物总碱及二甲双胍给药后，SAMP8小鼠自发探索交替行为正确率明显提高(P<0.05)，提示在Y迷宫实验中石斛生物总碱可以改善SAMP8小鼠的空间学习记忆功能。

新物体识别实验用于评价小鼠非空间学习记忆减退。如图，与SAMR1相比，SAMP8小鼠对新物体探索的时间占总时间的百分比有所下降但无差异(P>0.05)，石斛生物总碱及二甲双胍给药后小鼠对新物体探索的时间占总时间的百分比有所增加但没有明显的改善作用(P>0.05)，提示石斛生物总碱不能改善SAMP8小鼠对新物体的目标识别学习记忆障碍。

图10为石斛生物总碱对SAMP8小鼠学习记忆障碍的影响.A.Y迷宫自发探索行为，B.新物体识别中新物体探索时间占总时间的百分比，与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比，^#P﹤0.05。

2.2石斛生物总碱对SAMP8小鼠运动功能的影响

2.2.1转棒和旷场实验

转棒实验是评价小鼠运动平衡能力的自动化方法。如图所示，SAMP8组与SAMR1组相比，潜伏期即从旋转杆上脱落的时间明显缩短(P<0.05)，石斛生物总碱及二甲双胍给药后潜伏期显著延长(P<0.05)，结果表明，石斛生物总碱可以减轻SAMP8小鼠的运动功能障碍。

旷场实验主要评价以情感行为为主的运动能力，小鼠自主活动的总路径能体现小鼠运动情况。如图所示，中央区域和外周区域运动的总路程SAMP8组较SAMR1组明显缩短(P<0.05)，但石斛生物总碱及二甲双胍给药后无明显增加(P>0.05)，提示石斛生物总碱不能改善以情感行为为主的运动缺陷。

图11为石斛生物总碱对SAMP8小鼠运动功能的影响.A.转棒潜伏期，B.旷场中央区域和外周区域总路程，与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比，^#P﹤0.05。

2.3石斛生物总碱对SAMP8小鼠脑组织湿重比的影响

衰老的脑组织萎缩，如图所示脑组织湿重比结果显示，SAMP8小鼠脑组织湿重比较SAMR1小鼠明显降低(P<0.05)，石斛生物总碱40mg/kg组和二甲双胍给药组较SAMP8组脑组织湿重比显著升高(P<0.05)，提示石斛生物总碱能改善SAMP8小鼠的脑萎缩。

图12为石斛生物总碱对SAMP8小鼠脑组织湿重比的影响.与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比，^#P﹤0.05。

2.4石斛生物总碱对SAMP8小鼠组织形态学的影响

2.4.1石斛生物总碱对SAMP8小鼠脑组织β-半乳糖苷酶的影响

β-半乳糖苷酶染色反应衰老情况，SAMP8小鼠脑内β-半乳糖苷酶染色的阳性表达明显增加(P<0.05)，石斛生物总碱及二甲双胍给药后β-半乳糖苷酶染色的阳性表达逐渐减少(P<0.05)，如图，提示石斛生物总碱可减少SAMP8小鼠脑组织衰老细胞。

图13为石斛生物总碱对SAMP8小鼠β-半乳糖苷酶的影响.A.β-半乳糖苷酶染色情况，B.衰老细胞统计。(标尺＝50μm)与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比， ^#P﹤0.05。

2.4.2石斛生物总碱对SAMP8小鼠神经元的影响

H&E染色观察SAMP8小鼠海马和皮质组织形态学变化。结果显示，SAMP8小鼠海马CA1区和皮质椎体细胞层结构紊乱，神经元染色异常，核固缩，石斛生物总碱及二甲双胍给药后异常的神经元细胞减少，如图，提示石斛生物总碱能减轻SAMP8小鼠神经元损伤。

图14为石斛生物总碱对SAMP8小鼠的海马和皮质神经元的影响.(标尺＝50μm).

2.4.3石斛生物总碱对SAMP8小鼠神经元数量的影响

尼氏体是神经元的一种特征结构，尼氏体的数量反应神经元的状态，SAMP8小鼠海马CA1区神经细胞排列疏松，存活的神经元细胞数量减少(P<0.05,P<0.05)，石斛生物总碱及二 甲双胍给药后椎体细胞排列整齐，正常神经元细胞存活数量增加(P<0.05,P<0.05)，如图，提示石斛生物总碱对衰老引起的神经损伤有保护作用。

图15为石斛生物总碱对SAMP8小鼠神经元的影响.A.海马CA1区尼氏染色情况(标尺＝50μm)，B.海马CA1区神经元数量，C.皮质尼氏染色情况(标尺＝50μm)，D.皮质神经元数量，与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比，^#P﹤0.05。

2.5DLNA对Klotho蛋白表达的影响

Western blot检测SAMP8小鼠海马和皮质中Klotho蛋白表达。如图所示，与SAMR1相比，SAMP8小鼠海马和皮质中Klotho蛋白水平显著降低(P<0.05)，给予石斛生物总碱及二甲双胍后增加海马和皮质中的蛋白表达(P<0.05)。结果提示石斛生物总碱能够上调Klotho蛋白表达,提示石斛生物总碱具有延缓衰老作用。

图16为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质Klotho蛋白水平的影响.A.海马Klotho蛋白代表性条带，B.皮质Klotho蛋白代表性条带，C.海马Klotho蛋白相对表达量，D.皮质Klotho蛋白相对表达量，与SAMR1组相比，^*P﹤0.05；与SAMP8组相比， ^#P﹤0.05。

2.6石斛生物总碱对Aβ代谢途径相关蛋白的影响

2.6.1石斛生物总碱对Aβ_1-42、APP蛋白水平的影响

Western blot检测SAMP8小鼠海马和皮质中Aβ_1-42和APP蛋白表达。如图所示，SAMP8组较SAMR1组小鼠海马和皮质中Aβ_1-42(P<0.05,P<0.05)和APP(P<0.05,P<0.05)蛋白水平显著增加，给予石斛生物总碱及二甲双胍后降低了海马和皮质中Aβ_1-42(P<0.05,P<0.05)和APP(P<0.05,P<0.05)蛋白表达。提示石斛生物总碱可抑制SAMP8小鼠海马和皮质中Aβ_1-42和APP的蛋白表达。

图17为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质Aβ_1-42和APP蛋白水平的影响.A.海马Aβ_1-42和APP蛋白的代表性条带，B.皮质Aβ_1-42和APP蛋白的代表性条带，C.海马Aβ_1-42蛋白的相对表达量，D.皮质Aβ_1-42蛋白的相对表达量，E.海马APP蛋白的相对表达量，F.皮质APP蛋白的相对表达量，与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比，^#P﹤0.05。

2.6.2石斛生物总碱对BACE1、PS1蛋白水平的影响

Western blot检测SAMP8小鼠海马和皮质中BACE1和PS1蛋白表达。如图，BACE1(P<0.05,P<0.05)和PS1(P<0.05,P<0.05)在SAMP8小鼠海马和皮质中蛋白水平比SAMR1显著增加，给予石斛生物总碱及二甲双胍后降低了海马和皮质中BACE1(P<0.05,P<0.05)和PS1(P<0.05,P<0.05)的蛋白表达。提示石斛生物总碱可下调SAMP8小鼠海马和皮质中BACE1和PS1蛋白水平。

图18石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质BACE1和PS1蛋白水平的影响.A.海马BACE1和PS1蛋白代表性条带，B.皮质BACE1和PS1蛋白代表性条带，C.海马BACE1蛋白相对表达量，D.皮质BACE1蛋白相对表达量，E.海马PS1蛋白的相对表达量，F.皮质PS1蛋白的相对表达量。与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比，^#P﹤0.05。

2.6.3DLNA对Aβ降解酶的影响

Western blot检测SAMP8小鼠海马和皮质中IDE和NEP蛋白表达。IDE(P<0.05,P<0.05)和NEP(P<0.05,P<0.05)在SAMP8小鼠海马和皮质中蛋白水平均比SAMR1显著降低，给予石斛生物总碱及二甲双胍后海马和皮质中IDE(P<0.05,P<0.05)和NEP(P<0.05,P<0.05)的蛋白表达增加。提示石斛生物总碱可以提高Aβ降解酶活性。

图19为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质IDE和NEP蛋白水平的影响。A.海马IDE和NEP蛋白代表性条带，B.皮质IDE和NEP蛋白代表性条带，C.海马IDE蛋白相对表达量，D.皮质IDE蛋白相对表达量，E.海马NEP蛋白相对表达量，F.皮质NEP蛋白相对表达量，与SAMR1组相比，^*P﹤0.05；与SAMP8组相比，^#P﹤0.05。

2.7石斛生物总碱对自噬相关蛋白的影响

2.7.1DNAL对LC3B、Beclin1和P62蛋白水平的影响。

Western blot检测SAMP8小鼠海马和皮质中LC3B、Beclin1和P62蛋白表达。如图，LC3B(P<0.05,P<0.05)、Beclin1(P<0.05,P<0.05)在SAMP8小鼠海马和皮质中蛋白水平较SAMR1显著降低，石斛生物总碱40mg/kg和二甲双胍组增加海马和皮质中LC3B蛋白表达，给予石斛生物总碱及二甲双胍后Beclin1在海马和皮质中蛋白表达增加(P<0.05,P<0.05)；在SAMP8小鼠海马和皮质中P62蛋白水平比SAMR1显著增加(P<0.05,P<0.05)，给予石斛生物总碱及二甲双胍后降低了海马和皮质中P62蛋白表达(P<0.05,P<0.05)。以上结果表明，石斛生物总碱可上调LC3B和Beclin1蛋白水平,下调P62蛋白水平，这与文献报道诱导自噬活性的情况一致。

图20为石斛生物总碱对SAMP8小鼠海马和皮质LC3B、Beclin1和P62蛋白水平的影响。A.海马LC3B、Beclin1和P62蛋白代表性条带，B.皮质LC3B、Beclin1和P62蛋白代表性条带，C.海马LC3B蛋白相对表达量，D.皮质LC3B蛋白相对表达量，E.海马Beclin1蛋白相对表达量，F.皮质Beclin1蛋白相对表达量，G.海马P62蛋白相对表达量，H.皮质P62蛋白相对表达量，与SAMR1相比，^*P﹤0.05；与SAMP8相比，^#P﹤0.05。

3、结论

石斛生物总碱可以改善SAMP8小鼠的学习记忆减退，增强运动耐量，减弱SAMP8小鼠脑萎缩情况，减少神经元丢失，实验结果与目前广泛推崇的抗衰老药二甲双胍相似，提示石斛生物总碱亦具有抗衰老作用，其作用机制与上调抗衰老蛋白Klotho表达，减少Aβ的聚集和诱导自噬活性有关。

本发明将石斛生物总碱应用在防治衰老药物的药物中，通过一些列的药效实验，充分证明了它防治衰老的疗效。

Claims (5)

1.金钗石斛生物总碱在制备抗衰老药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的金钗石斛生物总碱在制备抗衰老药物中的应用，其特征是：所述金钗石斛选用一年生或二年生。

3.根据权利要求1所述的金钗石斛生物总碱在制备抗衰老药物中的应用，其特征是：所述金钗石斛生物总碱经脂溶性提取和水溶性提取而得。

4.根据权利要求1所述的金钗石斛生物总碱在制备抗衰老药物中的应用，其特征是：所述金钗石斛生物总碱溶剂制剂的浓度为0.35-35μg/ml。

5.根据权利要求1所述的金钗石斛生物总碱在制备抗衰老药物中的应用，其特征是：所述金钗石斛生物总碱的剂量为每天20-360mg/kg。