CN108627589A - 一种用于测定硫酸奈替米星含量的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于测定硫酸奈替米星含量的高效液相色谱分析方法，所述方法包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以添加有庚烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲液(pH2.5)‑乙腈为流动相(77∶23)；溶剂为水；检测波长为205nm；流速为1ml/min；进样体积为20μl。采用本发明方法与抗生素微生物检定法所得结果无显著性差异，液相色谱系统操作简便、分析检测的成本低廉、具有理想的分离效果、专属性强、精密度好、重复性和准确度高，为快速准确测定硫酸奈替米星的含量提供了可靠技术手段。

Description

一种用于测定硫酸奈替米星含量的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种用于测定硫酸奈替米星含量的高效液相色谱分析方法。

背景技术

硫酸奈替米星为半合成的氨基糖苷类抗生素，由西索米星与乙醛和氰基硼氢化钠反应制得。该抗生素对氨基糖苷乙酰转移酶稳定，对产生氨基糖苷乙酰转移酶且耐受其它氨基糖苷类抗生素的菌株特别敏感。硫酸奈替米星是氨基糖苷类药物中肾毒性轻微且较少见的品种，耳毒性较庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星低，临床疗效优于庆大霉素等。因其更具安全性和有效性而成为临床上治疗敏感革兰氏阴性杆菌包括绿脓杆菌所致严重感染的首选药物。

硫酸奈替米星适用于敏感细菌如埃希氏大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌、肠杆菌属菌、奇异变形杆菌、沙雷菌属及金黄色葡萄球菌等所引起的包括婴儿、儿童等各年龄段患者在内的严重或危机生命的细菌感染性疾病的短期治疗。所述感染性疾病包括复杂性泌尿道感染、败血症、皮肤软组织感染、腹腔内感染及下呼吸道感染。

《中国药典》2010年版(Ch.P.2010)和《中国药典》2015年版(Ch.P.2015)所收载的硫酸奈替米星原料药及硫酸奈替米星注射液、新药转正成册标准收载的注射用硫酸奈替米星、欧洲药典9.0(EP.9.0)及JP15收载的硫酸奈替米星原料药含量测定方法均为抗生素微生物检定法。由于该法不能有效区分硫酸奈替米星和其他抗生素，实验过程操作繁琐、专属性差且受多种环境因素影响，测定结果重复性差。根据硫酸奈替米星分子结构特点，美国药典40(USP40)采用高效液相色谱紫外检测法测定其含量。但所用离子对试剂价格昂贵且消耗量大导致分析成本高昂，流动相及溶剂中高浓度的盐严重伤害仪器和色谱柱，影响其使用寿命。结合美国药典40(USP40)方法及离子对作用特点，开发一种成本低廉且性能优越的硫酸奈替米星含量测定用高效液相色谱分析方法，以弥补现有方法的不足。降低生产企业和监管部门的分析成本，不断促进该类药品质量标准的提高，进而不断提高药品质量，进一步保障广大人民群众的用药安全。

发明内容

本发明目的在于提供一种低成本且准确测定硫酸奈替米星含量的高效液相色谱分析方法，满足分析成本低廉、分离性能优越、专属性强及自动化程度高等要求，以弥补现有技术的不足，保障硫酸奈替米星的质量控制。

为达到上述目的，本发明的详实技术方案如下：

一种用于测定硫酸奈替米星含量的高效液相色谱分析方法，采用反相高效液相色谱方法，具体色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，填料粒径为3～5μm，柱长为150mm～300mm。

流动相：以庚烷磺酸钠缓冲液(0.01～0.1mol/L庚烷磺酸钠溶解于0.05～0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液中，磷酸调pH至2.0～3.0)-乙腈为流动相(80∶20～70∶30)。

溶剂：流动相或水。

流速：0.8～1.2ml/min。

柱温：25～40℃。

检测波长：205nm±4nm。

进样量：10～40μl。

优选色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，填料粒径为5μm，柱长250mm，以(0.025mol/L庚烷磺酸钠溶解于0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液中，磷酸调pH至2.5，用0.45μm滤膜滤过)-乙腈(77∶23)，溶剂为水，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为205nm，进样量为20μl。

系统适用性溶液：精取西索米星标准品和奈替米星标准品各约22mg置50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。

对照品溶液：精取奈替米星标准品约22mg置50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。

供试品溶液

制备浓度为0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液。

有益效果

采用本发明所述高效液相色谱分析方法的条件，实现了硫酸奈替米星在色谱柱上的保留，监测并记录到硫酸奈替米星的洗脱色谱曲线。本方法的线性范围宽，为100～1000μg/ml，且线性好(r＝1.0000)；回收率高，平均回收率为99.4％；灵敏度高，检测限及定量限分别为20ng和40ng；重复性良好(n＝6)RSD为0.2％。采用本发明的方法可快速准确测定硫酸奈替米星的含量。

附图说明

图1为USP40方法系统适用性溶液(1.0mg/ml)的典型色谱图

图2为本发明方法系统适用性溶液(1.0mg/ml)的典型色谱图

图3为本发明方法系统适用性溶液(0.5mg/ml)典型色谱图

图4为本发明方法系统适用性溶液(0.25mg/ml)典型色谱图

图5为对照品典型色谱图

图6为溶剂典型色谱图

图7为定量限典型液相色谱图

图8为含量测定方法线性范围

具体实施例

通过如下实施例对本发明作进一步的说明，但实施例并不局限于本发明的保护范围。

主要仪器及色谱条件：

SHIMADZU高效液相色谱仪；配置LC-20AB泵、DGU-20A3R在线脱气机，SIL-20ACHT自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-M20A紫外检测器，工作站。

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

试剂与药品：

庚烷磺酸钠(日本东京化成工业株式会社)，乙腈(色谱级，默克公司)，磷酸(MREDA)，奈替米星标准品(每毫克相当于577单位，中国药品生物制品检定所)，西索米星标准品(每毫克相当于567单位，中国药品生物制品检定所)，硫酸奈替米星(批号：01-05013-151103)，其他试剂为国产分析纯。

实验中用水均为经millipore Q制备的纯化水。

系统适用性溶液：精取奈替米星标准品和西索米星标准品各约22mg，置50ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

对照品溶液：精取奈替米星标准品约22mg置50ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

供试品溶液

精取本品12.5mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即为供试品溶液。

流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：205nm；进样量：20μl；对空白溶剂、对照品和供试品分别进行检测，结果如附图1、2及3。标准品溶液峰面积平均值为2006670.7(n＝6)，RSD为0.1％，供试品溶液峰面积平均值为2035742.0(n＝6)，RSD为0.2％。

根据公式：

硫酸奈替米星含量(％)＝(待测品峰面积/标准品峰面积)*(标准品浓度/待测品浓度)*100％计算含量。按照上述色谱条件进行如下实施例：

实施例1流动相及溶剂考察

系统适用性溶液：精取两份奈替米星标准品和西索米星标准品各约17mg，置10ml容量瓶中，USP40方法采用流动相溶解并稀释至刻度，本发明方法采用用水溶解并稀释至刻度。

USP40含量项下流动相组成为庚烷磺酸钠稀磷酸溶液(20.22g/L的庚烷磺酸钠溶解于0.5％的稀磷酸溶液)∶乙腈＝62∶38。

本发明方法流动相组成为庚烷磺酸钠缓冲液(6g/L庚烷磺酸钠+13.6g/L的磷酸二氢钾，磷酸调pH至2.5)∶乙腈＝77∶23。

USP方法与本发明方法所得系统适用性溶液典型色谱图如图1和2，色谱参数如表1。

表1 不同方法的系统适用性溶液色谱参数

对比表1中分离度、理论塔板数和拖尾因子三个参数，发现本发明方法在分离度和理论塔板数两方面均优于USP40方法。对比附图1和2发现，USP40方法中奈替米星峰严重拖尾，存在包裹后相邻峰现象影响含量测定结果。实施例1结果表明在系统适用性溶液浓度为1mg/ml时，本发明方法测定硫酸奈替米星的含量要优于USP40方法。

实施例2系统适用性溶液浓度考察(图3和4)

配制浓度为0.5mg/ml和0.25mg/ml的系统适用性溶液，分别进样记录色谱图，不同浓度系统适用性溶液色谱参数如表2：

表2 不同浓度的系统适用性溶液色谱参数

根据表2中分离度、理论塔板数和拖尾因子三个参数，确定系统适用性浓度为0.25mg/ml。

实施例3专属性考察(图5和图6)

配制浓度为0.25mg/ml的对照品溶液，分别进样对照品溶液和水并记录色谱图，结果表明本发明方法专属性强。

实施例4进样精密度

同一份标准品溶液进样六次重复试验，峰面积如表3：

表3 标准品溶液6次重复进样的峰面积

进样次数	1	2	3	4	5	6
							峰面积	2007180	2007824	2007728	2007230	2005048	2005014

峰面积平均值为2006670.7，RSD为0.1％，结果表明本方法精密度高。

实施例5线性关系试验(图7)

精密称取21.66mg奈替米星标准品置于25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性标准品溶液A1；精密量A1溶液5ml，置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为线性标准品溶液A2。精密称取34.66mg奈替米星标准品置于20ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性标准品溶液B1，分别精密量取B1溶液2ml，各置于10ml和20ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性标准品溶液B2和B3。按本发明方法进样检测，对标准品溶液浓度(X)与峰面积(Y)进行数据回归分析，线性关系如图4所示，回归方程为Y＝7838562X+24536，r＝1.0000。结果表明依硫酸奈替米星在溶液浓度为100～1000μg/ml范围内，峰面积与溶液浓度呈现良好线性关系。

实施例6检测限及定量限

取线性项下浓度为0.2mg/ml的对照溶液系列稀释后进样检测，按信噪比约为3计算，奈替米星的检测限为20ng，按信噪比约为10计算，奈替米星的定量限为40ng(图8)。

实施例7溶液的稳定性

精密称定奈替米星(批号01-05013-151103)12.5mg，置50ml量瓶中，加水溶解，用水稀释至刻度，作稳定性溶液。在0h、2h、4h、6h、8h、10h时，精密量取稳定性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，各时间点样品含量RSD(n＝6)为0.2％结果表明溶液在10h内稳定性良好。

实施例8回收率试验

精密称定奈替米星(批号01-05013-151103)12.5mg两份，分别置50ml量瓶中，加水溶解，用水稀释至刻度，作含量测定用供试品溶液。取含量测定用供试品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。取奈替米星10mg、12.5mg、15.625mg，分别置50ml量瓶中，分别加入相应处方量的辅料母液，加水溶解，用水稀释至刻度，作提取回收率供试品溶液。取提取回收率供试品溶液，分别精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。平均回收率为98.3％，RSD(n＝9)为0.5％。结果表明本发明方法回收率良好。

实施例9重复性实验

取硫酸奈替米星注射液(批号1605147)6份，按对照品溶液制备方法制样浓度为0.25mg/ml，进样分析。按外标法计算每份供试品的含量，该批样品含量为101.3％(RSD为0.2％)，结果表明本发明方法重复性良好。

实施例10应用本发明方法检测不同生产厂家硫酸奈替米星注射液的含量

采用本发明方法，对10个厂家的53批次硫酸奈替米星注射液进行含量测定。采用SPSS将所测数据与抗生素微生物检定法所得结果进行统计分析，结果显示(P＝0.095)，表明两种方法测定的结果差异不显著。综上所述本发明方法的专属性强、灵敏度高、精密度好、可准确快速测定硫酸奈替米星的含量。

Claims (5)

1.一种用于测定硫酸奈替米星含量的高效液相色谱方法，其特征在于：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以庚烷磺酸钠缓冲液(0.01～0.1mol/L庚烷磺酸钠溶解于0.05～0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液中，磷酸调pH至2.0～3.0)-乙腈为流动相(80∶20～70∶30)，溶剂为流动相或水，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为205nm±4nm，进样量为10～40μl。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：庚烷磺酸钠缓冲液(0.025mol/L庚烷磺酸钠溶解于0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液中，磷酸调pH至2.5)-乙腈(77∶23)为流动相，溶剂为水，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为205nm，进样量为20μl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：系统适用性溶液为西索米星和硫酸奈替米星的等浓度混合溶液，溶液浓度为0.25～1.0mg/ml，对照品和供试品溶液浓度为0.25～1.0mg/ml，系统适用性溶液、对照品溶液及供试品溶液浓度优选0.25mg/ml，按照外标法计算供试品中硫酸奈替米星的含量。

4.如权利要求1所述的方法，系统适用性溶液中西索米星与奈替米星间的分离度不小于3.0，奈替米星与其后相邻峰的分离度不小于1.5，奈替米星峰拖尾因子不大于2.0，奈替米星的进样精密度RSD(n＝6)不大于1.0％。

5.如权利要求1所述的一种用于测定硫酸奈替米星含量的高效液相色谱法，其特征在于此法用于检查硫酸奈替米星原料及其制剂的含量，以及硫酸奈替米星残留量检测。