CN108624575A - 黑芥子酶纯化耦合固定化的方法 - Google Patents

黑芥子酶纯化耦合固定化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，采用刀豆球蛋白结合黑芥子酶的方法，将刀豆球蛋白负载于基材之上，再将黑芥子酶链接在刀豆球蛋白之上，从而达到特异性的将黑芥子酶固定于基材之上，将黑芥子酶的纯化与固定化结合于一体，大大减少了黑芥子酶的纯化难度，提高了固定化效率，通过刀豆球蛋白吸附黑芥子酶表面的糖基吸附黑芥子酶且不吸附ESP蛋白，从而达到减少腈类物质的生成，增加异硫氰酸脂类化合物产量，使得硫代葡萄糖苷转化生成异硫氰酸脂的转化率大大增加。

Description

黑芥子酶纯化耦合固定化的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种黑芥子酶纯化耦合固定化的方法。
背景技术
十字花科的植物是目前广泛认为具有抗癌功能的一类植物。这主要是因为十字花科的植物含有大量的硫代葡萄糖苷(glucosinolates，简称GLS)，硫代葡萄糖苷是植物的一种含硫次级代谢产物，目前在植物中已发现了120多种硫代葡萄糖苷，其基本结构如下式所示。硫代葡萄糖苷是水溶性、无挥发性、热稳定性的离子型化合物。若植物细胞发生破损，硫代葡萄糖水解酶，即芥子硫苷酸酶(myrosinase，thioglucoside glucohydrolase；EC3.2.3.1)被释放出来，并水解硫代葡萄糖苷，生成硫酸氢盐、葡萄糖和一系列葡萄糖苷配基，这些配基在经过分子内的重排形成异硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈和少量的环硫腈。目前，有很多研究已经表明异硫氰酸酯有良好的抗癌效果。同时，异硫氰酸酯还具有防止微生物繁殖和间接的抗氧化作用。
硫代葡萄糖苷在有酶和无酶(如加温、加压)的条件下都会发生降解，有酶时称为硫代葡萄糖苷的酶解，无酶则称为非酶解。硫代葡萄糖苷的非酶解过程非常复杂，主要生成腈类化合物和异硫氰酸盐，反应产物和反应速度均与外界条件有关。中性条件下主要生成异硫氰酸酯；酸性条件产物以腈为主；在有epithiospecifier protein(简称ESP)和亚铁离子存在，降解产物主要是环硫腈。
在西兰花种子中，有90％的硫代葡萄糖苷是葡糖莱菔硫烷(glucophanin，简称GRA)。由于ESP蛋白普遍存在于各个品种的西兰花种子中，因此GRA在西兰花种子自身的酶催化水解后转化莱菔硫烷(sulforaphane，简称SFA)的转化率为10％-40％，转化为莱菔硫烷腈(sulforaphane nitrile，简称SFN)的转化率为50％-80％。SFA能够抑制肺癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌及大肠癌等癌细胞的形成，提高组织谷胱甘肽的水平，诱导细胞合成Ⅱ型解毒酶。但是有很多文献都均报道未发现SFN有任何抗癌活性。同样，在萝卜种子中，绝大多数的硫代葡萄糖苷是萝卜硫苷(glucophenin，简称GRE)。同样由于ESP蛋白的普遍存在，因此GRE在萝卜种子中自身的酶催化水解后转化莱菔素(sulforaphene，简称SFE)的转化率为10％-35％，转化为莱菔素腈(sulforaphene nitrile，简称SFEN)的转化率为40％-70％。目前莱菔硫烷的制备方法主要有化学合成和天然产物提取。化学法采用立体手性合成的方法，实验复杂，反应步骤多，副产物多，毒性大，产率低，原料成本高，分离难等缺点，难以实现大规模生产。天然产物提取方法利用西兰花等十字花科植物中黑芥子酶水解GRA得到SFA，申请号为200510130467.9的中国发明专利申请公开了利用芸苔属蔬菜为原料制备莱菔硫烷的方法，由于西兰花种子中普遍含有ESP蛋白，水解生成大量的SFN，得到的SFA产品少，原料浪费严重。申请号为200910037363.1的中国发明专利申请公开了一种从西兰花芽苗菜中提取多功能莱菔硫烷的方法，该方法需考虑芽苗菜的生长时间，对芽苗菜进行预处理，实验复杂，且同样无法完全解决ESP蛋白的问题，因此产率低，成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提高硫代葡萄糖苷转化到异硫氰酸脂的转化率，减小黑芥子酶的纯化难度，提高固定化效率，降低酶成本。
本发明的实施例提供了一种黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，包括如下步骤：
(1)黑芥子酶的提取：
将未经高温处理的十字花科植物的种子、花、茎、叶粉碎或者基因工程菌超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液；
(2)四氧化三铁纳米球的制备：
使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为0.1:1-10:1，在N2保护下溶解在10-1000ml 0.1-5M的氨水中，5-50℃保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用；
(3)包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球的制备：
取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入10-1000ml乙醇，1-100ml氨水，0.1-10ml TEOS与1-100ml水，反应1-100分钟后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌1-50小时后，加入10-1000ul APTES，反应1-50h后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；
(4)纳米球表面接枝刀豆球蛋白：
按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白，在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS，反应60分钟后加入步骤(3)得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；
(5)纳米球固定化黑芥子酶：
按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:1-1:1000的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；
(6)催化得到异硫氰酸脂类化合物并对其纯化：
用步骤(5)得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至5-7，温度20-50℃，水解硫代葡萄糖苷水溶液0-300分钟，之后离心或者使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，将清液用二氯甲烷或者乙酸乙酯萃取3次，将二氯甲烷相或乙酸乙酯相旋干后进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的的异硫氰酸脂类产品。
进一步地，步骤(1)中所用的粗酶液来源为西兰花、甘蓝、芥蓝、白菜、花椰菜植物的种子、花、茎和叶，或者为基因工程菌表达的黑芥子酶。
进一步地，步骤(4)和步骤(6)中pH值缓冲液为K2HPO4-KH2PO4缓冲液。
进一步地，步骤(6)中使用的硫代葡萄糖苷为脂肪族硫代葡萄糖苷。
进一步地，步骤(6)中，乙酸乙酯或二氯甲烷添加量为原液的0.5至5倍。
与现有技术相比本发明的有益效果是：采用刀豆球蛋白结合黑芥子酶的方法，将刀豆球蛋白负载于基材之上，再将黑芥子酶链接在刀豆球蛋白之上，从而达到特异性的将黑芥子酶固定于基材之上，将黑芥子酶的纯化与固定化结合于一体，大大减少了黑芥子酶的纯化难度，提高了固定化效率，去除了粗酶液中可以促使硫甙葡萄糖苷进行副反应的杂酶，使得硫代葡萄糖苷转化生成异硫氰酸脂的转化率大大增加。
附图说明
图1是黑芥子酶粗酶液电泳图；
图2是四氧化三铁纳米球TEM图；
图3是包裹四氧化三铁的二氧化硅球的TEM图；
图4是包裹四氧化三铁的二氧化硅球的SEM图；
图5是包裹四氧化三铁的二氧化硅球的元素mapping图；
图6是黑芥子酶固定化后的SEM图；
图7是莱菔硫苷的HPLC图；
图8是莱菔硫烷的HPLC图；
图9是磁铁回收黑芥子酶实物图(图中s为秒)。
具体实施方式
下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
GLS广泛存在于十字花科植物中，其可以被黑芥子酶水解，其主要产物为异硫氰酸脂类化合物与腈类化合物，前者为不稳定的中间体通过重排反应生成，后者需要有一种热敏性蛋白ESP催化生成，反应原理如下：
通常的方式是使用凝胶葡聚糖柱与离子交换柱耦合对黑芥子酶进行纯化，得到单一或者复合的黑芥子酶，之后再使用各种方法对黑芥子酶进行固定化，例如环氧树脂等。但是这一过程黑芥子酶酶活损失大，纯化黑芥子酶步骤繁琐，大大增加了成本，基本不存在工业化可能。而且这一步骤对于提高异硫氰酸脂类化合物产量是存在一定程度的多余的，因为在提高异硫氰酸脂类化合物的产量时，只需要在保证黑芥子酶酶活的前提下去除ESP蛋白即可，并不需要拿到纯度很高的黑芥子酶。
本实施例使用刀豆球蛋白吸附黑芥子酶是因为黑芥子酶表面糖基化程度较高，而ESP表面糖基化程度较低，刀豆球蛋白可以通过吸附黑芥子酶表面的糖基吸附黑芥子酶且不吸附ESP蛋白，从而达到减少腈类物质的生成，增加异硫氰酸脂类化合物产量，同时使得黑芥子酶固定在基材之上，完成对黑芥子酶的固定化，使其可以反复使用。
本发明的具体方法和步骤如下：
(1)黑芥子酶的提取
将未经高温处理的十字花科植物的种子、花、茎、叶粉碎或者基因工程菌超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液，如图1；
(2)四氧化三铁纳米球的制备
使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为2:1(也可以是0.1:1-10:1)，在N2保护下溶解在50ml(也可以是10-1000ml)1.5M(也可以是0.1-5)的氨水中，40℃(也可以是5-50℃)保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用。
(3)包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球的制备
取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入200ml(也可以是10-1000ml)乙醇，6.8ml(也可以是1-100ml)氨水，1.5ml(也可以是0.1-10ml)TEOS与10ml(也可以是1-100ml)水，反应20分钟(也可以是1-100分钟)后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌15小时(也可以是1-50小时)后，加入140ul(也可以是10-1000ul)APTES，反应8h(也可以是1-50h)后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用，如图2-5。
(4)纳米球表面接枝刀豆球蛋白
按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白。在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS。反应60分钟后加入上步得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
(5)纳米球固定化黑芥子酶
按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:100的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用，如图6。
(6)催化得到异硫氰酸脂类化合物并对其纯化
用上步(5)得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至5-7，温度20-50℃(如30℃)，水解硫代葡萄糖苷水溶液(如图7)0-300分钟(如60分钟)，之后离心或者使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，如图9，将清液用二氯甲烷或者乙酸乙酯萃取3次，将二氯甲烷相或乙酸乙酯相旋干后进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的的异硫氰酸脂类产品，如图8。
步骤(1)中所用的粗酶液来源是西兰花、甘蓝、芥蓝、白菜、花椰菜等植物的种子、花、茎和叶，或者是基因工程菌表达的黑芥子酶。
步骤(4)和(6)中pH值缓冲液是K2HPO4-KH2PO4缓冲液。
步骤(6)中使用的硫代葡萄糖苷是脂肪族硫代葡萄糖苷。
步骤(4)中连接二氧化硅包裹四氧化三铁球与刀豆球蛋白是通过酯化反应。
步骤(5)中连接二氧化硅包裹四氧化三铁球与提取的黑芥子酶粗酶液中的黑芥子酶是通过刀豆球蛋白。
步骤(1)中制备的黑芥子酶可用于催化脂肪族硫代葡萄糖苷的去糖反应。
实施例1
将未经高温处理的西兰花种子粉碎，超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液；使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为2:1，在N2保护下溶解在50ml 1.5M的氨水中，40℃保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用。
取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入200ml乙醇，6.8ml氨水，1.5ml TEOS与10ml水，反应20分钟后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌15小时后，加入140ul APTES，反应8h后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白。在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS。反应60分钟后加入上步得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:100的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
用上步得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至7，温度30℃，水解莱菔硫苷水溶液60分钟，之后使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，将清液按照1:1比例用二氯甲烷萃取3次，将二氯甲烷相回收后旋干，进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的莱菔硫烷。
用分析型HPLC测定反应底物的纯度为98％(图8)萃取后产物纯度为98％，如图9。
实施例2
将未经高温处理的萝卜种子粉碎，超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液；使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为2:1，在N2保护下溶解在50ml 1.5M的氨水中，40℃保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用。
取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入200ml乙醇，6.8ml氨水，1.5ml TEOS与10ml水，反应20分钟后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌15小时后，加入140ul APTES，反应8h后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白。在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS。反应60分钟后加入上步得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:100的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
用上步得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至7，温度30℃，水解莱菔硫苷水溶液60分钟，之后使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，将清液按照1:1比例用二氯甲烷萃取3次，将二氯甲烷相回收后旋干，进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的莱菔硫烷。
实施例3
将未经高温处理的油菜籽种子粉碎，超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液；使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为2:1，在N2保护下溶解在50ml 1.5M的氨水中，40℃保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用。
取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入200ml乙醇，6.8ml氨水，1.5ml TEOS与10ml水，反应20分钟后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌15小时后，加入140ul APTES，反应8h后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白。在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS。反应60分钟后加入上步得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:100的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
用上步得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至7，温度30℃，水解莱菔硫苷水溶液60分钟，之后使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，将清液按照1:1比例用二氯甲烷萃取3次，将二氯甲烷相回收后旋干，进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的莱菔硫烷。
实施例4
将未经高温处理的萝卜芽苗粉碎，超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液；使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为2:1，在N2保护下溶解在50ml1.5M的氨水中，40℃保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用。
取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入200ml乙醇，6.8ml氨水，1.5ml TEOS与10ml水，反应20分钟后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌15小时后，加入140ul APTES，反应8h后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白。在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS。反应60分钟后加入上步得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:100的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
用上步得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至7，温度30℃，水解莱菔硫苷水溶液60分钟，之后使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，将清液按照1:1比例用二氯甲烷萃取3次，将二氯甲烷相回收后旋干，进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的莱菔硫烷。
实施例5
将未经高温处理的西兰花种子粉碎，超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液；使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为2:1，在N2保护下溶解在50ml 1.5M的氨水中，40℃保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用。
取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入200ml乙醇，6.8ml氨水，1.5ml TEOS与10ml水，反应20分钟后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌15小时后，加入140ul APTES，反应8h后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白。在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS。反应60分钟后加入上步得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:100的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用。
用上步得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至7，温度30℃，水解萝卜硫苷水溶液60分钟，之后使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，将清液按照1:1比例用二氯甲烷萃取3次，将二氯甲烷相回收后旋干，进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的莱菔素。
本发明采用刀豆球蛋白结合黑芥子酶的方法，将刀豆球蛋白负载于基材之上，再将黑芥子酶链接在刀豆球蛋白之上，从而达到特异性的将黑芥子酶固定于基材之上，将黑芥子酶的纯化与固定化结合于一体，大大减少了黑芥子酶的纯化难度，提高了固定化效率，通过刀豆球蛋白吸附黑芥子酶表面的糖基吸附黑芥子酶且不吸附ESP蛋白，从而达到减少腈类物质的生成，增加异硫氰酸脂类化合物产量，使得硫代葡萄糖苷转化生成异硫氰酸脂的转化率大大增加。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (5)

1.一种黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)黑芥子酶的提取：
将未经高温处理的十字花科植物的种子、花、茎、叶粉碎或者基因工程菌超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液；
(2)四氧化三铁纳米球的制备：
使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为0.1:1-10:1，在N2保护下溶解在10-1000ml0.1-5M的氨水中，5-50℃保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用；
(3)包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球的制备：
取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入10-1000ml乙醇，1-100ml氨水，0.1-10ml TEOS与1-100ml水，反应1-100分钟后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌1-50小时后，加入10-1000ul APTES，反应1-50h后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；
(4)纳米球表面接枝刀豆球蛋白：
按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白，在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS，反应60分钟后加入步骤(3)得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；
(5)纳米球固定化黑芥子酶：
按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:1-1:1000的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；
(6)催化得到异硫氰酸脂类化合物并对其纯化：
用步骤(5)得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至5-7，温度20-50℃，水解硫代葡萄糖苷水溶液0-300分钟，之后离心或者使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，将清液用二氯甲烷或者乙酸乙酯萃取3次，将二氯甲烷相或乙酸乙酯相旋干后进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的的异硫氰酸脂类产品。
2.根据权利要求1所述的黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，其特征在于，步骤(1)中所用的粗酶液来源为西兰花、甘蓝、芥蓝、白菜、花椰菜植物的种子、花、茎和叶，或者为基因工程菌表达的黑芥子酶。
3.根据权利要求1所述的黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(6)中pH值缓冲液为K2HPO4-KH2PO4缓冲液。
4.根据权利要求1所述的黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，其特征在于，步骤(6)中使用的硫代葡萄糖苷为脂肪族硫代葡萄糖苷。
5.根据权利要求1所述的黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，其特征在于，步骤(6)中，乙酸乙酯或二氯甲烷添加量为原液的0.5至5倍。
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