CN108624573B - 一种工业提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工业提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性的方法，属于酶制剂技术领域。本发明首先在谷氨酰胺转胺酶发酵液中添加盐、糖类或其衍生物、蛋白质、醇类等外源性物质，用乙醇对所述发酵液进行沉淀得到沉淀物；向所述沉淀物中加入氨基酸或麦芽糊精，混合均匀；经喷雾干燥后，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。通过多种外源性物质的协同作用，有效地提高了酶活收率。本发明方法操作简单，对谷氨酰胺转胺在加工过程及贮藏过程中，由于受到外界环境因素造成的酶活下降程度有显著缓解作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种工业提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性的方法，属于酶制剂技术领域。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶(简称TGase，EC 2.3.2.13)是一种硫醇酶，通过诱导肽段之间ε-(γ- 谷氨酸)赖氨酸键作用，催化蛋白的铰链形成网状结构，从而提高蛋白质的水溶性、起泡性、乳化性和热稳定性，特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品、纺织、生物医药材料工程等领域。
随着生物技术和酶工程技术在工业领域的普遍应用，酶蛋白所具有的特异活性构象，在加工过程及贮藏过程中，由于受到外界环境因素的影响，当环境改变或一些基团的相互作用被削弱时，容易引起没结构的崩溃以及构象杂乱化。酶的空间结构一旦遭到破坏，活性中心的构象也随之改变，最终导致酶失活。TGase主要是由微生物发酵制成，其提取纯化工艺需在低温下进行，所以温度是影响TGase酶活的重要因素。冷冻干燥的方法生产谷氨酰胺转胺酶虽然能避免高温造成的酶失活问题，但是成本高，耗时长，且销售和应用都需在低温下进行。采用喷雾干燥的方式虽然容易造成因温度控制不当产生的酶失活现象，但其成本低廉，耗时短，便于室温销售及应用，更有利于工业化应用。
目前，已有文献报道了一些通过添加外源物质，比如盐、糖类及其衍生物、氨基酸等来提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法。比如，CN102399771A公开了一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，具体是：取酶活为25u/ml的茂原轮链丝菌(Streptoverticilliummobaraense) 发酵液200ml，加入8g氯化钠(4％w/v)和2g麦芽糖醇(1％w/v)，搅拌直至完全溶解，静置30分钟。添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在4℃低温静置10分钟。离心，弃上清液，取沉淀物，称重为5g。在沉淀物中加入5g甘氨酸，搅拌均匀，静置30分钟。放入真空干燥箱，37℃，干燥4小时，所得酶粉为谷氨酰胺转胺酶的酶制剂；该方法虽然可以达到较高的酶活收率(91％)，但是其使用的干燥方法为真空干燥，不适合工业化应用；如果将该方法中的外源性物质添加到发酵液中采用喷雾干燥方法来制备酶制剂，那么酶活收率将会大幅度下降，因为喷雾干燥的温度(进风温度150-180℃，出风温度55-70℃)远远高于真空干燥(37℃)的温度。也有一些文献报道了通过外源添加物复配来提高其他种类的酶的热稳定性的报道，然而不同种类的酶，其无论是在酶结构、酶性能上面都有比较大的差异，适合其他酶的方法不一定适合谷氨酰胺转胺酶。
因此，有必要一种提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性的、可工业化的方法。
发明内容
本发明提供了一种提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性的方法，解决了现有技术中因谷氨酰胺转胺酶的生产方法中所存在的由温度变化引起的酶活力及热稳定性下降，以及由于其他环境因素造成的酶活下降问题。本发明方法，通过在谷氨酰胺转胺酶发酵液中同时添加盐、糖类及其衍生物、氨基酸、蛋白质、醇类等多种外源性物质，通过外源性物质的协同作用，有效地提高谷氨酰胺转胺酶的贮藏稳定性。本发明方法对谷氨酰胺转氨酶的耐热性有大幅度提高，使得酶制剂在生产与销售过程中减少酶活损失，提高收率，且适合于工业化生产。
本发明的一种工业提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性的方法，在谷氨酰胺转胺酶发酵液中同时添加盐、糖类或其衍生物、蛋白质、醇类这4种外源性物质，用乙醇对所述发酵液进行沉淀得到沉淀物；向所述沉淀物中加入氨基酸和/或麦芽糊精，混合均匀；经喷雾干燥后，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。
在一种实施方式中，所述发酵液中谷氨酰胺转胺酶的酶活为10-30U/mL。
在一种实施方式中，所述的盐包括氯化钾、硫酸铵、氯化钠等，优选地，硫酸铵。
在一种实施方式中，所述糖类或其衍生物包括葡萄糖、海藻糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇等，优选地，海藻糖。
在一种实施方式中，所述氨基酸包括半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、甘氨酸等。
在一种实施方式中，所述蛋白质包括谷朊粉、小麦蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白和酪蛋白等，优选地，小麦蛋白。
在一种实施方式中，所述醇类包括山梨醇、丙三醇等，优选地，山梨醇。
在一种实施方式中，所述的盐的添加量为5％-20％w/v，优选添加量为8％-12％w/v。
在一种实施方式中，所述的糖类及其衍生物的添加量为8％-25％w/v，优选添加量为 10％-15％w/v。
在一种实施方式中，所述的蛋白质的添加量为1％-10％w/v，优选添加量为3％-6％w/v。
在一种实施方式中，所述的醇类物质的添加量为10％-30％w/v，优选添加量为15％-25％w/v。
在一种实施方式中，所述的乙醇的用量与加入外源性物质后的发酵液体积相同。
在一种实施方式中，所述用乙醇进行沉淀的方法为加入乙醇后，于0-4℃静置。
在一种实施方式中，所述沉淀通过离心、弃上清液后得到。
在一种实施方式中，所述的氨基酸的添加量为0.5％-5％w/w，优选添加量为0.8％-2.5％w/w。
在一种实施方式中，所述麦芽糊精葡萄糖当量(DE值)为8-20，优选葡萄糖当量(DE值)为8-10；麦芽糊精添加量为20％-50％(w/w)优选添加量为30％-40％(w/w)。
在一种实施方式中，所述的喷雾干燥为进风温度150℃-180℃、进料速率 20mL/min-30mL/min、压缩空气流量150NL/min-250NL/min，出风温度55℃-70℃。
在一种实施方式中，所述方法具体是：在茂源链霉菌或其他产谷氨酰胺转氨酶微生物的发酵液中同时添加5％-20％(w/v)的硫酸铵、8％-25％(w/v)的海藻糖、1％-10％(w/v)的小麦蛋白、10％-30％(w/v)的山梨醇；添加1:1(v/v)的乙醇沉淀发酵液，静置5-10分钟；离心，弃上清，取沉淀称重，加入0.5％-5％(w/w)氨基酸和20％-50％(w/w)麦芽糊精，混合均匀；最后采用喷雾干燥，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。
本发明的有益效果：
本发明提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性的方法，其创新点在于酶发酵液中同时加入盐、糖类或其衍生物、氨基酸、蛋白质、醇类多种外源性物质。通过这些外源添加剂的协同作用，有效地稳定了蛋白的空间结构，降低了其因温度等环境因素而造成的酶活下降程度。
盐增加了酶蛋白的变性温度，加入盐后，蛋白质分子不易展开，从而阻止了酶蛋白的受热变性，提高了热稳定性。由于糖类或其衍生物改善了发酵液的疏水相互作用，改变发酵液的表面张力，提高了热稳定性。氨基酸能维持蛋白质的天然构象阻止蛋白质变性，提高酶的热稳定性。蛋白质存在分子内和分子间的交联，加入发酵液中会形成类似于保护膜的网络空间结构，包裹酶分子，锁住水分或在酶活性中心附近形成疏水结构，阻止环境对酶活性的破坏，保护酶的热稳定性。醇类在一定程度上帮助蛋白质抵抗热变性，通过羟基与酶分子的相互作用及降低介质的介电常数来加强酶分子的疏水作用，从而改善酶的热稳定性。在优选的方式中，通过硫酸铵、海藻糖、小麦蛋白、山梨醇、氨基酸这几种物质的协同效应，最终有效地减少了谷氨酰胺转氨酶在喷雾干燥时的酶活下降程度，提高了生产收率。
本发明方法简单有效，可大幅度提高谷氨酰胺转胺酶的热稳定性，减少了生产及销售过程中酶活下降程度。采用喷雾干燥的方式成本低廉，耗时短，便于室温销售及应用，更有利于工业化应用。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明做进一步详细描述。
本发明的工业提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性，具体步骤如下：
在谷氨酰胺转氨酶酶活为2-50U/mL的茂源链霉菌或其他产谷氨酰胺转氨酶微生物的发酵液中添加添加5％-20％(w/v)的盐、8％-25％(w/v)的糖类或其衍生物、1％-10％(w/v) 的蛋白质、10％-30％(w/v)的醇类物质，添加其中一种或多种复配外源性物质搅拌至完全溶解，静置30min。优选盐添加量为8％-12％(w/v)，糖类或其衍生物优选添加量为10％-15％(w/v)。
向上述发酵液中添加1:1(v/v)的乙醇沉淀进行沉淀，室温下静置5-10min，离心，弃上清，取沉淀称重。
加入0.5％-5％(w/w)氨基酸和20％-50％(w/w)麦芽糊精，混合均匀，静置30min，本发明中的氨基酸包括半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、甘氨酸等。
最后采用喷雾干燥，进风温度150℃-180℃、进料速率20mL/min-30mL/min、压缩空气流量150NL/min-250NL/min，出风温度55℃-70℃，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。
通过比色法测定谷氨酰胺转胺酶酶活，谷氨酰胺转胺酶的活性可以通过将伯胺羟基引入到合成基质CBZ-Gln-Gly，然后测量生成的氧肟酸量的方法测定。氧肟酸的量则可通过测定它与FeCl3-TCA形成的红色络合物在525nm的吸光度而测得。取500mg待测样品于50mL烧杯中，加入约45mL0.2M的Tris-HCl缓冲液(pH值6.0)，室温下搅拌30min，定容至50mL。吸取200μL待测样，37℃保温1min，加入已在37℃预热10min的A试剂2mL，37℃下反应10min，加入2mL的B试剂，离心取上清，在525nm下测定吸光度值。空白对照组为200μL 待测样，37℃保温1min，先加入2mL的B试剂反应10min后，加入37℃预热10min的A试剂2mL，离心取上清，在525nm下测定吸光度值。用L-谷氨酸-γ-单羟胺酸做标准曲线。
A试剂(反应液)：0.2M Tris-HCl、0.1M盐酸羟胺、0.01M还原型谷胱甘肽、0.03MNa-CBZ-Gln-Gly，PH6.0。
B试剂(终止液)：3M HCl、12％(w/v)三氯乙酸、5％(w/v)三氯化铁，三种溶液等量混合均匀。
实施例1
取酶活为30U/mL的茂源链霉菌所产生的的谷氨酰胺转胺酶发酵液200mL，添加1:1(v/v) 的乙醇沉淀发酵液，室温下静置10min，离心，弃上清，喷雾干燥(进风温度160℃、进料速率25mL/min、压缩空气流量200NL/min，出风温度65℃)后得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。
测定其酶活，37℃放置一个月后测其酶活，计算酶活下降程度。
实施例2
与实施例1相比，在乙醇沉淀后弃上清的沉淀物中，加入2.5％(w/w)氨基酸，混合均匀，静置30min，然后再进行喷雾干燥；其他步骤与参数与实施例1一致。
取酶活为30U/mL的茂源链霉菌所产生的的谷氨酰胺转胺酶发酵液200mL，添加1:1(v/v) 的乙醇沉淀发酵液，室温下静置10min，离心，弃上清，取沉淀称重，加入2.5％(w/w)氨基酸，混合均匀，静置30min，然后再进行喷雾干燥(进风温度160℃、进料速率25mL/min、压缩空气流量200NL/min，出风温度65℃)，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。
测定其酶活，37℃放置一个月后测其酶活，计算酶活下降程度。
实施例3
与实施例2相比，在发酵液中添加不同的外源添加剂或者外源添加剂的组合，搅拌至完全溶解，静置一段时间，然后再进行后续的乙醇沉淀等步骤；且其他步骤与参数与实施例2 一致。具体地：
取酶活为30U/mL的茂源链霉菌所产生的的谷氨酰胺转胺酶发酵液200mL，加入一种或者多种外源添加物，搅拌至完全溶解，静置30min。添加1:1(v/v)的乙醇沉淀发酵液，室温下静置10min，离心，弃上清，取沉淀称重，加入2.5％(w/w)氨基酸，混合均匀，静置30min，然后喷雾干燥(进风温度160℃、进料速率25mL/min、压缩空气流量200NL/min，出风温度 65℃)得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。
测定其酶活，37℃放置一个月后测其酶活，计算酶活下降程度。
表1不同外源添加物得到的谷氨酰胺转胺酶酶制剂性能
其中，酶活收率＝谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末的总酶活(U)/初始发酵液的总酶活(U)
酶活下降率＝37℃放置一个月后的谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末的总酶活/新制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末的总酶活(U)。
Claims (5)
1.一种工业提高谷氨酰胺转胺酶贮藏稳定性的方法，其特征在于，所述方法是在谷氨酰胺转胺酶发酵液中同时添加1.6％(w/v)硫酸铵、1％(w/v)小麦蛋白、3％(w/v)山梨醇和2％(w/v)海藻糖这4种外源性物质，用乙醇对所述发酵液进行沉淀得到沉淀物；向所述沉淀物中加入2.5％(w/w)氨基酸，混合均匀；经喷雾干燥后，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液中谷氨酰胺转胺酶的酶活为10-30U/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的喷雾干燥为进风温度150℃-180℃、进料速率20mL/min-30mL/min、压缩空气流量150NL/min-250NL/min，出风温度55℃-70℃。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：在茂源链霉菌或其他产谷氨酰胺转氨酶微生物的发酵液中同时添加1.6％(w/v)硫酸铵、1％(w/v)小麦蛋白、3％(w/v)山梨醇和2％(w/v)海藻糖；添加1:1(v/v)的乙醇沉淀发酵液，静置5-10分钟；离心，弃上清，取沉淀称重，加入2.5％(w/w)氨基酸，混合均匀；最后采用喷雾干燥，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂粉末。
5.根据权利要求1-4任一所述方法制备得到的谷氨酰胺转胺酶酶制剂。
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