CN108619148A - 一种噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂的医药新用途 - Google Patents

一种噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂的医药新用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂的医药新用途，是在制备治疗肺癌合并慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，所述复方制剂由噻托溴铵和福莫特罗与药用辅料制成，其中噻托溴铵：福莫特罗的份量比为2.5:1、2.8:1、3:1。研究表明噻托溴铵显著性抑制肺癌细胞的生长，抑制肺癌移植瘤的生长，能产生较强的支气管扩张作用。而福莫特罗对肺癌细胞的生长和肺癌移植瘤的生长虽无作用，但能明显增强噻托溴铵的抗肺癌作用和支气管扩张作用。本发明复方制剂通过气道吸入途径给药，可使靶器官肺的药物浓度大大地高于系统给药，血药浓度和其他脏器的分布大大地减少，减少全身不良反应。可在治疗肺癌合并慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

Description

一种噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂的医药新用途
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂的医药新用途。
技术背景
肺癌(lung cancer)是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。根据《临床肿瘤杂志》(CA:美国癌症学会主办的专业权威学术期刊2015年发表的全球癌症统计数据显示，仅2012年全球新增肺癌病例180万，占全部癌症诊断的18％。东亚地区(韩国、日本和中国) 发病率男性为50.4/100000，女性为19.2/100000，中国人女性患者达到了24.4/100000，明显高于欧洲国家女性。最常见癌症死亡原因为男性肺和支气管癌、前列腺癌和结直肠癌，女性肺和支气管癌、乳腺癌及结直肠癌。这四种癌症占全部癌症死亡病例的46％，而其中肺癌超四分之一(27％)。多篇文献报道，临床上肺癌诊断时多数患者合并有不同程度的慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
COPD也是全球高发病率、高死亡率的疾病，长期以来人们将肺癌和COPD作为两个独立的疾病分别进行了广泛研究，然而其早期防治工作和预后并未得到根本改善。近年许多研究显示两者共同存在的一些环境因素(空气污染)、致病因素(吸烟)、异常的免疫炎症反应，从而影响肺癌和COPD的发生发展。肺癌并发COPD临床上较为常见，Kiri等研究显示50％～ 70％的肺癌患者合并COPD，伴COPD的肺癌患者3年存活率仅为无COPD患者的一半。Islam 等新近的流行病研究(2015年)揭示肺癌合并慢性呼吸病的发生率约占所有肺癌病人的53％。我国广州呼吸疾病国家重点实验室秦茵茵等在中国呼吸与危重监护杂志(2013年1月第12卷第 1期)报道365例肺癌中有227例同时伴有COPD(占62.6％)，合并COPD者的2年生存率明显低于不合并COPD者。然而，至今尚未有一个能同时解决呼吸困难和实体瘤的治疗方案。肺癌的治疗主要侧重于对瘤体生长的控制，而COPD的治疗主要侧重于缓解呼吸困难。如果有一个能缓解呼吸困难的同时又有控制瘤体生长的药物或治疗方案，似乎能达到“标本兼顾”的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂的医药新用途，所述复方吸入制剂在制备治疗肺癌合并慢性阻塞性肺疾病(COPD)药物中的应用，所述复方吸入制剂由噻托溴铵和福莫特罗与药用辅料制成，其中噻托溴铵：福莫特罗的份量比为2.5:1、2.8:1、 3:1。
本发明复方吸入制剂经药效学试验证明，能显著性抑制肺癌细胞的生长，抑制肺癌移植瘤的生长，能更强更快速地产生支气管扩张作用。主要用于治疗肺癌合并COPD患者，抑制肺癌细胞生长和扩散，缓解呼吸困难。
本发明所述复方吸入制剂的剂型为吸入制剂，包括但不限于干粉吸入剂、定量压力气雾吸入剂、雾化吸入溶液、吸入喷雾剂等。
本发明旨在研发一个适用于治疗肺癌合并COPD的复方药物。该药物应用胆碱能受体 M3受体阻断药噻托溴铵(Tiotropium，Tio)与β2激动药福莫特罗(Formoterol，For)联合，制成复方吸入剂。该复方有三个方面的新颖性：
(1)作用机制新：①体外试验证明了M受体阻断药Tio能通过抑制M3受体抑制肺癌细胞的生长，For能协同Tio的作用，提高Tio对肺癌细胞的抑制率；体内试验证明了Tio能抑制裸鼠肺癌移植瘤的生长；For能协同Tio的作用，提高对Tio对肺癌移植瘤的抑制率。②证明了Tio气道内给药扩张缓解豚鼠支气管收缩，For能协同Tio的作用，增强了Tio对支气管收缩的扩张作用。研究表明：噻托溴铵显著性抑制肺癌细胞的生长，抑制肺癌移植瘤的生长，能产生较强的支气管扩张作用。单独的福莫特罗对肺癌细胞的生长和肺癌移植瘤的生长无作用，但能明显增强噻托溴铵的抗肺癌作用和支气管扩张作用。
(2)给药途径新：抗肺癌治疗药物多数通过系统给药途径(口服或注射)。本制剂通过气道吸入途径给药，可使靶器官肺的药物浓度大大地高于系统给药，血药浓度和其他脏器的分布大大地减少，减少了全身不良反应。
(3)适应症新：肺癌合并COPD至少占50％左右，至今尚还没有一个能同时解决实体瘤和呼吸困难的治疗方案。Tio与For组合复方吸入制剂可达到控制瘤体生长的同时又有缓解呼吸困难的目的，两药协同既能提高抑瘤疗效又能增强舒张气管缓解呼吸困难。
附图说明
图1、噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对肺癌A549细胞生长的抑制作用。统计学：n＝6；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs对照组；##p<0.01vs Tio12nM组；$$$p<0.001vs For4nM组。
图2、噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对肺癌H520细胞生长的抑制作用。统计学：n＝6；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs 对照组；##p<0.01vs Tio-12nM组；$$p<0.01vs For-4nM组。
图3、噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对肺癌H292细胞生长的抑制作用。统计学：n＝6；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs 对照组；##p<0.01vs Tio-12nM组；$$p<0.01vs For 4nM组。
图4、噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对NCI-H520 肺癌裸鼠体重的影响。统计学：n＝7；与模型组比较*p<0.05
图5、噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的抑制作用。统计学：n＝7，与模型组比较**p<0.01， ***p<0.001，与Tio 3μg/kg组比较#p<0.05，与For 1μg/kg组比较$$p<0.01。
图6、噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤重量的抑制作用。统计学：n＝7，与模型组比较，*p<0.05，***p<0.001，与Tio 3μg/kg组比较#p<0.05，与For1μg/kg组比较$$p<0.01。
图7、噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的抑制作用。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1噻托溴铵和福莫特罗复方干粉吸入剂(样品1)
处方
噻托溴铵 22.5mg
福莫特罗 9mg
乳糖 25g
工艺
分别将噻托溴铵、福莫特罗微粉化后备用，称取处方量主药和载体乳糖分别过40目筛预混，将所得预混物三维混合(T2F)5～10min，再将干粉灌装于1000粒明胶胶囊中，每粒 25mg(即每粒含噻托溴铵22.5μg和福莫特罗9μg)。
实施例2噻托溴铵和福莫特罗复方干粉吸入剂(样品2)
处方
噻托溴铵 25.2mg
福莫特罗 9mg
乳糖 25g
工艺
分别将噻托溴铵、福莫特罗微粉化后备用，称取处方量主药和载体乳糖分别过40目筛。将所得预混物三维混合(T2F)5min，再经高速搅拌混合10min，得干粉，再将干粉灌装于 1000粒明胶胶囊中，每粒5mg(即每粒含噻托溴铵25.2μg和福莫特罗9μg)。
实施例3噻托溴铵和福莫特罗复方干粉吸入剂(样品3)
处方
噻托溴铵 27mg
福莫特罗 9mg
乳糖 25g
工艺
分别将噻托溴铵、福莫特罗微粉化后备用，称取处方量主药和载体乳糖分别过40目筛。将所得预混物三维混合(T2F)20min，即得供吸入干粉，再将干粉灌装于1000粒明胶胶囊中，每粒13mg(即每粒含噻托溴铵27μg和福莫特罗9μg)。
实施例4噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对肺癌细胞的抑制作用
1.细胞株
人肺癌细胞A549、NCI-H520(H520)、NCI-H292(H292)均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养于无菌细胞房，温度37℃，相对湿度100％，含5％CO2的培养箱内。培养基为加入10％南美小牛血清FBS与1％双抗的RPMI-1640培养基。
2.试验中所用主要试验仪器信息如下：
1)电热恒温箱：MP-19H型，上海一恒仪器科学有限公司；
2)台式离心机：TDL-5型，上海安亭科学仪器厂；
3)超净工作台：Heraeus型，德国；
4)CO2培养箱：3111型，Thermo公司；
5)倒置显微镜：IX70型，Olympus公司；
6)电子天平：AG245型，METTLER TOLEDO；
7)酶标仪：xMark型，美国BIO-RAD伯乐。
3.试验中所用主要试剂信息如下：
1)RPMI-1640(1640)培养基，批号：NZE1144，HyClone公司；
2)胎牛血清，批号：NXA0544，HyClone公司；
3)青链霉素混合液(双抗)，批号：20171025，Solarbio公司；
4)胰酶，批号：CY003，杭州科易生物技术有限公司；
5)MTT，批号：0793，美国Biosharp公司；
6)噻托溴铵一水合物(Tio)，批号：TBM-150601，安徽德信佳生物医药有限公司；
7)富马酸福莫特罗(For)，批号：HH-160308，苏州汇和药业有限公司；
8)样品1，实施例1中所得复方干粉吸入剂；
9)样品2，实施例2中所得复方干粉吸入剂；
10)样品3，实施例3中所得复方干粉吸入剂；
11)PBS：称取NaCl 4.5g，KH2PO4 0.072g，Na2HPO4·12H2O 0.53g加双蒸水至500mL，高压灭菌后使用。
12)二甲基亚砜(DMSO)，批号：20160814，国药集团化学试剂有限公司。
4.试验方法
4.1受试物配制
1)噻托溴铵(Tio)配制：称取Tio溶于PBS中，配制成浓度为120nM的溶液；
2)福莫特罗(For)配制：称取For溶于PBS中，配制成浓度为40nM的溶液；
3)样品1配制：取适量样品1溶于PBS中，配制成浓度为Tio 100nM+For 40nM的复方吸入制剂；
4)样品2配制：取适量样品2溶于PBS中，配制成浓度为Tio 112nM+For 40nM的复方吸入制剂；
5)样品3配制：取适量样品3溶于PBS中，配制成浓度为Tio 120nM+For 40nM的复方吸入制剂。
4.2检测方法
取指数生长期的细胞(A549、H520和H292)制成单细胞悬液，以1×104cells/孔的密度接种于96孔板上，用含10％胎牛血清的培养基37℃培养24h让细胞贴壁，培养终体积为100μl。试验分6组，分别为对照组(加10μl PBS)、受试药物组加入上述配制浓度药物10μl，使其终浓度为Tio 12nM组、For 4nM组、样品1组(Tio 10nM+For 4nM)、样品2组(Tio 11.2nM+For 4nM)，样品3组(Tio 12nM+For 4nM)，加药后孵育24h、48h或72h后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT 10μL，轻微振荡混匀后，继续置于37℃培养。4h后，取出 96孔培养板，用水平离心机2000转/分室温离心5min，仔细吸弃上清，每孔加入100μL DMSO，于摇床上振荡10min，充分溶解蓝紫色的甲臜沉淀。在490nm波长测各孔吸光度值OD，以此评价药物对细胞生长抑制作用。
5.试验结果
Tio 12nM组、For 4nM组、样品1组、样品2组和样品3组药物孵育24h对A549细胞生长的抑制率分别为19.2％、2.4％、32.5％、37.3％和36.7％，药物孵育48h对A549细胞生长的抑制率分别为25.5％、3.2％、45.6％、47.8％和48.6％，药物孵育72h对A549细胞生长的抑制率分别为30.4％、2.7％、62.8％、64.5％和60.2％。结果显示(见图1)，药物孵育24h、48h和72h，样品1、样品2组和样品3组对A549细胞生长的抑制率统计学显著高于Tio或 For单独用药，表明Tio与For药物比在2.5:1、2.8:1和3:1对A549细胞生长的抑制作用均显著大于Tio或For单独用药，For单独用药无作用。
Tio 12nM组、For 4nM组、样品1组、样品2组和样品3组药物孵育24h对H520细胞生长的抑制率分别为21.4％、3.2％、38.6％、35.7％和37.4％，药物孵育48h对H520细胞生长的抑制率分别为29.8％、1.5％、52.6％、59.8％和56.8％，药物孵育72h对H520细胞生长的抑制率分别为38.0％、2.5％、68.7％、64.7％和66.8％。结果显示(见图2)，药物孵育24h、48h和72h，样品1、样品2组和样品3组对H520细胞生长的抑制率统计学显著高于Tio或 For单独用药，表明Tio与For药物比在2.5:1、2.8:1和3:1对H520细胞生长的抑制作用显著大于Tio或For单独用药，For单独用药无作用。
Tio 12nM组、For 4nM组、样品1组、样品2组和样品3组药物孵育24h对H292细胞生长的抑制率分别为18.7％、1.6％、38.7％、39.4％和35.2％，药物孵育48h对H292细胞生长的抑制率分别为31.3％、3.5％、50.8％、55.8％和54.1％，药物孵育72h对H292细胞生长的抑制率分别为38.8％、2.3％、60.9％、70.8％和66.3％。结果显示(见图3)，药物孵育24h、48h和72h，样品1、样品2组和样品3组对H292细胞生长的抑制率统计学显著高于Tio或 For单独用药，表明Tio与For药物比在2.5:1、2.8:1和3:1对H292细胞生长的抑制作用显著大于Tio或For单独用药，For单独用药无作用。
实施例5噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的抑制作用
1.实验动物
BALB/c裸鼠，SPF级，42只，雄性，5周龄，合格证编号：2015000550446，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。动物购入后，饲养于浙江大学实验动物中心SPF级动物房，采用IVC笼具饲养，每笼3或4只。温度20～26℃，湿度40～70％，光照12D/12N，动物自由饮食。实验过程与操作均符合浙江大学实验动物中心管理委员会制定的动物管理要求。
2.细胞株
NCI-H520人肺癌细胞，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养于无菌细胞房，温度37℃，相对湿度100％，含5％CO2的培养箱内。培养基为加入10％小牛血清 FBS与1％双抗的RAPI-1640培养基。
3.试验中所用主要试验仪器信息如下：
1)电热恒温箱：MP-19H型，上海一恒仪器科学有限公司；
2)台式离心机：TDL-5型，上海安亭科学仪器厂；
3)超净工作台：Heraeus型，德国；
4)CO2培养箱：3111型，Thermo公司；
5)倒置显微镜：IX70型，Olympus公司；
6)电子天平：AG245型，METTLER TOLEDO；
7)电子天平：HX501型，慈溪市天东衡器厂；
8)游标卡尺：0-150型，无锡凯保鼎工具有限公司；
9)制冰机：AF10型，Scotman公司；
10)干粉喷药器：DP-4型，Penn-Century,Inc.,PA,USA。
4.试验中所用主要试剂信息如下：
1)RPMI-1640(1640)培养基，批号：NZE1144，HyClone公司；
2)胎牛血清，批号：NXA0544，HyClone公司；
3)青链霉素混合液(双抗)，批号：20171025，Solarbio公司；
4)胰酶，批号：CY003，杭州科易生物技术有限公司；
5)异氟烷，批号：217180101，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；
6)噻托溴铵一水合物(Tio)，批号：TBM-150601，安徽德信佳生物医药有限公司；
7)富马酸福莫特罗(For)，批号：HH-160308，苏州汇和药业有限公司；
8)样品1，实施例1中所得复方干粉吸入剂；
9)样品2，实施例2中所得复方干粉吸入剂；
10)样品3，实施例3中所得复方干粉吸入剂。
5.建立移植瘤模型、筛选、分组与给药
采用瘤块移植法，收集细胞，将细胞浓度调整约为5×107个/mL，取0.1mL混匀的细胞悬液接种于裸鼠右侧腋下皮下，待肿瘤体积达到500mm3以上时，将肿瘤切成约2mm×1mm×1mm 大小的瘤块，接种于新购裸鼠右侧皮下，体内传两代后进行试验。待移植瘤长出后，筛选出移植瘤体积≥100mm3的裸鼠，采用完全随机法进行分组，共分为6组，每组7只裸鼠，分别为：模型组(Model)、噻托溴铵(Tio 3μg/kg)组、福莫特罗(For 1μg/kg)组、样品1(Tio2.5μg/kg+For1μg/kg)组、样品2(Tio 2.8μg/kg+For1μg/kg)、样品3(Tio 3μg/kg+For1μg/kg)，采用吸入给药，异氟烷麻醉动物，撑开动物口腔，待动物吸气时用干粉喷药器将药物从咽喉处喷入呼吸道，模型组给予辅料乳糖对照，其余各组给予相应的药物，每天给药一次，连续 28天。
6.检测指标
6.1每隔两天与每次给药前称量移植瘤裸鼠的体重，以观察药物的安全性。
6.2每隔两天用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，以动态的观察肿瘤的变化，肿瘤体积公式：V＝ab2/2。
6.3给药结束后颈椎脱臼处死裸鼠，摘取肿瘤，称重并进行统计分析，拍照。
6.4移植瘤体积抑制率％＝(Vmodel-V给药)/Vmodel×100％，Vmodel：Model组的移植瘤体积，V给药：药物治疗组的移植瘤体积。
7.统计学分析
将实验数据录入Excel数据库中进行计算，以表示，再采用SPSS统计软件进行方差分析，p<0.05表示有统计学差异。
8.结果
8.1噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂对NCI-H520肺癌裸鼠体重的影响
给药开始至试验结束，除For 1μg/kg组外、其他各组包括Tio 3μg/kg组、样品1组、样品2组和样品3组裸鼠体重与模型组比较均有显著增加(p<0.05)。见附图4。
8.2噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂对裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的抑制作用
给药开始至试验结束，与模型组比较，Tio 3μg/kg组能明显抑制裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的生长，与模型组比较有显著性差异(p<0.01)，以肿瘤体积计算肿瘤抑制率分别为34.4％。 For 1μg/kg组不能明显抑制裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的生长，与模型组比较无显著性差异 (p>0.05)，以肿瘤体积计算肿瘤抑制率分别为15.2％。样品1组、样品2组和样品3组均能明显抑制裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的生长，且与Model组比较有显著性差异(p<0.001)，以肿瘤体积计算肿瘤抑制率分别为53.8％、54.5％和52.3％。样品1组、样品2组和样品3组裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的体积明显小于Tio 3μg/kg组(p<0.05)；样品1组、样品2组和样品3组裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤的体积明显小于For 1μg/kg组(p<0.01)，这些结果提示： For虽然不能明显抑制NCI-H520肿瘤的生长，但能明显协同Tio，增强Tio的抑瘤作用。见附图5。
8.3噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂对裸鼠NCI-H520肺癌移植瘤重量的抑制作用
试验结束，摘取移植瘤，拍照，称重，统计结果显示，Tio 3μg/kg组瘤重明显小于模型组，与模型组比较有显著性差异(p<0.05)。For 1μg/kg组虽然不能明显减轻裸鼠NCI-H520 瘤重，与模型组比较无显著性差异(p>0.05)，但能明显协同Tio，增强Tio的抑瘤作用。样品1、样品2、样品3组瘤重明显小于模型组，与模型组比较有显著性差异(p<0.001)。样品1、样品2、样品3组瘤重均明显小于单用Tio 3μg/kg组，且组间比较有显著性差异(p<0.05～0.01)。样品1、样品2、样品3组瘤重明显小于单用For 1μg/kg组，组间比较有显著性差异 (p<0.01)。见附图6和附图7。
9.结论：该试验结果提示，单用噻托溴铵有抗肺癌作用；福莫特罗虽不能明显抑制肺癌 NCI-H520的生长，但能明显协同Tio，增强Tio的抑瘤作用；噻托溴铵和福莫特罗复方干粉吸入剂(样品1)有较强的抗肺癌作用。
实施例6噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3对乙酰甲胆碱诱导豚鼠支气管收缩的保护作用
试验名称：乙酰甲胆碱诱导豚鼠支气管收缩反应(整体试验)
1实验材料
1.1.动物
豚鼠，60只，雌雄各半，体重300～350g，合格证序号0016753，许可证号SCXK(浙)2012-0052。购于浙江大学实验动物中心。购入后饲养于浙江大学试验动物中心普通级动物房，自由摄食和饮水。温度18～29℃，湿度40％～70％，光照12h明12h暗。实验过程与操作均符合浙江大学实验动物中心管理委员会制定的动物管理要求。
1.2主要试剂
(1)乙酰甲胆碱(Mch)：批号：MKBS8120V，Sigma；
(2)无水乙醇：批号：20150414，国药集团化学试剂有限公司；
(3)无水乙醚：批号20130109，国药集团化学试剂有限公司；
(4)异氟烷，批号：217180101，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；
(5)乌来糖：批号20160219，国药集团化学试剂有限公司；
(6)噻托溴铵一水合物(Tio)，批号：TBM-150601，安徽德信佳生物医药有限公司；
(7)富马酸福莫特罗(For)，批号：HH-160308，苏州汇和药业有限公司；
(8)样品1，实施例1中所得复方干粉吸入剂；
(9)样品2，实施例2中所得复方干粉吸入剂；
(10)样品3，实施例3中所得复方干粉吸入剂。
1.3主要仪器
(1)天平：AG245，METTLER TOLEDO；
(2)电子天平：HX501，慈溪市天东衡器厂；
(3)MedLab生物信号采集系统型号：MedLab-U/4C501H，南京美易科技有限公司；
(4)换能器：HX200型，北京新航兴业科贸有限公司；
(5)体积描记箱：自制，25cm×10cm×8cm(长×宽×高)的有机玻璃盒；
(6)干粉喷药器：DP-4型，Penn-Century,Inc.,PA,USA。
2实验方法
2.1动物分组与给药
豚鼠分为6组，每组10只，雌雄各半，分别为：模型(Model)组、噻托溴铵(Tio 1μg/kg) 组、福莫特罗(For 0.33μg/kg)组、样品1(Tio 0.83μg/kg+For 0.33μg/kg)组、样品2(Tio 0.93μg/kg+For 0.33μg/kg)组、样品3(Tio 1μg/kg+For 0.33μg/kg)组，采用吸入给药，异氟烷麻醉动物，撑开动物口腔，待动物吸气时用干粉喷药器将药物从咽喉处喷入呼吸道，模型组给予辅料乳糖对照，其余各组给予相应的药物。
2.2潮气量、气道流速、跨肺压测定：
测定方法：豚鼠给药后30分钟，乌来糖1.5g/kg腹腔注射(15％乌来糖，10ml/kg体重) 麻醉豚鼠。将豚鼠仰卧固定，分离气管，行气管插管，并分离颈外静脉，并插管，用于注射 Mch；将豚鼠装入体积描记箱内，用胸腔插管的钝针头插入豚鼠前胸第4～5肋间，可测得胸内压。待稳定后，从颈外静脉依次注入0、2μg/kg、4μg/kg、8μg/kg、12μg/kg的Mch，Mch 给药体积为0.1ml/100g体重。利用MedLab生物信号采集系统记录给Mch前后豚鼠潮气量、气道流速和跨肺压值，并通过公式计算气道阻力(Raw)及肺动态顺应性(Cdyn)。
2.5统计方法：
各结果采用Excel录入和SPSS(Version 20)软件包统计处理，以均数±标准误表示。各数据分别作方差齐性检验。若方差齐(p>0.05)则做单因素方差分析，各剂量组与对照组间做Dunnet检验。若方差不齐(p≤0.05)，则进行非参数检验，各剂量组与对照组间做Mann-Whitney U检验。与对照组比较，认为p<0.05有统计学差异。
3结果：
Mch(2、4、8、12μg/kg)静脉注射呈浓度依赖诱导豚鼠支气管收缩反应，增加Raw，降低Cdyn。Tio-1μg/kg组能明显抑制Mch诱导的Raw增加和Cdyn降低，对8μg/kg Mch引起的Raw增加的抑制率为45.98％，对8μg/kg Mch引起的Cdyn降低的抑制率为29.88％，；对12μg/kg Mch引起的Raw增加的抑制率为54.58％，对12μg/kg Mch引起的Cdyn降低的抑制率为24.71％。For 0.33μg/kg组对8和12μg/kg Mch诱导的Raw增加的抑制率分别为22.35％和23.86％，对Cdyn降低的抑制率分别为17.28％和20.96％。样品1对8、12μg/kg Mch诱导的Raw增加的抑制率分别为86.00和92.95％，对Cdyn降低的抑制率分别为57.79％和73.53％；样品2对8、 12μg/kg Mch诱导的Raw增加的抑制率分别为87.95和93.75％，对Cdyn降低的抑制率分别为61.04％和70.29％；样品3对8、12μg/kg Mch诱导的Raw增加的抑制率分别为88.61％和993.43％，对Cdyn降低的抑制率分别为63.25％和70.60％；实测结果总结于表1和2中。
从表3可见，Tio 1μg/kg或For 0.33μg/kg组给药后提高PC200(Raw值增加200％所需要的 Mch剂量)和PC50(Cdyn值下降50％所需要的Mch剂量)，而样品1、样品2和样品3组吸入给药后均进一步提高PC200和PC50值，与Tio 1μg/kg组或For 0.33μg/kg组比较有显著性差异(P<0.01)，见表3。这些结果提示复方干粉吸入剂样品1、样品2和样品3吸入给药较单用 Tio或For具有更明显的支气管扩张作用。
表1.噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3抑制Mch诱导气道阻力(Raw)增加(％，Mean±SEM)
与模型组比较：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；与Tio 1μg/kg或For 0.33μg/kg组比较：#p<0.05。
表2.噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3抑制Mch诱导肺顺应性(Cdyn)下降(％，Mean±SEM)
与模型组比较*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；与Tio-1μg/kg或For-0.33μg/kg组比较：#p<0.05。
表3.噻托溴铵(Tio)、福莫特罗(For)、复方吸入制剂样品1、样品2和样品3提高Mch Raw PC200值和CdynPC50值

Claims (3)

1.一种噻托溴铵和福莫特罗复方吸入制剂在制备治疗肺癌合并慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，其特征在于，所述复方吸入制剂由噻托溴铵和福莫特罗与药用辅料制成，其中噻托溴铵：福莫特罗的份量比为2.5:1、2.8:1、3:1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述复方制剂的剂型为吸入制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述吸入剂型包括但不限于干粉吸入剂、定量压力气雾吸入剂、雾化吸入溶液、吸入喷雾剂。
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SERVET BOLUKBAS，ET AL: "Short-term effects of inhalative tiotropium/formoterol/ budenoside versus tiotropium/formoterol in patients with newly diagnosed chronic obstructive pulmonary disease requiring surgery for lung cancer:a prospective randomized trial", 《EUROPEAN JOURNAL OF CARDIO-THORACIC SURGERY》 *

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