CN108607098A - 肝靶向智能超声响应释药的载药载体、制备方法及其应用 - Google Patents

肝靶向智能超声响应释药的载药载体、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，涉及肝靶向智能超声响应释药的载药载体、制备方法及其应用。该载药载体由两亲性嵌段共聚物pLAMA‑OC构成，以含半乳糖残基的聚合物分子作为亲水外壳，以硬脂酸分子作为疏水核心，疏水性药物通过疏水作用包载于载药载体的疏水核心中；当亲水外壳的聚合物分子与疏水核心的疏水分子偶联时形成超声敏感化学键，使载药载体具有超声响应释药功能。半乳糖残基所赋予载体的主动靶向能力配以超声敏感化学键的时空可控释药能力可以减少载药载体中的药物在血液循环中的泄露，增加肝癌细胞对载药载体的摄取，快速提高肝癌细胞内抗癌药物浓度，快速杀伤癌细胞，避免产生耐药性，在生物医学材料领域的具有应用价值。

Description

肝靶向智能超声响应释药的载药载体、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及肝靶向智能超声响应释药的载药载体、制备方法及其应用。
背景技术
肝癌是指发病于肝部的恶性肿瘤，原发性肝癌主要分为肝细胞型肝癌和胆管细胞型肝癌，其中肝细胞型肝癌在癌症致死率排名第三。临床上治疗肝癌的常见方法有手术治疗、放射线治疗、局部消融治疗、化学药物治疗。临床使用的小分子抗癌药物虽然对癌细胞有较好的杀灭作用，但是由于其缺乏对肿瘤细胞的选择性，且在体内代谢速度快，半衰期较短，容易被排除出体外，血液中的药物浓度在短时间循环后会很快降低到有效治疗浓度以下，因此正常剂量给药无法达到理想的治疗效果。为达到消灭肿瘤的目的，往往采用加大剂量给药，但是这样用药后会对人体正常组织造成严重的毒性，引起恶心、呕吐、脱发等毒副反应。
将抗癌小分子药物包载于纳米载体中，利用肿瘤组织处的高渗透性和高滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)，可以使载体被动靶向肿瘤细胞，进而使抗癌药物在肿瘤组织处有效地聚集，提高抗癌药物的生物利用率。在纳米载体表面进一步修饰上可以特异性识别癌细胞的配体，则能够使其具有主动靶向到肿瘤细胞的能力。主动靶向可以进一步提高纳米载体及其负载药物在肿瘤组织中的聚集，提高疗效。哺乳动物肝实质细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGP-R)具有高度组织特异性、高亲和力和高容量等特征，被认为是良好的肝主动靶向的靶标受体。半乳糖基团可以与去唾液酸糖蛋白受体特异性结合，是良好的肝主动靶向分子，为肝癌的治疗提供新途径。
通过主动靶向将药物载体准确递送到肿瘤组织后，抗癌药物的可控释放则可迅速提高药物在肿瘤组织中的浓度，使药物在短时间、高剂量杀伤癌细胞，降低耐药性的产生。超声敏感型释药载体可以对体外超声刺激进行有效响应，从而触发式释放出包载于载体核心的抗肿瘤药物，达到杀死癌细胞的目的。
通过原子转移自由基聚合反应得到含有半乳糖残基的亲水大分子，半乳糖残基能够主动靶向肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体，赋予纳米载体主动靶向肝癌细胞的能力，使纳米载体更高效聚集于肿瘤组织并被肿瘤细胞摄取。通过超声敏感键偶联亲水聚合物与疏水化合物得到超声响应释药的智能纳米载体，在超声刺激下，纳米载体在癌细胞内解体并快速释放所包载的抗癌药物，达到杀死癌细胞的效果。本发明的肝靶向超声响应智能释药的载药载体可以有效增加肝癌细胞对纳米载体的摄取并且可以在时空水平上控制药物释放，同时该载体尚未出现报道。因此本发明中的载药纳米载体为肝癌的治疗提供了更有效的新方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体、制备方法及其应用。
本发明的技术方案：
一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体，由两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC构成，以含半乳糖残基的聚合物分子作为亲水外壳，以硬脂酸分子作为疏水核心，疏水性药物通过疏水作用包载于载药载体的疏水核心中；当亲水外壳的聚合物分子与疏水核心的疏水分子偶联时形成超声敏感化学键，使载药载体具有超声响应释药功能；所述的载药载体的分子结构如下所示：
其中：m表示亲水链长度，为1-100的整数。进一步地，m优选为30-50，更优选为40。
一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，先制备两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC，用去离子水将pLAMA-OC和疏水性药物配成混合溶液，pLAMA-OC在混合溶液中自组装形成纳米载体，疏水性药物通过疏水作用包载于载药载体的疏水核心中；混合溶液经透析、冷冻干燥后，使载药载体负载药物；其中，疏水性药物与pLAMA-OC的质量比为1：(5-30)；
两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC的制备方法：首先合成甲基丙烯酸2(-N-乳糖酰胺)乙酯(LAMA)单体，然后通过原子转移自由基聚合反应将LAMA分子聚合形成含半乳糖残基的亲水聚合物pLAMA，硬脂酰氯和4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)反应形成疏水分子TEMPO-OC，最后通过单电子转移氮氧自由基偶合反应将亲水端与疏水端偶联，形成两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC；具体步骤如下：
(1)合成LAMA单体
将乳糖酸溶于无水甲醇，然后加入三氟乙酸(TFA)，30-90℃条件下反应4-12h，对乳糖酸进行活化，得到活化液；将活化液冷却至室温，加入三乙胺和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐，10-55℃避光条件下反应6-24h，得到反应液A；旋蒸除去反应液A中的部分溶剂，旋蒸后反应液A用乙醚沉淀获得粗产物，粗产物过滤后，用异丙醇洗涤，真空干燥，得到LAMA单体；
(2)合成pLAMA
将步骤(1)得到的LAMA单体与引发剂2-溴异丁酸乙酯于室温下溶解于N-甲基吡咯烷酮中，得到混合溶液B；混合溶液B通过氮气鼓泡除去溶液中的氧气；将溴化亚铜和2,2'-联吡啶依次加入混合溶液B中，得到反应液C；对反应液C通过氮气鼓泡除去氧气，在15-45℃、氮气保护条件下，反应2-12h，得到产物D；产物D经透析纯化、冷冻干燥，得到pLAMA；
(3)合成TEMPO-OC
将4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)溶于二氯甲烷中，加入吡啶，对TEMPO进行活化，0-30℃条件下反应15-50min，得到反应液E；将硬脂酰氯溶于二氯甲烷中得到混合溶液F，将混合溶液F逐滴加入到反应液E中，10-45℃条件下反应6-36h，得到产物G；产物G通过水洗、真空干燥，得到TEMPO-OC；
(4)合成pLAMA-OC
将步骤(2)得到的pLAMA溶于DMSO中得到混合液H，向混合液H加入步骤(3)得到的TEMPO-OC，得到混合液I，对混合溶液I通过氮气鼓泡除去氧气；再向除氧后的混合溶液I中依次加入溴化亚铜和2,2'-联吡啶，得到反应液J；对反应液J通过氮气鼓泡除去氧气，30-90℃、氮气保护条件下搅拌反应8-36h，得到反应液K；反应液K通过中性氧化铝柱去除体系中的铜离子复合物，用甲醇沉淀得到粗产物，将粗产物透析纯化、冷冻干燥，得到两亲性共聚物pLAMA-OC；
其中：
步骤(1)中，乳糖酸在甲醇中的浓度为0.01-0.05mol/L；乳糖酸和TFA摩尔比为1：(0.05-0.25)；乳糖酸、2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐和三乙胺的摩尔比为1：(0.8-2)：(0.025-0.25)；
步骤(2)中，LAMA单体在N-甲基吡咯烷酮中的浓度为0.05-0.1mol/L；2-溴异丁酸乙酯、LAMA和溴化亚铜的摩尔比为1：(1-100)：(1-2)；溴化亚铜和2,2'-联吡啶摩尔比为1：(1-3)；
步骤(3)中，TEMPO在二氯甲烷中的浓度为0.5-1.5mol/L；硬脂酰氯、吡啶和TEMPO的摩尔比为1：(1.5-3)：(0.9-2.5)；
步骤(4)中，pLAMA在DMSO中的浓度为0.001-0.002mol/L；pLAMA、TEMPO-OC和溴化亚铜的摩尔比为1:(0.8-2)：(0.8-2)；溴化亚铜和2,2'-联吡啶摩尔比为1：(1-3)；
反应如下式所示：
步骤(1)中，乳糖酸在甲醇中的浓度优选为0.02-0.03mol/L；乳糖酸和TFA摩尔比优选为1：(0.1-0.2)，更优选为1：(0.1-0.15)；乳糖酸、2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐和三乙胺的摩尔比优选为1：(1-2)：(0.1-0.25)，更优选为1：(1.1-1.3)：(0.1-0.2)；
步骤(2)中，LAMA单体在N-甲基吡咯烷酮中的浓度优选为0.07-0.09mol/L；2-溴异丁酸乙酯、LAMA和溴化亚铜的摩尔比优选为1：(20-60)：(1-1.5)，更优选为1：(25-55)：(1-1.1)；溴化亚铜和2,2'-联吡啶摩尔比优选为1：(1.5-2.5)，更优选为1：(2.1-2.3)；
步骤(3)中，TEMPO在二氯甲烷中的浓度优选为0.8-1.2mol/L；硬脂酰氯、吡啶和TEMPO的摩尔比优选为1：(1.5-2.5)：(1.2-2.5)，更优选为1：(1.8-2.0)：(1.2-1.8)；
步骤(4)中，pLAMA在DMSO中的浓度优选为0.0015-0.0018mol/L；pLAMA、TEMPO-OC和溴化亚铜的摩尔比优选为1：(1-1.5)：(1-1.5)，更优选为1：(1-1.2)：(1-1.1)；溴化亚铜和2,2'-联吡啶摩尔比优选为1：(1.5-2.5)，更优选为1：(2.1-2.3)。
步骤(1)中，乳糖酸活化的反应温度优选为45-70℃，更优选为55-70℃；活化反应时间优选为5-10h，更优选为8-10h；制备反应液A的反应温度优选为20-35℃，更优选为25-30℃；反应时间优选为6-12h，更优选为8-10h；
步骤(2)中，反应温度优选为15-30℃，更优选为18-23℃；反应时间优选为4-10h，更优选为4-8h；
步骤(3)中，TEMPO活化的反应温度优选为0-20℃，更优选为5-10℃；活化反应时间优选为15-35min，更优选为25-30min；制备产物G的反应温度优选为10-30℃，更优选为15-25℃；反应时间优选为6-24h，更优选为15-18h；
步骤(4)中，反应温度优选为30-70℃，更优选为50-60℃；反应时间优选为8-20h，更优选为12-15h。
疏水性药物与载药载体的质量比优选为1：(8-20)，更优选为1：(8-15)。
所述的疏水性药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱或索拉非尼。
一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体，应用于药物-载体递送系统中的主动靶向和智能超声控制释药。
本发明通过原子转移自由基聚合反应合成含有半乳糖残基的亲水聚合分子作为纳米载体的亲水端，可以特异性识别肝癌细胞上的去唾液酸糖蛋白受体，促进纳米载体被肝癌细胞内吞到细胞内，使纳米载体更高效聚集于肿瘤组织并被肿瘤细胞摄取。在超声刺激下，纳米载体在癌细胞内解体并快速释放所包载的抗癌药物，达到杀死癌细胞的效果。本发明可以有效增加癌细胞对纳米载体的摄取并且可以时空水平控制药物释放。实验结果表明，相对于人乳腺癌细胞MCF-7，人肝癌细胞Hep-G2可以更高剂量的摄取本发明载药载体。超声刺激后，本发明所述载药载体具有更显著的抗癌活性。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点：
(1)通过原子转移自由基聚合反应合成的亲水性聚合分子作为纳米载体的亲水端，亲水分子上的半乳糖残基不仅可以特异性识别肝癌细胞而且具有较好的生物相容性。
(2)通过单电子转移氮氧自由基偶合反应将亲、疏水分子偶联，得到超声敏感的化学键，赋予纳米载体在超声条件下的时空可控释药的特性。
(3)合成的载体可以包载多种疏水性抗肿瘤药物。
(4)本发明的主动靶向能力配以时空可控释药能力可以减少药物在血液循环中的泄露，增加肝癌细胞对载药载体的摄取快速提高肝癌细胞内抗癌药物浓度，快速杀伤癌细胞，减少癌细胞耐药性的产生。
本发明是由两亲性分子通过自组装形成的纳米载体，该纳米载体具有半乳糖残基包覆的亲水外壳和硬脂酸疏水核心。半乳糖残基所赋予载体的主动靶向能力配以超声敏感化学键的时空可控释药能力可以减少纳米载体中的药物在血液循环中的泄露，增加肝癌细胞对载药载体的摄取快速提高肝癌细胞内抗癌药物浓度，快速杀伤癌细胞，避免产生耐药性，因此本发明具有在生物医学材料领域的潜在应用价值。
附图说明
图1为实施例1中两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC的1H NMR图谱，其中：a为溶于DMSO-d6的pLAMA，b为溶于DMSO-d6的pLAMA-OC。
图2(a)为实施例2中不同浓度的pLAMA-OC空白胶束和Tween 80在3h的溶血率。
图2(b)为实施例2中不同浓度的pLAMA-OC空白胶束和Tween 80在6h的溶血率。
图3(a)为实施例2中不同浓度的pLAMA-OC空白胶束对COS-7细胞的毒性。
图3(b)为实施例2中不同浓度的pLAMA-OC空白胶束对HeLa细胞的毒性。
图3(c)为实施例2中不同浓度的pLAMA-OC空白胶束对MCF-7细胞的毒性。
图3(d)为实施例2中不同浓度的pLAMA-OC空白胶束对Hep-G2细胞(d)的毒性。
图4为实施例5中pLAMA-OC/DOX载药载体的透射电镜图。
图5(a)为实施例6中pLAMA-OC/DOX载药载体在pH 7.4溶液中的累积释药曲线。
图5(b)为实施例6中pLAMA-OC/DOX载药载体在pH5.0溶液中的累积释药曲线。
图6为不同细胞对pLAMA-OC/DOX载药载体摄取率；
图7为超声对Hep-G2细胞摄取pLAMA-OC/DOX载药载体的影响。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC的制备
乳糖酸1g溶于20mL无水甲醇中，然后加入0.2mL三氟乙酸，将温度升高至70℃反应6h。溶解完全后，将温度降至50℃进行旋蒸，除去三氟乙酸，再加入40mL无水甲醇溶解，溶液倒入250mL反应瓶中备用。将之前的反应液降至室温，加入0.78mL三乙胺，再加入2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐0.55g，在25℃避光条件下混合搅拌5h，反应结束后，旋蒸除去部分溶剂，其余的反应液用乙醚沉淀得到粗产物，得到的粗产物经过滤后用异丙醇洗涤三次，真空干燥过夜。
引发剂2-溴异丁酸乙酯(0.05mmol，7.35μL)和LAMA单体(2mmol，0.9396g)都在室温下溶于N-甲基吡咯烷酮(5mL)，混合溶液通过氮气鼓泡30min除去氧气。溴化亚铜(0.05mmol，0.007g)和2,2'-联吡啶(0.1mmol，0.016g)依次加入，得到的反应液再一次排除氧气，25℃、氮气保护下持续搅拌5h。反应溶液通过中性氧化铝柱去除体系中的溴化亚铜和2,2'-联吡啶。然后在异丙醇中沉淀，再用THF(20mL)洗涤纯化除去未反应的原料，得到粗产物在超纯水中透析48h(每12h换水一次，透析袋截留分子量3.5～4KDa)，冷冻干燥得到白色絮状固体。
TEMPO(6mmol 0.94g)，加吡啶(5mmol 0.4mL)溶于12mL二氯甲烷中，冰浴搅拌，反应30min。硬脂酰氯(5mmol 1.64mL)溶于12mL二氯甲烷,逐滴加入先前反应液中，常温搅拌，反应15h。反应液水洗5次，除去未反应的TEMPO。得到橘红色液体，40℃真空干燥，4℃储存，备用。
pLAMA 0.1mmol溶于50mL DMSO中，反应液中加入TEMPO-OC(0.15mmol 0.065g)，混合溶液通过氮气鼓泡30min除去氧气。溴化亚铜(0.15mmol，0.021g)和2,2'-联吡啶(0.3mmol，0.046g)依次加入，得到的反应液再一次排除氧气，60℃、氮气保护下持续搅拌24h。得到的反应液通过中性氧化铝柱去除体系中的溴化亚铜和2,2'-联吡啶，粗产物透析纯化，冷冻干燥得到两亲性共聚物。
得到的两亲性嵌段共聚物以含半乳糖残基的聚合物分子作为亲水端，以硬脂酸分子作为疏水端，该分子结构如下所示：
实施例2氢谱表征
将实施例1制备得到的pLAMA-OC溶于氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)中，通过核磁共振(1H NMR)进行结构验证。
结果如图1所示，比较pLAMA(a,DMSO-d6)和pLAMA-OC(b，DMSO-d6)的核磁图谱，在pLAMA-OC的图谱中出现了新的核磁峰：δ1.86ppm对应四甲基哌啶上-CH2-特征峰，δ1.1ppm对应硬脂酸上-CH2特征峰，δ0.95ppm应硬脂酸上-CH3特征峰。经过核磁图谱对比可知已成功合成了具有肝靶向和超声响应功能的两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC。
实施例3pLAMA-OC胶束的生物相容性分析
空白纳米载体的生物相容性分析由红细胞溶血实验和MTT细胞毒性试验进行检测。
红细胞溶血实验步骤如下。无菌脱纤维绵羊血加入一定量肝素进行抗凝，PBS清洗无菌脱纤维绵羊血以获得完整红细胞，然后用PBS配制浓度约为2％(v/v)红细胞悬液。以无菌去离子水和PBS分别作为阳性和阴性对照，将1mL2％的红细胞悬液分别与1mL不同浓度的pLAMA-OC胶束和Tween 80溶液混合使其终浓度为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL，将混合液在37℃、180rpm恒温摇床中孵育3h或6h后离心去除完整的红细胞，利用酶标仪测量上清液545nm处的吸光值，利用下列等式计算溶血率。
溶血率＝(Atest-Aneg)/(Apos-Aneg)×100％值，式中Atest、Aneg及Apos分别表示测试组吸光值、阴性对照(PBS)吸光值及阳性对照(水)吸光值。
Tween 80是食品药品领域中常用的表面活性剂，本发明中以其作为对照组评估纳米载体的溶血性。样品分别与红细胞作用3h或6h，结果如图2。对于本发明所述纳米载体，其引起的红细胞溶血率均低于5％。因此本发明合成的纳米载体表现了良好的生物相容性。
细胞毒性试验步骤如下：
采用MTT细胞毒性实验评估空胶束对人肝癌细胞Hep-G2、人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞HeLa及猴肾成纤维细胞COS-7(正常非癌细胞)的毒性。首先将细胞从培养瓶吹下，然后用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释至1×105个/mL，然后将细胞悬液接种到96孔板中，将96孔板转入细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h，将每孔中的细胞培养液更换为100μL含不同浓度的空胶束培养液继续培养48h，以空培养基作为阴性对照，只加培养基不加胶束作为阳性对照。然后将每孔中的培养液更换为100μL MTT溶液(0.5mg/mL)，在培养箱中继续孵育4h，移除MTT溶液，加入100μL DMSO溶解孔中的紫色甲瓒结晶，然后置于酶标仪下检测吸光度值，设定发射波长分别为570nm和630nm，细胞存活率就是实验组孔中的吸光度值占控制组孔中吸光度值的百分比。计算公式如下：
细胞存活率＝((Atest-Aneg)/(Apos-Aneg)×100％
式中Atest、Aneg及Apos分别表示测试组吸光值、阴性对照(PBS)吸光值及阳性对照吸光值。
考察三种不同浓度的pLAMA-OC胶束对这3种癌细胞及1种正常细胞存活率的影响。结果如图3所示，当胶束浓度小于500μg/mL时，4种细胞存活率均高于85％，说明本发明纳米载体生物相容性良好，对细胞基本无毒。
实施例4pLAMA-OC/DOX载药载体的制备
首先制备脱盐酸阿霉素。然后称取一定量的pLAMA-OC纳米材料溶于DMSO中使其终浓度达到5mg/mL，将脱盐酸之后的DOX与载体材料按照1:10的质量比混合，将混合溶液置于37℃恒温摇床中使其混合均匀，将最终的混合液转入透析袋(MWCO 10000)中用大量去离子水透析约48h，接着用8μm的滤膜过滤以除去杂质即获得载药载体溶液。冷冻干燥后即得pLAMA-OC/DOX载药载体。
实施例5pLAMA-OC/DOX载药载体的透射电镜图
将实施例4制备的pLAMA-OC/DOX载药载体，并配制成一定浓度的水溶液，滴于碳支持铜网上自然风干，通过投射电子显微镜观察其形态。由图4可以看到pLAMA-OC/DOX载药载体呈单分散球形，粒径在116nm左右。
实施例6pLAMA-OC/DOX载药载体的体外药物释放实验
首先分别称取实施例4制备的一定量冻干后pLAMA-OC/DOX载药纳米粒，使DOX含量为0.2mg，然后将其溶于2mL PBS(10mM,pH 7.4或pH 5.0)中，分别设置超声处理组(超声条件：1.0MHz，9.9W，30min)、无超声刺激组及free DOX组。将处理好的胶束转入透析袋(MWCO3500-4500)中，将透析袋分别浸没于100mL PBS(10mM,pH 7.4或pH 5.0)溶液中，37℃恒温避光磁力搅拌，在0min，30min，1h，2h，3h，5h，7h，9h，12h，24h，48h时取出2mL PBS并加入2mL新鲜的PBS溶液，取出的PBS溶液用荧光分光光度计(Perkin Elmer LS-55)进行DOX的荧光检测，得到本发明载药载体的药物积累释放曲线。
由图5(a)和图5(b)可知，超声刺激后的载药载体累积释药量比未超声刺激的载药载体约提高30％，说明载药载体对超声具有响应行为，超声作用可以使载药载体快速释放出抗癌药。比较不同pH环境的载药载体释药量，则可以发现载药载体在酸性环境中的累积释药量稍高于中性环境中，提高10％左右，这说明本发明中的纳米载药载体在血液循环过程中的具有相对稳定性和安全性，在肿瘤的酸性环境下给予超声刺激后可以快速释药，给予癌细胞快速高强度的打击。
实施例7pLAMA-OC/DOX肝癌细胞靶向能力检测
将对数期Hep-G2细胞和MCF-7细胞吹下后用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释至1×105个/mL，接种细胞悬液到6孔板中，每孔中加入2mL，将6孔板转入细胞培养箱(37℃,5％CO2)中培养24h，然后将培养皿中的培养液更换为2mL游离DOX的DMEM溶液或载药载体的DMEM溶液，使培养液中DOX终浓度为10μg/mL，转入细胞培养箱(37℃,5％CO2)中继续培养4h，然后移去培养基，用PBS洗3次以除去未被细胞摄取的药物，每孔加入2mL胰酶消化细胞，倒置显微镜下观察，待细胞逐渐脱离底面稍微变圆后吸出胰酶，每孔加入1mL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，吹打收集细胞至1.5mL离心管中，将离心管转入离心机中在1000rpm下离心5min收集细胞，用PBS洗三次后用400μL PBS重悬细胞，过300目尼龙网后使用流式细胞仪检测胞内荧光强度。
图6可以看出MCF-7细胞的载药载体摄取率为4.3％，Hep-G2细胞的载药载体束摄取率为92％。相对于MCF-7细胞，Hep-G2细胞对载药载体的摄取显著提高，所以本发明中的pLAMA-OC/DOX载药载体对肝癌细胞具有更高的亲和性。由图7可以看出，相较于未进行超声刺激的Hep-G2细胞，进行超声刺激后的Hep-G2细胞内荧光更强，说明载药载体对超声有响应，可以将包载的DOX快速释放出来进而增强了肝癌细胞内的荧光强度。
实施例8pLAMA-OC/DOX载药载体细胞毒性实验
实验步骤参照实施例3中MTT细胞毒性实验。将对数期的Hep-G2细胞、MCF-7细胞接种于96孔板上。设置pLAMA-OC/DOX载药载体无超声处理组，pLAMA-OC/DOX载药载体超声处理组(超声条件：1.0MHz，9.9W，5min)，free DOX处理组，阴性对照组，阳性对照组。
本发明载药载体的抗癌活性以半抑制浓度(IC50)进行定量表征。
表1是free DOX以及不同处理方式载药载体对Hep-G2细胞、MCF-7细胞的IC50值。由表1中可以看出本发明中的载药载体对Hep-G2细胞的毒性高于MCF-7细胞，这主要是因为本发明载药载体对去唾液酸糖蛋白受体高表达的Hep-G2细胞具有更高的亲和性，可以更多的被该细胞摄取。
表1free DOX以及不同处理方式载药载体对Hep-G2细胞、MCF-7细胞的IC50值
对于Hep-G2细胞超声处理的载药载体IC50为6.61μg/mL，而未超声处理的载药载体IC50为38.80μg/mL。表明超声可以使药物释放从而提高载药载体的毒性。对于MCF-7细胞，完整的载药载体难以被其摄取。但是超声可以作用于细胞周围的载药载体，使其释放出抗癌药物。小分子抗癌药物进入到细胞内发挥抗癌功效，所以毒性高于未超声刺激的载药载体。
本实验说明本发明的载药载体pLAMA-OC/DOX对肝癌细胞具更有效的杀伤能力。超声可以刺激载药载体释放抗肿瘤药物，提高载药载体抗肿瘤活性。

Claims (10)

1.一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体，其特征在于，该载药载体由两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC构成，以含半乳糖残基的聚合物分子作为亲水外壳，以硬脂酸分子作为疏水核心，疏水性药物通过疏水作用包载于载药载体的疏水核心中；当亲水外壳的聚合物分子与疏水核心的疏水分子偶联时形成超声敏感化学键，使载药载体具有超声响应释药功能；所述的载药载体的分子结构如下所示：
其中：m表示亲水链长度，为1-100的整数。
2.一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，其特征在于，先制备两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC，用去离子水将pLAMA-OC和疏水性药物配成混合溶液，pLAMA-OC在混合溶液中自组装形成纳米载体，疏水性药物通过疏水作用包载于载药载体的疏水核心中；混合溶液经透析、冷冻干燥后，使载药载体负载药物；其中，疏水性药物与pLAMA-OC的质量比为1：(5-30)；
两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC的制备方法：首先合成甲基丙烯酸2(-N-乳糖酰胺)乙酯LAMA单体，然后通过原子转移自由基聚合反应将LAMA分子聚合形成含半乳糖残基的亲水聚合物pLAMA，硬脂酰氯和4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基TEMPO反应形成疏水分子TEMPO-OC，最后通过单电子转移氮氧自由基偶合反应将亲水端与疏水端偶联，形成两亲性嵌段共聚物pLAMA-OC；具体步骤如下：
(1)合成LAMA单体
将乳糖酸溶于无水甲醇，然后加入三氟乙酸TFA，30-90℃条件下反应4-12h，对乳糖酸进行活化，得到活化液；将活化液冷却至室温，加入三乙胺和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐，10-55℃避光条件下反应6-24h，得到反应液A；旋蒸除去反应液A中的部分溶剂，旋蒸后反应液A用乙醚沉淀获得粗产物，粗产物过滤后，用异丙醇洗涤，真空干燥，得到LAMA单体；
(2)合成pLAMA
将步骤(1)得到的LAMA单体与引发剂2-溴异丁酸乙酯于室温下溶解于N-甲基吡咯烷酮中，得到混合溶液B；混合溶液B通过氮气鼓泡除去溶液中的氧气；将溴化亚铜和2,2'-联吡啶依次加入混合溶液B中，得到反应液C；对反应液C通过氮气鼓泡除去氧气，在15-45℃、氮气保护条件下，反应2-12h，得到产物D；产物D经透析纯化、冷冻干燥，得到pLAMA；
(3)合成TEMPO-OC
将4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基TEMPO溶于二氯甲烷中，加入吡啶，对TEMPO进行活化，0-30℃条件下反应15-50min，得到反应液E；将硬脂酰氯溶于二氯甲烷中得到混合溶液F，将混合溶液F逐滴加入到反应液E中，10-45℃条件下反应6-36h，得到产物G；产物G通过水洗、真空干燥，得到TEMPO-OC；
(4)合成pLAMA-OC
将步骤(2)得到的pLAMA溶于DMSO中得到混合液H，向混合液H加入步骤(3)得到的TEMPO-OC，得到混合液I，对混合溶液I通过氮气鼓泡除去氧气；再向除氧后的混合溶液I中依次加入溴化亚铜和2,2'-联吡啶，得到反应液J；对反应液J通过氮气鼓泡除去氧气，30-90℃、氮气保护条件下搅拌反应8-36h，得到反应液K；反应液K通过中性氧化铝柱去除体系中的铜离子复合物，用甲醇沉淀得到粗产物，将粗产物透析纯化、冷冻干燥，得到两亲性共聚物pLAMA-OC；
其中：
步骤(1)中，乳糖酸在甲醇中的浓度为0.01-0.05mol/L；乳糖酸和TFA摩尔比为1：(0.05-0.25)；乳糖酸、2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐和三乙胺的摩尔比为1：(0.8-2)：(0.025-0.25)；
步骤(2)中，LAMA单体在N-甲基吡咯烷酮中的浓度为0.05-0.1mol/L；2-溴异丁酸乙酯、LAMA和溴化亚铜的摩尔比为1：(1-100)：(1-2)；溴化亚铜和2,2'-联吡啶摩尔比为1：(1-3)；
步骤(3)中，TEMPO在二氯甲烷中的浓度为0.5-1.5mol/L；硬脂酰氯、吡啶和TEMPO的摩尔比为1：(1.5-3)：(0.9-2.5)；
步骤(4)中，pLAMA在DMSO中的浓度为0.001-0.002mol/L；pLAMA、TEMPO-OC和溴化亚铜的摩尔比为1:(0.8-2)：(0.8-2)；溴化亚铜和2,2'-联吡啶摩尔比为1：(1-3)；
反应如下式所示：
3.根据权利要求2所述的一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，乳糖酸在甲醇中的浓度为0.02-0.03mol/L；乳糖酸和TFA摩尔比为1：(0.1-0.15)；乳糖酸、2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐和三乙胺的摩尔比为1：(1.1-1.3)：(0.1-0.2)；
步骤(2)中，LAMA单体在N-甲基吡咯烷酮中的浓度为0.07-0.09mol/L；2-溴异丁酸乙酯、LAMA和溴化亚铜的摩尔比为1：(25-55)：(1-1.1)；溴化亚铜和2,2'-联吡啶摩尔比为1：(2.1-2.3)；
步骤(3)中，TEMPO在二氯甲烷中的浓度为0.8-1.2mol/L；硬脂酰氯、吡啶和TEMPO的摩尔比为1：(1.8-2.0)：(1.2-1.8)；
步骤(4)中，pLAMA在DMSO中的浓度为0.0015-0.0018mol/L；pLAMA、TEMPO-OC和溴化亚铜的摩尔比为1：(1-1.2)：(1-1.1)；溴化亚铜和2,2'-联吡啶摩尔比为1：(2.1-2.3)。
4.根据权利要求2或3所述的一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，乳糖酸活化的反应温度为55-70℃；活化反应时间为8-10h；制备反应液A的反应温度为25-30℃；反应时间为8-10h；
步骤(2)中，反应温度为18-23℃；反应时间为4-8h；
步骤(3)中，TEMPO活化的反应温度为5-10℃；活化反应时间为25-30min；制备产物G的反应温度为15-25℃；反应时间为15-18h；
步骤(4)中，反应温度为50-60℃；反应时间为12-15h。
5.根据权利要求2或3所述的一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，其特征在于，疏水性药物与载药载体的质量比为1：(8-15)。
6.根据权利要求4所述的一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，其特征在于，疏水性药物与载药载体的质量比为1：(8-15)。
7.根据权利要求2、3或6所述的一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，其特征在于，所述的疏水性药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱或索拉非尼。
8.根据权利要求4所述的一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，其特征在于，所述的疏水性药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱或索拉非尼。
9.根据权利要求5所述的一种肝靶向智能超声响应释药的载药载体的制备方法，其特征在于，所述的疏水性药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱或索拉非尼。
10.如权利要求2、3、6、8或9所述的制备方法制备得到的肝靶向智能超声响应释药的载药载体，应用于药物-载体递送系统中的主动靶向和智能超声控制释药。
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