CN108588132A

CN108588132A - 一种生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法

Info

Publication number: CN108588132A
Application number: CN201810349629.5A
Authority: CN
Inventors: 张小里; 李冰麟; 王姣; 李环宇; 段丹丹; 于文宇; 赵彬侠; 李彬
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明提供了一种生产磷脂酰基γ‑羟基丁酸的方法，包括步骤：1)将磷脂吸附于载体表面，得吸附了磷脂的载体；2)以吸附了磷脂的载体与γ‑羟基丁酸和/或γ‑羟基丁酸钠在磷脂酶D催化下进行水‑固表面磷脂酰基转移反应，合成磷脂酰基γ‑羟基丁酸；3)洗脱剂洗脱吸附在载体上的磷脂酰基γ‑羟基丁酸，得到磷脂酰基γ‑羟基丁酸。本发明提供的生产磷脂酰基γ‑羟基丁酸的方法，采用在水‑固反应体系中通过磷脂酰基化转移合成PB，避免了大量有毒有机溶剂的使用，降低了产品溶剂残留，使反应过程更绿色安全。

Description

一种生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法

技术领域

本发明属于磷脂类物质合成技术领域，涉及一种生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法。

背景技术

γ-羟基丁酸，又称4-羟基丁酸(简称GHB或4HB)。它能促进生长素释放并对中枢神经系统有较强的抑制作用，是一种二类精神药物。临床上可将它作为麻醉剂和催眠剂用于手术操作。研究表明，GHB在体内被代谢为水和二氧化碳，毒性小，安全范围大。作为静脉麻醉药物具有术后平稳，恢复期短，并发症少等优点。因此，GHB在医学上有很重要的应用潜力。然而GHB是一种低效能的静脉麻醉剂，消除动力学研究表明，GHB摄入后的吸收和消除都非常迅速，很少有蓄积作用，导致它在手术中的麻醉时间过短。所以，GHB并不能单独使用，只能作为附加麻醉剂和催眠剂应用。因此，采取相应手段对GHB进行前体药物结构设计，通过体内释放控制它的消除速率，延长麻醉时效是十分重要的。

磷脂是构成生物膜的基础组成物质，含有两条疏水的脂肪酸链和亲水的功能性头部基团，具有很高的脂溶性，能够迅速穿过血脑屏障而被吸收。因而，以磷脂酰基与GHB结合生成的磷脂酰基γ-羟基丁酸(PB)可望作为药物前体输送γ-羟基丁酸摄入人体，并通过体内代谢缓慢分解而释放出GHB，对GHB有一定蓄积作用。故可将磷脂酰基γ-羟基丁酸作为GHB的前体药物来弥补其麻醉时效过短的不足。因此，PB合成是是重要的药物制备技术。。韩国学者曾报道以磷脂酶D(phospholipase D，PLD)催化的磷脂酰基转移反应合成PB，反应在双液相体系中进行[Lee和Choi,1996]。有机溶媒-水双液相磷脂酰基转移反应体系最大的缺陷是产物收率较低，分离困难，且使用大量有毒有机溶剂，会使产品产生有溶剂残留而增加安全隐患。因此，有必要对磷脂酶D催化合成PB的生产工艺进行改进，探索一种在保证获得高纯度产品的同时，也能避免在合成过程中使用有机溶剂的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，以达到提高PB产率的同时还能够避免反应过程中有机溶剂的使用，以便降低生产成本，确保产品安全。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，包括步骤：

1)将磷脂吸附于载体表面，得吸附了磷脂的载体；

2)以吸附了磷脂的载体与γ-羟基丁酸和/或γ-羟基丁酸盐在磷脂酶D催化下进行水-固表面磷脂酰基转移反应，合成磷脂酰基γ-羟基丁酸；所述磷脂酶D为具有磷脂酰基转移活力的磷脂酶D；

3)洗脱剂洗脱吸附在载体上的磷脂酰基γ-羟基丁酸，得到磷脂酰基γ-羟基丁酸。

优选地，所述磷脂酶D来源于卷心菜、链霉菌菌株或分子改造获得的磷脂酶D。

优选地，在步骤1)中，所述磷脂为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)和卵磷脂中的一种或多种。

进一步优选地，所述磷脂为PC-90。

优选地，在步骤1)中，所述载体为纳米二氧化硅、介孔硅胶、硫酸钙、纤维素微晶和活性炭粒子中的一种或多种。

进一步优选地，所述载体为纳米二氧化硅。

优选地，在步骤1)中，先把磷脂的有机溶液和载体混合后搅拌，再加入沉淀剂并搅拌，分离得到吸附了磷脂的载体。

进一步优选地，所述沉淀剂为丙酮。

优选地，在步骤1)中，制备表面活性剂修饰的载体，然后在水溶液中将磷脂吸附于表面活性剂修饰的载体表面，得到吸附了磷脂的载体的水基混合物；吸附了磷脂的载体的水基混合物直接用于步骤2)的反应。

进一步优选地，所述表面活性剂为曲拉通100、脱氧胆酸钠和胆酸钠中的一种或多种；表面活性剂与载体之间共价结合。

优选地，在步骤1)中，磷脂与载体的质量比为(0.01～1.75):1。

进一步优选地，磷脂与载体的质量比为0.5:1。

优选地，在步骤2)中，水-固表面磷脂酰基转移反应的水相为醋酸缓冲液，pH＝4.0～7.0。

进一步优选地，醋酸缓冲液的pH＝5.5。

优选地，在步骤2)中，水-固表面磷脂酰基转移反应的温度为20～40℃。

进一步优选地，水-固表面磷脂酰基转移反应的温度为35℃。

优选地，在步骤2)中，按照摩尔量计，γ-羟基丁酸和/或γ-羟基丁酸钠：磷脂＝(10～300)：1。

进一步优选地，在步骤2)中，按照摩尔量计，γ-羟基丁酸和/或γ-羟基丁酸钠：磷脂＝60：1。

优选地，在步骤1)中，水-固表面磷脂酰基转移反应完成后，固液分离获得水溶液；所得水溶液循环套用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，采用在水-固反应体系中通过磷脂酰基化转移合成PB，避免了大量有毒有机溶剂的使用，降低了产品溶剂残留，使反应过程更绿色安全。

进一步地，在相同的条件下，本发明的方法制得的磷脂酰基γ-羟基丁酸，较现有的反应体系，其产率更高，可达97.13％，远高于现有技术的72.64％。

进一步地，水-固表面磷脂酰基转移反应完成后，固液分离获得水溶液；所得水溶液循环套用。如此可以将游离酶回收后重复使用，降低生产成本。

附图说明

图1是不同反应pH值对水-固表面磷脂酰基转移反应的影响图。

图2是不同反应温度对水-固表面磷脂酰基转移反应的影像图。

图3是不同的PC覆盖度对水-固表面磷脂酰基转移反应的影响图。

图4是不同反应体系游离酶操作稳定性的对比图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

我们首次采用水-固反应体系来生产PB，即将磷脂负载在载体表面上，然后在含γ-羟基丁酸钠的纯水相中反应，使反应发生在固-液接触相界面上，从而大大增加反应的有效界面，提高反应效率。同时，在反应界面上创造一个疏水的微环境，最大程度降低了水解反应，获得高纯度产品；此外，也避免了产品中有机溶剂残留的污染，为磷脂的生产和应用提供参考价值。

实施例1：

10mg的磷脂加入到4mL的缓冲溶液中，超声震荡15min后，再在磁力搅拌器搅拌4h后加入20mg制备好的表面TritonX-100修饰过、含量为5.34×10^-9mol_TritonX-100/g的纳米二氧化硅粒子，在室温、400rpm下搅拌70min；然后向上述得到的混合溶液中加入20mg的γ-羟基丁酸钠，调节溶液pH为5.5，再加入1mL的磷脂酶D(本申请所使用的磷脂酶D为采用常规方法自制，在本申请的实际使用中，为了便于各组数据的比较，选用同一批次的磷脂酶D，测得该批次的磷脂酶D的浓度为7.73U/mL。在其他实验中证实，当磷脂酶D的浓度大于4U/mL时，均可以达成类似的效果)，在400rpm，35℃下搅拌反应6h后离心收集沉淀。

用蒸馏水洗涤沉淀数次(直至上清液中没有酶)，用洗脱剂(氯仿：甲醇＝1：1)萃取吸附在载体上的磷脂，得到的洗脱液取样分析最后通过旋转蒸发仪蒸发去除溶剂收集固体产品PB。

反应后PB产率为98.74％

实施例2：

将20mg的纳米二氧化硅载体加入到含有PC-90浓度为10mg/mL的1mL的乙酸乙酯溶液中，室温下，搅拌60～120min。再向上述溶液中滴加1mL丙酮并搅拌，滴加完毕后，继续在搅拌下沉淀60～120min，最后离心收集沉淀，得到吸附有PC-90的固相粒子。

蒸馏水洗涤沉淀后悬浮在0.6mL含有20mg的γ-羟基丁酸钠的醋酸缓冲液(0.2MpH5.5)中，加入1mL的磷脂酶D，调节溶液pH为5.5，在400rpm，35℃下搅拌反应6h后离心收集沉淀。

蒸馏水洗涤沉淀数次(直至上清液中没有酶)，再用洗脱剂(氯仿：甲醇＝1：1)萃取吸附在载体上的磷脂，得到的洗脱液取样分析最后通过旋转蒸发仪蒸发去除溶剂收集固体产品PB。

反应后PB产率为97.13％

实施例3：

分别将20mg的纳米二氧化硅、硅胶G、硫酸钙、纤维素微晶、活性炭载体加入到含有PC-90浓度为10mg/mL的1mL的乙酸乙酯溶液中，室温下，搅拌60～120min，使PC吸附在载体上。向上述溶液中滴加1mL丙酮并搅拌，滴加完毕后，继续在搅拌下沉淀60～120min，最后离心收集沉淀。

实施例1～3的结果展示在表1中：

表1是不同载体对水-固表面磷脂酰基转移反应的影响

表1是不同载体对水-固表面磷脂酰基转移反应的影响，比表面积是影响载体在催化反应中的最重要因素之一。载体比表面积的增加可以增加底物与酶的接触面积，从而提高催化效率。从表1中可以看出活性炭虽然具有最大的比表面积，但由于孔径太小PC在沉淀的过程中容易发生堵塞导致PC发生聚集，阻碍了PLD进入孔道。同时，载体表面的性质也是影响转磷脂酰基化反应的一个重要因素，而活性炭表面有低亲水性基团使得它在水溶液中的分散性很差，PC与PLD之间的接触更加困难，因此活性炭作为载体时基本不发生反应。硫酸钙和纤维素微晶作为载体时副产物磷脂酸(PA)的量太高。而对于纳米二氧化硅和硅胶G这样具有中度亲水性的硅基载体，因为它们表面有丰富的硅烷醇基(Si-OH)有助于它们在水相中的分散和对PLD的吸附，降低了PLD的扩散阻力，且它们具有很大的比表面积有利于反应的发生，故而PB的产率高，对水解反应也有一定的抑制作用。而纳米二氧化硅较硅胶G可以认为是无孔粒子，PC吸附在粒子表面，这样对于动力学控制的反应来说首先消除了内扩散，其次它的粒径很小，在搅拌过程中与酶分子发生的有效碰撞就变多从而加快了反应速率，因此对纳米二氧化硅载体来说，反应速率更快，反应时间更短，副产物PA越少。

实施例4：

分别将5份20mg的纳米二氧化硅载体加入到含有PC-90浓度为10mg/mL的1mL的乙酸乙酯溶液中，室温下，搅拌60～120min。分别向上述溶液中滴加1mL丙酮并搅拌，滴加完毕后，继续在搅拌下沉淀60～120min，最后离心收集沉淀。

蒸馏水洗涤沉淀后，分别悬浮在0.6mL含有20mg的γ-羟基丁酸钠的浓度为0.2M、pH分别为4.0、5.0、5.5、6.0、7.0的醋酸缓冲液中，并调节溶液为相应pH，再分别加入1mL的磷脂酶D(相应pH为4.0、5.0、5.5、6.0或7.0)，在400rpm，35℃下搅拌反应6h后离心收集沉淀。

蒸馏水洗涤沉淀数次(直至上清液中没有酶)，再用洗脱剂(氯仿：甲醇＝1：1)萃取吸附在载体上的磷脂，得到的洗脱液取样分析最后通过旋转蒸发仪蒸发去除溶剂收集固体产品PB。实验结果展示在图1中。

图1是pH对水-固表面磷脂酰基转移反应的影响，pH值对酶活性和稳定性有非常重要的影响，酶催化反应需要特定的pH条件，否则会导致反应不发生或有副产物产生。由图1可以看出当pH＝5.5时酶的活性达到最佳，PC反应完全，同时对水解反应有所抑制。总体而言，对于水-固反应体系，PLD对pH的耐受性很高，pH在4～7的范围内，均达到较高的PB产率。这是由于载体纳米二氧化硅表面存在不同键合状态的羟基充当离子交换剂，可视为“固体”缓冲液，在载体与水接触表面产生缓冲作用。显然，对水-固反应体系而言pH的耐受性更好，这对PB的生产具有十分重要的意义。同时也可以看出，随着pH的增加，副产物PA的产率也增加，碱性条件下，羟基相对数量增多，更有利于水解。

实施例5：

用蒸馏水洗涤沉淀后，分别悬浮在0.6mL含有20mg的γ-羟基丁酸钠的浓度为0.2M，pH为5.5的醋酸缓冲液中，调节溶液pH为5.5，再分别加入1mL的磷脂酶D，分别在20、25、30、35或40℃，400rpm下搅拌反应6h后离心收集沉淀。

蒸馏水洗涤沉淀数次(直至上清液中没有酶)，再用洗脱剂(氯仿：甲醇＝1：1)萃取吸附在载体上的磷脂，得到的洗脱液取样分析最后通过旋转蒸发仪蒸发去除溶剂收集固体产品PB。实验结果展示在图2中。

图2是温度对水-固表面磷脂酰基转移反应的影响。温度影响酶活性，从而影响酶的磷脂酰基转移效率和水解效率。由图2可以看出在35℃时PC基本反应完全，PB的产率高达97.13％，同时PA的产率仅有2.2％，此时酶的磷脂酰基转移效率达到最高，也可以看出在35℃时对酶的水解效率有一定的抑制作用。

实施例6：

分别将20mg的纳米二氧化硅载体加入到含有PC-90浓度为2、4、6、7、10、12、15、20、25、30、35mg/mL的1mL的乙酸乙酯溶液中，对应PC与纳米二氧化硅质量比即m_PC/m_{纳米二氧化硅}分别为0.1、0.2、0.3、0.35、0.5、0.6、0.75、1、1.25、1.5、1.75g/g，室温下，搅拌60～120min。分别向上述溶液中滴加1mL丙酮并搅拌，滴加完毕后，继续在搅拌下沉淀60～120min，最后离心收集沉淀，得到吸附有PC-90的固相粒子。

用蒸馏水洗涤沉淀后，分别悬浮在0.6mL含有20mg的γ-羟基丁酸钠的浓度为0.2M，pH为5.5的醋酸缓冲液中，调节溶液pH为5.5，再分别加入1mL的磷脂酶D，分别在20、25、30、35、40℃，400rpm下搅拌反应6h后离心收集沉淀。

蒸馏水洗涤沉淀数次(直至上清液中没有酶)，再用洗脱剂(氯仿：甲醇＝1：1)萃取吸附在载体上的磷脂，得到的洗脱液取样分析最后通过旋转蒸发仪蒸发去除溶剂收集固体产品PB。实验结果展示在图3中。

PC与载体的质量比定义为PC覆盖度，图3是PC覆盖度对水-固表面磷脂酰基转移反应的影响，通过不同覆盖度下PB的产率曲线可以认为，在低PC覆盖度下，PC分散在载体表面上，降低多层吸附发生的可能，PLD几乎可与所有底物充分接触进行反应。随着PC覆盖度的增加，PC在纳米二氧化硅表面可能形成多层吸附，此时，PLD仅能与吸附在最外层的底物接触进行反应，从而使PB产率逐渐降低。考虑到PC的价格昂贵，为避免原料的浪费，因此，优选适当的PC覆盖度，即PC覆盖度低于0.5g/g。

实施例7

分别将6份20mg的纳米二氧化硅载体加入到含有PC-90浓度为10mg/mL的1mL的乙酸乙酯溶液中，室温下，搅拌60～120min。分别向上述溶液中滴加1mL丙酮并搅拌，滴加完毕后，继续在搅拌下沉淀60～120min，最后离心收集沉淀。

用蒸馏水洗涤沉淀后，分别悬浮在0.6mL含有15、25、50、100、150、200、250、500mg的γ-羟基丁酸钠的浓度为0.2M、pH为5.5的醋酸缓冲液中，调节溶液pH为5.5，再分别加入1mL的磷脂酶D，分别在35℃，400rpm下搅拌反应6h后离心收集沉淀。

实施例8：

由3.2mL溶解有10mgPC-90的二氯甲烷溶液；0.6mL溶解有20mg的γ-羟基丁酸钠和1mL PLD的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2M pH5.5)组成的反应物在35℃，400rpm下反应6h。反应后提取上层有机相，取样分析。

实验结果展示在表2中。

表2：不同反应体系对磷脂酰基转移反应的影响

表2是两种不同反应体系对磷脂酰基转移反应的影响，对两种反应体系做出比较，可以看出相较液-液反应体系，水-固反应体系明显更有利于磷脂酰基转移反应的发生，同时对水解反应有一定的抑制作用，从水解产物PA的产率来看，液-液反应体系更有利于副反应的发生。

实施例9：

该实施例与实施例2的区别在于将反应后的游离酶PLD溶液收集用于下一批次的反应，如此重复循环利用游离酶。

对比例9：

该实施例与实施例6的区别在于将反应后的游离酶PLD溶液收集用于下一批次的反应，如此重复循环利用游离酶。

实施例9和对比例9的实验结果展示在图4中。

图4是游离酶的操作稳定性比较，生物催化剂的可重复利用是降低生产成本的一个重要因素。通常具有高催化活性的游离酶易失活很难进行循环使用，如果游离酶能够重复利用则更有利于生产的可持续发展。如图4所示为最优条件下对两种反应体系的游离酶操作稳定性进行比较。结果表明，较水-固反应体系，传统的液-液反应体系中，由于使用了不溶于酶的有机疏水性介质，而有机相会使酶发生聚集严重影响酶的扩散，导致酶活性降低和差的稳定性。同时，水相中副产物胆碱的积累也是抑制反应的一个重要原因。

Claims

1.一种生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括步骤：

1)将磷脂吸附于载体表面，得吸附了磷脂的载体；

2.如权利要求1所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和卵磷脂中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述磷脂酶D来源于卷心菜、链霉菌菌株或分子改造获得的磷脂酶D。

4.如权利要求1所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述载体为二氧化硅、硅胶、硫酸钙、纤维素微晶和活性炭粒子中的一种或多种。

5.如权利要求1所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，在步骤1)中，磷脂通过如下两种方法之一吸附于载体表面：

方法一：磷脂溶于有机溶剂后与载体混合搅拌，再加入沉淀剂并搅拌，分离得到吸附了磷脂的载体；

方法二、制备表面活性剂修饰的载体，然后在水溶液中将磷脂吸附于表面活性剂修饰的载体表面，得到吸附了磷脂的载体的水基混合物；吸附了磷脂的载体的水基混合物直接用于步骤2)的反应。

6.如权利要求5所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，所述表面活性剂为曲拉通100、脱氧胆酸钠和胆酸钠中的一种或多种；表面活性剂与载体之间共价结合。

7.如权利要求1所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，在步骤1)中，磷脂与载体的质量比为(0.01～1.75):1。

8.如权利要求1所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，在步骤2)中，水-固表面磷脂酰基转移反应的水相为醋酸缓冲液，pH＝4.0～7.0。

9.如权利要求1所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，在步骤2)中，水-固表面磷脂酰基转移反应的温度为20～40℃。

10.如权利要求1所述的生产磷脂酰基γ-羟基丁酸的方法，其特征在于，在步骤2)中，按照摩尔量计，γ-羟基丁酸和/或γ-羟基丁酸盐：磷脂＝(10～300)：1。