CN108588042A - 乳糖在提高重组菌表达CbFDH酶的稳定性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乳糖在提高重组菌表达CbFDH酶的稳定性中的应用，通过将乳糖添加至表达CbFDH酶的重组菌的发酵培养基中进行发酵培养实现。本发明首次公开了乳糖在提高甲酸脱氢酶活性和稳定性中所起的特殊作用；通过发明人的实际实验，在培养表达CbFDH酶重组菌的过程中，向发酵培养基中加入特定浓度的乳糖后，CbFDH酶活力较常规诱导培养基提高了11.9倍，同时稳定性也得到大幅提升。

Description

乳糖在提高重组菌表达CbFDH酶的稳定性中的应用
技术领域
本发明涉及乳糖在提高重组菌表达CbFDH酶的稳定性中的应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
甲酸脱氢酶(Formate Dehydrogenase,FDH)在辅酶再生中的应用已成为辅酶酶法再生研究领域的热点之一。甲酸/甲酸脱氢酶体系是最成功的再生系统，并已应用于工业生产。其优势在于反应不可逆，甲酸价格低廉且很多酶对此有很高的耐受性。此反应只产生一种副产物—CO2，而CO2对任何酶的活性均没有任何影响，且反应完全，同时CO2作为一种气体，很容易从反应体系中逃逸出来。
甲酸脱氢酶(FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类，根据四级结构、辅基的构象和类型以及底物特异性的区别，分为几种不同的类型，其中很重要的一类就是NAD+依赖型的甲酸脱氢酶，他可以将甲酸氧化为CO2，同时将NAD+还原为NADH。该类型的甲酸脱氢酶由2个相同的亚基组成，不包含金属离子和辅基，并且对甲酸和NAD+具有高度的转移性。NAD+依赖型FDH催化过程的一个显著特征是来自底物的氢离子直接转移到NAD+的烟碱C4原子上，无需酸碱催化步骤。
鉴于甲酸脱氢酶的上述优点，因而甲酸脱氢酶的应用具有非常广阔的市场前景。但由于目前现有甲酸脱氢酶(FDH)的酶活性较低，且稳定性较差，严重制约了其大规模应用。中国专利文献CN106479988A(申请号201610978442.2)公开了一种酶活和稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其构建方法，该发明的突变体是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基础上，将第10位丙氨酸突变成半胱氨酸，得到的突变体酶比酶活较突变前提高1.3倍，60度的半衰期(t1/2)较突变期提高了6.8倍，铜离子耐受性较突变前提高30倍，pH＝4的条件下稳定性提高了2.0倍同时催化效率提高1.4倍。该技术从分子改造的角度提高了甲酸脱氢酶(FDH)的酶活性和稳定性，但仍然无法满足市场的需求。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供乳糖在提高重组菌表达CbFDH酶的稳定性中的应用。
本发明技术方案如下：
乳糖在提高重组菌表达的单位重量的CbFDH酶酶活中的应用，或者，乳糖在降低重组菌表达的CbFDH酶用量中的应用。
乳糖在提高重组菌表达CbFDH酶的稳定性中的应用。
根据本发明优选的，上述应用，将乳糖添加至表达CbFDH酶的重组菌的发酵培养基中进行发酵培养。
根据本发明进一步优选的，所述提高重组菌表达CbFDH酶活性的应用，发酵培养基中，乳糖浓度为3.5～5g/L，更优选的，发酵培养基中，乳糖浓度为4.5～5g/L。
根据本发明进一步优选的，所述发酵培养基，组份如下：
蛋白胨9～11g/L，酵母提取物4.5～5.5g/L，Na2HPO4·12H2O 8～10g/L，KH2PO4 6.5～7.0g/L，NH4Cl 3～3.5g/L，乳糖3.5～5g/L，CaCl2 0.015～0.025g/L，甘油按体积百分比计0.7～0.8％，pH 6.8～7.2。
更优选的，所述发酵培养基，组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，KH2PO4 6.8g/L，NH4Cl3.3g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖4.5～5g/L，CaCl2 0.02g/L，甘油按体积百分比计0.74％，pH7.0。
根据本发明进一步优选的，所述提高重组菌表达CbFDH酶稳定性的应用，发酵培养基中，乳糖浓度为3.5～5.5g/L，更优选的，发酵培养基中，乳糖浓度为4.5～5.0g/L。
根据本发明进一步优选的，所述发酵培养基，组份如下：
蛋白胨9～11g/L，酵母提取物4.5～5.5g/L，Na2HPO4·12H2O 8～10g/L，KH2PO4 6.5～7.0g/L，NH4Cl 3～3.5g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，乳糖3.5～5.5g/L，CaCl2 0.015～0.025g/L，甘油按体积百分比计0.7～0.8％，pH 6.8～7.2。
更优选的，所述发酵培养基，组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，KH2PO4 6.8g/L，NH4Cl3.3g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖4.5～5.0g/L，CaCl2 0.02g/L，甘油按体积百分比计0.74％，pH7.0。
根据本发明进一步优选的，上述应用，步骤如下：
将表达CbFDH酶的重组菌接种于含有乳糖的发酵培养基中，在28～32℃、150～180rpm条件下培养16～18h，收集菌体，经细胞破碎，离心，收集上清液，制得甲酸脱氢酶CbFDH。
更优选的，所述细胞破碎，步骤如下：
将菌体按质量体积比1:(15～25)的比例与pH 7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在195W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎6min，每次超声波破碎时间3s，间歇时间5s。
更优选的，所述离心条件为：3000r/min离心2min。
更优的，所述重组菌的构建方法如下：
PCR扩增获得来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶基因fdh，基因序列如SEQ ID NO.2所示，将扩增后的甲酸脱氢酶基因fdh连接至大肠杆菌表达载体pET28a(+)，构建获得携带fdh基因的重组表达载体pET28a(+)-fdh，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化子，筛选获得表达甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌E.coli BL21-fdh。
最优的，所述PCR扩增的上游扩增引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游扩增引物序列如SEQ ID NO.4所示。
有益效果
本发明首次公开了乳糖在提高甲酸脱氢酶活性和延长保存时间中所起的特殊作用；通过发明人的实际实验，在培养表达CbFDH酶重组菌的过程中，向发酵培养基中加入特定浓度的乳糖后，CbFDH酶活力较常规诱导培养基提高了11.9倍，同时稳定性也得到大幅提升。
附图说明
图1不同乳糖浓度条件下CbFDH酶活；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 2.2378；
T28a(+)购自山东沃恩生物科技有限公司；
BL21(DE3)普通市售产品。
检测方法
甲酸脱氢酶CbFDH活性检测方法：
2mL反应体系中含有1670mM甲酸钠，16.7mM NAD，10mM PBS缓冲液(pH7.5)，加入适当稀释的酶液0.5mL，30℃反应5min，测定反应前后340nm处的吸光值，计算酶活。酶活力定义为1min催化产生1μmol NADH所需的酶量为1U。
甲酸脱氢酶CbFDH稳定性检测方法：
制备获得的甲酸脱氢酶CbFDH经酶活测定后，分别保存于常温30℃和-20℃，定时取样，检测酶活变化情况。
实施例1
构建基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh；构建方法如下：
PCR扩增获得来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶基因fdh，基因序列如SEQ ID NO.2所示，上游扩增引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游扩增引物序列如SEQ ID NO.4所示，将扩增后的甲酸脱氢酶基因fdh连接至大肠杆菌表达载体pET28a(+)，构建获得携带fdh基因的重组表达载体pET28a(+)-fdh，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化子，筛选获得表达甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌E.coli BL21-fdh；
具体步骤条件参见大肠杆菌表达载体pET28a(+)的使用说明书。
实施例2
将实施例1构建的基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh按质量2％的接种量转接至种子培养基中，在30℃、160rpm条件下种子培养12h，制得大肠杆菌种子液；
所述种子培养基组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素(ampicillin)100μg/mL。
实施例3
将实施例2所述大肠杆菌种子液按质量4％的接种量转接至发酵培养基，在30℃、160rpm条件下培养16h，收集基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh菌体，经细胞破碎，3000r/min离心2min，收集上清液，制得甲酸脱氢酶CbFDH；经检测，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；
上述细胞破碎，步骤如下：
将基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh菌体按质量体积比1:20的比例与pH7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在195W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎6min，每次超声波破碎时间3s，间歇时间5s。
所述发酵培养基，除乳糖外，其他组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，KH2PO4 6.8g/L，NH4Cl3.3g/L，葡萄糖0.5g/L，CaCl2 0.02g/L，甘油按体积百分比计0.5％；
按乳糖含量不同，配制不同的发酵培养基，乳糖浓度分别为：2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、4.81g/L、5.0g/L、5.5g/L、6.0g/L、6.5g/L、7.0g/L、7.5g/L、8.0g/L。
采用不同乳糖浓度的发酵培养基按上述条件进行发酵培养，制得甲酸脱氢酶CbFDH，对其活性和保存时间进行检测，检测结果如下所示：
表1不同乳糖浓度条件下CbFDH酶活
表2不同乳糖浓度条件下CbFDH酶在30℃保存5d后的酶活
对比例
如实施例3所述的方法制备甲酸脱氢酶CbFDH，不同之处在于，将乳糖替换为4.81g/L的半乳糖。
经检测，制得的甲酸脱氢酶CbFDH无活性。
结果分析
通过上述实施例和对比例的结果对比，导致上述实验结果差异显著的原因可能为：
在乳糖提高重组菌表达CbFDH酶活性方面，由于表达载体pET28a(+)的组成元件lac I基因是乳糖操纵子的一部分，其表达产物lac阻遏物与lac operator操纵区域结合，阻碍RNA聚合酶与T7启动子结合与转录，使下游基因的表达关闭；当诱导物乳糖与阻遏蛋白Lac I结合，使阻遏蛋白Lac I的构象发生改变后从lac operator操纵区域解离下来，T7启动子开启fdh基因表达。在未添加乳糖的发酵培养基中，甲酸脱氢酶基因fdh无法实现表达；对比例中将乳糖替换为半乳糖，同样无法实现fdh基因的功能性表达，因此均检测不到CbFDH酶活性。本发明通过优化乳糖的添加量，确定了乳糖浓度为4.81g/L条件下，CbFDH酶活性最高，较优化前提高了11.9倍，有利于实际生产应用中的发酵工艺的准确和有效控制。
在乳糖提高重组菌表达CbFDH酶稳定性方面，将新鲜制备的CbFDH酶在30℃条件下保存5d，检测酶活性，结果表明，经乳糖添加量优化后，大幅度提高了活性的CbFDH酶的稳定性也得到明显提高。实施例显示，CbFDH酶蛋白浓度最大提高0.53倍；在乳糖添加浓度为2.0-3.0g/L和6.0-8.0g/L范围时，CbFDH酶在30℃条件下保存5d后无活性，但蛋白浓度保持稳定。结果表明，CbFDH酶活性的变化并非是由蛋白含量的变化导致的，推测CbFDH酶的空间构象发生变化，使其在蛋白含量基本保持稳定的情况下，酶活性和在常温保存条件下的稳定性得到明显改善。

Claims (10)

1.乳糖在提高重组菌表达的单位重量的CbFDH酶酶活中的应用，或者，乳糖在降低重组菌表达的CbFDH酶用量中的应用。
2.乳糖在提高重组菌表达CbFDH酶的稳定性中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将乳糖添加至表达CbFDH酶的重组菌的发酵培养基中进行发酵培养。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高重组菌表达CbFDH酶活性的应用，发酵培养基中，乳糖浓度为3.5～5g/L；更优选的，发酵培养基中，乳糖浓度为4.5～5g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基，组份如下：
蛋白胨9～11g/L，酵母提取物4.5～5.5g/L，Na2HPO4·12H2O 8～10g/L，KH2PO4 6.5～7.0g/L，NH4Cl 3～3.5g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，乳糖3.5～5g/L，CaCl2 0.015～0.025g/L，甘油按体积百分比计0.7～0.8％，pH 6.8～7.2；
更优选的，所述发酵培养基，组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，KH2PO4 6.8g/L，NH4Cl 3.3g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖4.5～5g/L，CaCl2 0.02g/L，甘油按体积百分比计0.74％，pH 7.0。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高重组菌表达CbFDH酶稳定性的应用，发酵培养基中，乳糖浓度为3.5～5.5g/L，更优选的，发酵培养基中，乳糖浓度为4.5～5.0g/L。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基，组份如下：
蛋白胨9～11g/L，酵母提取物4.5～5.5g/L，Na2HPO4·12H2O 8～10g/L，KH2PO4 6.5～7.0g/L，NH4Cl 3～3.5g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，乳糖3.5～5.5g/L，CaCl2 0.015～0.025g/L，甘油按体积百分比计0.7～0.8％，pH 6.8～7.2；
更优选的，所述发酵培养基，组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，KH2PO4 6.8g/L，NH4Cl 3.3g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖4.5～5.0g/L，CaCl2 0.02g/L，甘油按体积百分比计0.74％，pH 7.0。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤如下：
将表达CbFDH酶的重组菌接种于含有乳糖的发酵培养基中，在28～32℃、150～180rpm条件下培养16～18h，收集菌体，经细胞破碎，离心，收集上清液，制得甲酸脱氢酶CbFDH。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞破碎，步骤如下：
将菌体按质量体积比1:(15～25)的比例与pH 7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在195W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎6min，每次超声波破碎时间3s，间歇时间5s。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述离心条件为：3000r/min离心2min；
更优的，所述重组菌的构建方法如下：
PCR扩增获得来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶基因fdh，基因序列如SEQ ID NO.2所示，将扩增后的甲酸脱氢酶基因fdh连接至大肠杆菌表达载体pET28a(+)，构建获得携带fdh基因的重组表达载体pET28a(+)-fdh，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化子，筛选获得表达甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌E.coli BL21-fdh。
最优的，所述PCR扩增的上游扩增引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游扩增引物序列如SEQ ID NO.4所示。
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