CN108587935A - 适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于石油污染土壤修复技术领域，具体涉及一种适合于电场条件下石油污染土壤微生物修复菌剂及其制备和应用。菌剂由荧光假单胞菌与海旋菌分别发酵混合获得；其中，荧光假单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，本发明在电动修复的施加电场条件初期，补给耐电石油烃降解菌剂，当电场中土壤内电流强度≤10～30mA时，补给耐盐石油烃降解菌剂，补给后使土壤内细菌微生物数量达到耐电菌株施加后含量的100～130％。耐电及耐盐菌剂的制备及应用有效利用石油烃降解菌的耐电与耐盐特性，针对电场条件下的电动修复过程特征进行特异性施用，有效匹配菌剂性能与土壤修复条件，特别针对于石油污染盐渍土壤的石油烃降解去除具有良好的应用效果。

Description

适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂及其制备和应用
技术领域
本发明属于石油污染土壤修复技术领域，具体涉及一种适合于电场条件下石油污染土壤微生物修复菌剂及其制备和应用。
背景技术
随着石油化工行业的不断发展，石油等有机原材料对环境的污染问题愈发突出，特别是石油烃开采、运输、储存及应用等过程对土壤的污染问题愈演愈烈。对此，环保领域中的多种修复技术孕育而生并得到不断发展。然而，诸多单一修复技术均存在应用及适用性等方面的缺陷，联合修复技术是实现高效普适修复目标主要发展方向。电动-微生物协同修复技术是将电动修复技术与微生物修复技术有机结合，通过电动处理污染土壤中的电动效应与电化学氧化作用及微生物的生物酶代谢氧化作用进行石油烃污染物的降解。电动效应具有刺激微生物代谢活性的特征，通过营养供给、生理调控等过程实现电动与微生物修复技术的协同作用。但是，该修复技术仍然难以维持长期持续高效的修复过程，这里微生物代谢活性的波动是造成修复效率下降的主要原因之一。
电动修复过程所应用的低电压虽对部分适应性微生物具有刺激性作用，但随着处理过程的延续，微生物群落组成不断变化，所产生的难以适应电场条件下的降解功能微生物将受电场强度影响而使其代谢活性发生退化。此外，电动修复过程中的电迁移效应促使土壤内盐离子等水溶性无机物向电极区两侧迁移，造成区域性土壤内盐分高积累，这对于常规非盐耐受菌株而言，将改变菌体细胞内外渗透式的平衡稳态，造成微生物细胞失水、生理活性功能下降乃至死亡。
对此，需要实现电动-微生物协同修复技术的进一步优化，提高石油污染土壤修复的效率急需开发新的生物修复材料以提高修复活性，延长高效修复时间。
发明内容
本发明目的在于提供一种适合于电场条件下石油污染土壤微生物修复菌剂及其制备和及应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂，菌剂由荧光假单胞菌PB4(Pseudomonas fluorescens PB4)与海旋菌(Thalassospira xianhensis.)分别发酵混合获得；其中，荧光假单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO.M2011260，保藏日期为2011年7月19日，分类学命名荧光假单胞菌PB4(Pseudomonas fluorescens PB4)；海旋菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.1.6849，保藏日2008年9月15日，分类学命名海旋菌Thalassospira xianhensis。
所述菌剂由荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与海旋菌(Thalassospira xianhensis.)分别发酵混合后经载体固定化获得。
所述荧光假单胞菌与海旋菌菌悬液按照3～5:1～2(v:v)的比例混合并经固定所得菌剂适用于耐电石油降解；
所述荧光假单胞菌与海旋菌菌悬液按照2～3:3～7(v:v)的比例混合并经固定化所得菌剂适用于耐盐石油烃降解。
其中荧光假单胞菌具有耐受0～2v/cm的直流电场特性，海旋菌具有适应3.5％～5％盐环境的功能。
一种适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂的应用，所述菌剂在与电场协同作用下对石油污染土壤修复的应用。
所述菌剂中荧光假单胞菌与海旋菌菌悬液按照3～5:1～2(v:v)的比例混合适用于耐电石油降解污染土壤修复；
所述菌剂中荧光假单胞菌与海旋菌菌悬液按照2～3:3～7(v:v)的比例混合并经固定化所得菌剂适用于耐盐石油烃降解污染土壤修复。
所述电场条件为施加0.2～2.0v/cm的直流电场，进行电动修复的开端使用耐电石油降解菌剂，施用后使土壤内细菌微生物数量达6～9×1010 copies/g干土；当修复土壤内电流强度≤10～30mA时加入所述耐盐石油降解菌剂，施用后使土壤内细菌微生物数量达到耐电菌株施加后土壤内细菌微生物含量的100～130％(百分比指的是耐盐菌是加后，土壤内数量达到首次施加耐电菌株施加后土壤内细菌微生物含量值的100～130％)，修复全程以电动-微生物协同修复的方式进行。
一种修复石油污染土壤的方法，将所述菌剂与电场协同作用下对石油污染土壤修复。
对待处理污染土壤施加0.2～2.0v/cm的直流电场进行电动修复，在施加电场的同时添加所述耐电石油降解菌剂，施用后使土壤内细菌微生物数量达6～9×1010copies/g干土；当修复土壤内电流强度≤10～30mA时加入所述耐盐石油降解菌剂，施用后使土壤内细菌微生物数量达到耐电菌株施加后土壤内细菌微生物含量的100～130％，修复全程以电动-微生物协同修复的方式进行。
当电场中土壤内电流强度≤10～30mA时，施加耐盐石油降解菌剂，施加次数不限于一次，可依据土壤修复效果及修复目标而定。
本发明所具有的优点包括：
本发明通过驯化筛选及有效配伍操作，制备具有耐电特性及耐盐特征的混合降解菌剂，并有机搭配施用将可有效实现微生物修复菌剂对于石油污染土壤电动修复过程的针对性投加，提高微生物代谢活性利用率，实现长效修复过程。
本发明提供具有耐电及耐盐特性的石油烃降解功能菌剂，按特定指标判断法加入到电场条件下的电动修复技术处理石油污染土壤中，实现电动-微生物协同修复技术的进一步优化，提高石油污染土壤修复效率；具体：
1)本发明中的荧光假单胞菌与海旋菌均属于石油烃降解功能菌，其中，荧光假单胞菌还具有耐受低电压直流电的电场(0～2v/cm)特性，海旋菌具有耐受高盐环境(3.5％～5％)的特性，两株菌株的有效组合制成菌剂，具有多样的代谢降解功能及对环境的适应性。
2)本发明中的耐电石油降解菌剂与耐盐石油降解菌剂分别具有耐受低电压弱电场及高盐环境的特征，针对电动修复过程中电场条件的变化特征及土壤性质的变化特性，分别施加两种菌剂，克服盲目投加菌剂而因对电场与高盐环境的不适应性所造成的微生物代谢功能的弱化，提高微生物代谢效率。
3)本发明中的石油烃降解菌剂不仅适用于电动修复过程中的污染土壤修复应用，同样适用于石油污染盐渍土壤的修复，鉴于油田开采区的诸多石油污染区域均属于盐渍土壤，故而菌株同样可应用于盐碱地石油污染土壤的生物修复及电动-微生物协同修复应用之中。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的EK-Bio-B中电流强度的变化图，红色圈处表征电流强度下降到耐盐石油降解菌剂可以应用的时间节点。
图2为本发明实施例2提供的试验处理70d内各处理条件下土壤脱氢酶活性变化图。
图3为本发明实施例2提供的70d内各试验处理条件下土壤细菌微生物数量变化图。
图4为本发明实施例2提供的各试验处理70d内总石油烃降解率随时间变化图。
具体实施方式
本发明在电动修复的施加电场条件初期，补给耐电石油烃降解菌剂，当电场中土壤内电流强度≤10～30mA时，补给耐盐石油烃降解菌剂，补给后使土壤内细菌微生物数量达到耐电菌株施加后含量的100～130％。耐电及耐盐菌剂的制备及应用有效利用石油烃降解菌的耐电与耐盐特性，针对电场条件下的电动修复过程特征进行特异性施用，有效匹配菌剂性能与土壤修复条件，特别针对于石油污染盐渍土壤的石油烃降解去除具有良好的应用效果。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1适用于电场条件下石油污染土壤微生物修复的菌剂制备
本实施例所用荧光假单胞菌与海旋菌分别分离自辽河油田及胜利油田长期受石油污染土壤，菌株在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上划线保存。挑取一环荧光假单胞菌及海旋菌分别接种在5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃震荡培养16h，获得种子液。取荧光假单胞菌种子液1ml接种至以0.5g/L石油烃为唯一碳源的无机盐培养基中，所用石油烃为辽河油田原油，同时取海旋菌种子液1ml接种至以0.5g/L烷烃和0.5g/L芳烃为唯一碳源的无机盐培养基中，所用烷烃及芳烃均通过石油烃族组分分级方法分离自胜利油田原油样品中，接种后的无机盐培养基在30℃条件下180rpm摇床培养7d。培养物在8000rpm/min条件下离心10min，收集菌体，两菌株菌体分别采用等体积不含碳源的无机盐培养基重悬，获得菌剂制备菌源液。
所用牛肉膏蛋白胨培养基成分为：3.0g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨， 5.0g/L NaCl，蒸馏水1L，pH 7.0。
所用无机盐培养基成分为：3.0g/L Na2SO4，0.2g/L NH4Cl，0.02 g/LCaCl2·2H2O，0.02g/LFeSO4，0.2g/L KH2PO4，0.5g/L KCl，0.25g/L MgCl2·6H2O，1.0ml/L微量元素溶液；微量元素成分为：1.5g/L FeCl2·4H2O，150mg/LCoCl2·6H2O，100mg/L MnCl2·4H2O，70mg/L ZnCl2，62mg/L H3BO3，36mg/L Na2MoO4·2H2O，24mg/L NiCl2·6H2O， 17mg/L CuCl2·2H2O，培养基在121℃条件下灭菌20min备用；其中，荧光假单胞菌培养用无机盐培养基成分为上述组成，海旋菌培养用无机盐培养基中加入40g/L NaCl。
所述荧光假单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO.M2011260，保藏日期为2011年7月 19日，分类学命名荧光假单胞菌PB4(Pseudomonas fluorescens PB4)；海旋菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.1.6849，保藏日2008年9月15 日，分类学命名海旋菌Thalassospira xianhensis。耐电石油降解菌剂的制备，将上述获得两种菌株的菌悬液按荧光假单胞菌与海旋菌3:1(v:v)的比例混合，加入事先制备好的稻壳载体进行固定化处理，稻壳载体加入比例为10％(w/v，g/ml)；
耐盐石油烃降解菌剂的制备，将上述获得两种菌株的菌悬液按荧光假单胞菌与海旋菌按照2:7(v:v)的比例混合，加入事先制备好的稻壳载体进行固定化处理，稻壳载体加入比例为10％(w/v，g/ml)。
所用稻壳载体，采用35％硫酸酸化处理15min的水稻稻壳，采用氨水调节至稻壳pH达7.5，自然风干后收集获得菌液固定化载体备用。
上述两种菌剂固定化后有效活菌数达8.3×106copies/g。
实施例2菌剂在电场条件下进行石油污染土壤修复中的应用
试验所用石油污染土壤采自油田区石油落地污染土，土壤中石油烃污染物含量达4.2％(w/w)，将挖自现场的石油污染土壤经挑拣去除大块杂质后自然风干，土壤经研磨后过2mm孔筛，获得待修复处理土壤备用。待修复污染土壤的理化性质包括，土壤孔隙度达45％，土壤内总离子含盐量达0.7％(w/w)。
将实施例1中所制备的耐电石油烃降解菌剂混入待处理石油污染土壤中，并加入无机盐培养基以调整土壤中水分含量达21％(w/w)。电动修复处理装置由长26cm×宽15cm×高14cm的盒体组成，盒体内装入的石油污染土壤质量达1500g，盒体内沿长向施加直流电场，电压梯度选择1.0v/cm，采用24v电源进行直流供电，供电输出连接于不锈钢棒状电极端，电极直径为1.2cm，电极长度为17cm，两侧电极间距为24cm，采用恒定场强方向进行电动修复处理。
试验设置共分为五组处理，设置参数如表1所示，分别记为对照组 (CK)、电动处理组(EK)、微生物处理组(Bio)以及两组电动-微生物协同处理组(EK-Bio-A和EK-Bio-B)。其中，Bio与EK-Bio-A处理组的开端均按照1:1(数量比)的比例加入耐电石油降解菌剂与耐盐石油降解菌剂的混合菌剂，使土壤内细菌微生物数量达6.9×1010copies/g干土，EK-Bio-B处理组在处理开端加入耐电石油降解菌剂，土壤内细菌微生物数量达6.9×1010copies/g干土，当电流强度≤20mA时，补加耐盐石油降解菌剂，使土壤内微生物数量达4.9×1010copies/g干土。在电动处理组中，分别在正极与负极处对土壤pH进行调节，使土壤平均pH维持在7～8之间(参见表1)。试验采取跟踪取样监测的方式进行修复效果及试验过程评估，采样周期为70d，每10d取样一次，分别对土壤样品内石油烃残留量、土壤细菌微生物数量、土壤脱氢酶活性进行测定，并实时监测电动处理过程中电流强度变化情况。
表1各试验处理设置的基本情况与试验参数表
试验结果表明，耐电石油降解菌剂与耐盐石油降解菌剂的搭配施加解决并优化了非耐电菌株代谢活性减弱及非耐盐菌株代谢功能受限的弊端，EK-Bio-B处理中70d的石油烃降解率达56.51％，较只施加耐电降解菌的EK-Bio-A处理的石油烃降解率高出7.16％。此时，当处理50d后电流强度下降到16.93mA时(图1)，施加耐盐微生物菌剂后，无论是土壤微生物数量还是土壤脱氢酶活性(图2、图3)，均出现显著增加，且在50～70d的处理过程中，微生物数量与脱氢酶活性均得到了有效维持。由此表明，初始当电流强度较大时耐电石油烃降解菌剂的加入对电场条件下石油烃的降解其主要作用，而耐盐微生物活性受到抑制，所以处理50d是EK-Bio-A处理组的石油烃降解率达40.52％(图4)，高于 EK-Bio-B处理组的石油烃降解率(37.6％)。降解试验后期(50～70d)， EK-Bio-A处理组的石油烃降解率显著低于EK-Bio-B处理组，表明在电动处理引起土壤内盐离子积累的效应后，耐盐菌剂可耐受低电流强度的作用(≤20mA)，其加入后更利于石油烃代谢降解功能的发挥。综上所述，本专利提供的适合于电场条件下石油污染土壤微生物修复的菌剂及其制备和应用方法可有效实现石油烃污染物的高效降解，优化电动-微生物协同修复技术在石油烃污染土壤修复中的应用。

Claims (8)

1.一种适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂，其特征在于：菌剂由荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与海旋菌(Thalassospira xianhensis.)分别发酵混合获得；其中，荧光假单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO.M2011260，保藏日期为2011年7月22日，分类学命名Pseudomonasfluorescens；海旋菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.1.6849，保藏日2008年9月15日，分类学命名Thalassospiraxianhensis。
2.按权利要求1所述的适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂，其特征在于：菌剂由荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与海旋菌(Thalassospira xianhensis.)分别发酵混合后经载体固定化获得。
3.按权利要求1或2所述的适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂，其特征在于：所述荧光假单胞菌与海旋菌菌悬液按照3～5:1～2(v:v)的比例混合并经固定所得菌剂适用于耐电石油降解；
所述荧光假单胞菌与海旋菌菌悬液按照2～3:3～7(v:v)的比例混合并经固定化所得菌剂适用于耐盐石油烃降解。
4.一种权利要求1所述的适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂在与电场协同作用下对石油污染土壤修复的应用。
5.按权利要求4所述的适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂中荧光假单胞菌与海旋菌菌悬液按照3～5:1～2(v:v)的比例混合适用于耐电石油降解污染土壤修复；
所述菌剂中荧光假单胞菌与海旋菌菌悬液按照2～3:3～7(v:v)的比例混合并经固定化所得菌剂适用于耐盐石油烃降解污染土壤修复。
6.按权利要求4或5所述的适用于电场条件下石油污染土壤修复菌剂的应用，其特征在于：所述电场条件为施加0.2～2.0v/cm的直流电场，进行电动修复的开端使用耐电石油降解菌剂，施用后使土壤内细菌微生物数量达6～9×1010copies/g干土；当修复土壤内电流强度≤10～30mA时加入所述耐盐石油降解菌剂，施用后使土壤内细菌微生物数量达到耐电菌株施加后土壤内细菌微生物含量的100～130％，修复全程以电动-微生物协同修复的方式进行。
7.一种修复石油污染土壤的方法，其特征在于：将权利要求1-3任意一项所述菌剂与电场协同作用下对石油污染土壤修复。
8.按权利要求7所述的修复石油污染土壤的方法，其特征在于：对待处理污染土壤施加0.2～2.0v/cm的直流电场进行电动修复，在施加电场的同时添加所述耐电石油降解菌剂，施用后使土壤内细菌微生物数量达6～9×1010copies/g干土；当修复土壤内电流强度≤10～30mA时加入所述耐盐石油降解菌剂，施用后使土壤内细菌微生物数量达到耐电菌株施加后土壤内细菌微生物含量的100～130％，修复全程以电动-微生物协同修复的方式进行。
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