CN108587925B - 一种长枝木霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种长枝木霉菌株及其应用。本发明所提供的具有降镉和生防功能的长枝木霉T61，它在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2017447，其28Sr RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。实验证明，本发明的长枝霉T61能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，对镉具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能；同时，长枝木霉T61可使作物具有显著的抗病虫害功效，也可明显提高土壤有机质含量，改善土壤理化性质。因此，本发明的长枝木霉T61能够应用于修复重金属污染土壤和提高土壤有机质含量、改善土壤理化性质以及相关产品的制备中。

Description

一种长枝木霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种长枝木霉菌株及其应用。
背景技术
镉是一种比较稀有的金属，是一种毒性较强、分布范围较广，且半衰期很长的重金属元素。土壤中的镉主要来源是工业废渣、废气中的扩散、沉降、累积、含废水灌溉农田，以及含农药、磷肥的大量使用。它极易蓄积在土壤中。在目前的重金属污染中，镉污染很突出，是面积最广、危害最大的重金属元素之一。据统计，我国镉污染耕地面积为2000万平方米，已占我国耕地总面积的20％，被重金属污染的粮食每年也多达1200万吨，由此造成的经济损失至少200亿元。且重金属镉进入人体后引起慢性中毒、致癌、致畸和降低机体免疫功能等，尤其是近几年出现的“镉大米”中毒事件，已经使土壤镉污染的修复问题亟待解决。物理修复法和化学修复法都易造成二次污染，且修复成本高。微生物修复法改良重金属污染的土壤主要通过生物吸附、溶解与生物转化重金属的机理发生。此方法处理费用相对较低，处理效果好，对环境的影响低，操作简单，可以就地进行处理。目前，生物修复法已成为重金属污染土壤行之有效的修复手段之一。
长枝木霉适应性强，被广泛用于生产中，长枝木霉不仅具有解离土壤镉污染的功能，同时也是重要的生防菌株，长枝木霉在代谢过程中可以产生抑制病原菌的拮抗性化学物质，如抗菌肽、吡喃酮类抗生素、水解酶等。长枝木霉产生的抗菌肽具有广谱的抑菌活性，能作用于多种植物病原菌，促进农业的可持续发展，减少环境污染和保障人类健康，具有重要的实践意义。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种长枝木霉菌株及其应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种具有降镉和生防功能的长枝木霉菌株，该长枝木霉菌株在2017年8 月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，其提议的分类命名为长枝木霉T61(Trichoderma longibrachiatum T61)，保藏编号为CCTCC NO：M2017447。
进一步地，所述长枝木霉T61(Trichoderma longibrachiatum T61)的 28SrRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种具有降镉和生防功能的菌剂，所述菌剂以上述的长枝木霉T61(Trichoderma longibrachiatum T61)为主要功能菌。
进一步地，所述菌剂中长枝木霉T61(Trichoderma longibrachiatum T61) 的活菌含量为5.0×108～5.0×1010CFU/g。
本发明提供了一种具有降镉和生防功能的长枝木霉菌剂的应用，所述长枝木霉菌剂应用于降解污染物中的重金属镉和作物防病。
进一步地，所述长枝木霉菌剂是应用于降解土壤中的重金属镉。
进一步地，所述长枝木霉菌剂是应用于抑制作物病原菌。
本发明的有益效果：(1)本发明的长枝木霉T61(Trichoderma longibrachiatumT61)能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，对镉具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能；(2)本发明的长枝木霉T61(Trichodermalongibrachiatum T61)可使作物具有显著的抗病虫害功效，同时可明显提高土壤有机质含量，改善土壤理化性质。因此，本发明的长枝木霉T61(Trichoderma longibrachiatum T61)能够应用于修复重金属污染土壤和提高土壤有机质含量、改善土壤理化性质以及相关产品的制备中。
附图说明
图1为长枝木霉T61在Cd2+浓度PDA培养基上T61的生长情况示意图；
图2为长枝木霉T61的形态学特征示意图；
图3为长枝木霉T61的28SrDNA扩增片段示意图；
图4为长枝木霉T61系统发育树示意图；
图5为长枝木霉T61在2-12小时内对Cd2+的降解情况曲线图；
图6为长枝木霉T61在1-7天内对Cd2+的降解情况曲线图；
图7为不同温度及pH条件下长枝木霉T61对Cd2+的降解情况曲线图；
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。
实施例1：长枝木霉T61的筛选
1、初筛
取10g某废弃生产镉的工厂土样在无菌操作条件下放入装有90mL灭菌液体PDA培养基的三角瓶中，置于200r/min摇床28℃振荡12h；吸取0.1mL 菌液涂布在Cd2+浓度为50mg/L的PAD固体平板培养基上，置于28℃恒温箱倒置培养3天，3次重复。
2、复筛
将上述平板上长出的菌落依次划线接种于Cd2+浓度为50mg/L、100mg/L、 200mg/L、300mg/L、400mg/L和500mg/L的PAD固体平板培养基上，在 30℃恒温箱倒置培养3天，3次重复。观察菌落生长情况，将有菌落生长的固体平板于4℃冰箱中保存。
此次共分离纯化出18株不同的菌株，分别编号为T50-T68。经过初步筛选，从表1可知，经初筛得到5株能够在Cd2+浓度为400mg/L的PAD固体培养基上正常生长的木霉菌株，编号分别为T61-T65，如表1所示；经复筛得到一株能够在Cd2+浓度为500mg/L的PAD固体培养生长良好的菌株T61，其生长情况如图1所示，图1中A为自然PDA培养基、B和C分别为Cd2+浓度为400mg/L和500mg/L的PDA培养基。
其中PDA固体培养基配方：200g马铃薯浸提液，蔗糖20g，琼脂15-20g，定容于1000ml；
Cd2+溶液浓度用硝酸镉[Cd(NO3)2·4H2O]来调节。
表1不同Cd2+浓度下所筛菌株的直径
Figure BDA0001643661670000041
Figure BDA0001643661670000051
试验表明，菌株T61在Cd2+浓度范围为50-500mg/L的情况下均能生长良好，因此，菌株T61具有较强的耐镉能力。
实施案例2：菌株T61的分类鉴定
1.形态学鉴定
从图2可知，T61菌株在PAD平板上培养4天时菌落直径达85mm，菌落圆形平坦，初期白色菌丝，后变成深绿色，菌丝繁密，绒毡状，菌落背面无色。菌丝透明有隔，分生孢子梗长且直，5.0-20.0μm；次级分枝呈直角长出，有的向主枝稍弯曲；末端小梗瓶形，单生、对生或2-5个轮生，小梗基部较细，中间膨大，向上至顶部纤细；分生孢子倒卵圆形、椭圆形，淡绿色，光滑，约2.0～2.5μm×2.5～5.0μm。
2.分子生物学鉴定
挑取T61菌株菌丝0.5g于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉倒入离心管中。 CTAB法提取T61菌株的DNA。利用真菌通用引物ITS4和ITS5进行PCR 特异扩增，在PCR扩增之后，通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，然后对其序列进行测定，测序结果与国际NCBIGenBank核酸序列库中进行 BLAST分析。通过菌株28SrRNA序列对菌株T61进行种属鉴定。从图3可知，菌株T61的28SrDNA序列全长为609bp，T61菌株与长枝木霉 (Trichodermalongibrachiatum)的同源性最高，相似性为99％。
其中CTAB提取液由NaCl(5mol/L)、2gCTAB、10mL Tris·Cl (100mmol/L、pH＝8.0)、4mL EDTA(20mmol/L、pH＝8.0)、1mL 0.2％(v/v) 巯基乙醇，用ddH2O定容至100mL配制而成。长枝木霉28SrRNA基因组 PCR扩增所用引物为F1和R1，其序列为：
F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
R1：5’-AAGGAGGTGATCCACCC-3’
PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性1min， 56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃最后延伸10min。扩增后，产物送至上海生工生物工程有限公司测序，菌株T61的28SrRNA测序结果如SEQ ID No.1所示。
用N-J法计算T61菌株的28SrDNA全序列遗传距离，并利用Mega5对目的菌株进行系统发育树构建(如图4所示)，确定目的菌株的分类地位。 T61菌株在系统发育树上与长枝木霉菌处于同一个分支内，遗传距离最近，所以结合形态学观察结果，确定菌株T61为具有降镉功能的长枝木霉。
根据形态学特征和分子生物学的鉴定将T61认定为长枝木霉T61，并于 2017年8月21日送交湖北省武汉市武汉大学内中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO：M2017447。
实施案例3：长枝木霉降解镉的生物学验证
1.长枝木霉T61对Cd2+的降解能力验证
将实施例1中筛选出的长枝木霉T61接种于PAD液体培养基中，在200r/min、28℃的摇床中振荡培养7d后，取200μL菌悬液加入50mL 75mg /LCd2+的PAD液体培养基中，在200r/min、28℃摇床中振荡培养5d；取2mL菌悬液于离心管中，在14000r/min下离心10min，取上清液1mL，用 0.45μm过滤器过滤配置10Ml 80dp的滤液，用原子光谱吸收仪(AAS)测量滤液中Cd2+浓度。
A＝(C0-Ci/C0)*100％
式中，A为降解率，C0为Cd2+起始浓度，Ci为Cd2+最终浓度。
试验分析：从图5可知，随处理时间的增加，长枝木霉T61对Cd2+的降解率不断增加，在处理7d时达最大值，之后随时间增加降解率不再增加。其中，处理6h时长枝木霉T61对Cd2+降解率为43％，14h时Cd2+降解率为 45％，1d时Cd2+降解率为47％。
结论：长枝木霉T61对Cd2+的降解在处理6h内活动较充分，即长枝木霉T61在短时间内已降解大部分Cd2+。
2.长枝木霉T61降镉的最适条件
将冷冻保存的本发明的长枝木霉T61分别接种于MRS培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)中，在温度37℃的条件下培养24h，再经 MRS培养液传代培养2-3次后，取1ml长枝木霉T61培养液，分别接种于不同pH值(3.0-9.0)的PAD液体培养基中，在200r/min、28℃的摇床中振荡培养7d后，取200μL菌悬液加入50mL含75mg/LCd2+的PAD液体培养基中，在200r/min、28℃摇床中振荡培养5d；取2mL菌悬液于离心管中，在 14000r/min下离心10min，取上清液1mL，用0.45μm过滤器过滤配置10Ml 80dp的滤液，用原子光谱吸收仪(AAS)测量滤液中Cd2+浓度。
试验分析：pH＝2-4时，随pH的增加，长枝木霉T61对Cd2+的降解率从39％增至58％，但在pH＝4-6时，随pH的增加其对Cd2+的降解率反而从58％降至38％；在pH＝4时，对Cd2+的降解率最高；在T＜28℃时，随温度的增加T61对Cd2+的降解率增加；当温度＞28℃时，随着温度的增加T61 对Cd2+的降解率降低。其中，在pH＝4时，温度为16-28℃，随温度的增加其降解率从36％增至58％，但当温度为28℃-30℃时，随着温度的增加其降解率从58％降至52％。
结论：长枝木霉T61在pH为4、温度为28℃时对Cd2+的降解能力最强。
3.长枝木霉T61的抑菌实验
将长枝木霉T61于28℃恒温培养于PDA培养基上，5d后用于接种试验。用打孔器(φ＝5mm)沿各菌落边缘切取同等质量的长枝木霉T61和病原真菌的菌丝块，接种于PDA平板上距中心2cm处同一直线的两点上，同时设置只接种长枝木霉T61和病原真菌为对照，每个处理设3个重复，于 28℃恒温培养，并逐日测量病原菌菌落和长枝木霉T61菌落连线的半径。当两菌落接触交接后，在交接部位或病原真菌菌落内部挑取菌丝在显微镜下观察二者的相互作用，观察长枝木霉T61对病原真菌的抑制、包围、侵入并占领病原真菌营养空间的过程。
含孢子悬浮液培养基制备方法：取4g麦麸与196mL蒸馏水混合于500 mL三角瓶内灭菌，待冷却后接入长枝木霉T61菌株(φ＝5mm)5个，于 28℃、140r/min恒温振荡培养72h后，用4层灭菌纱布过滤，得到2×107个孢子/mL的孢子悬浮液。将上述孢子悬浮液接于PDA平板培养证明无杂菌后，放入4℃冷藏备用。分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL的上述长枝木霉T61孢子悬浮液加入到已融化并冷却至50℃左右的PDA培养基中，充分混合均匀后铺制平板。
对峙培养3d后，长枝木霉T61与各病原真菌开始相交，各菌沿接种点连线方向的生长均受到抑制，但长枝木霉T61对各种病原真菌的抑制作用更为明显。随后，长枝木霉T61不断侵占各病原真菌的生长空间，或覆盖、或侵入各病原真菌的菌落，并在接有病原真菌的一侧产生大量的孢子，形成包围圈，抑制各病原真菌生长；5天后，长枝木霉T61开始从四周向番茄灰霉病和褐斑病菌菌落中央覆盖，但只覆盖与之接近的一部分菌落；而番茄枯萎病和叶霉病菌在与长枝木霉T61菌落相接处产生大量的菌丝，阻止长枝木霉 T61继续向前生长，两菌落间呈现对峙之势。第9天后，番茄枯萎病和叶霉病菌菌丝向长枝木霉T61方向缓慢生长。长枝木霉T61对各病原真菌的抑制作用见表2。
表2长枝木霉T61对4种番茄病原真菌抑菌率(％)
Figure BDA0001643661670000091
结论：长枝木霉T61对各供试病原真菌均有一定的抑制作用，尤其以对番茄灰霉病的抑制效果最好。
4.长枝木霉T61在水稻防病中的应用
2017年，武汉市土肥站在江夏区开展长枝木霉T61菌剂在水稻上的防病试验，研究其在大田自然条件下对水稻的增产效果、抗病虫害和土壤修复的影响。试验效果表明：施用后，全程没有施用任何农药，病害发生较轻，且对水稻有明显的增产作用，每667平方米增产32kg，增产率5.74％，可促进水稻苗的生长和分蘖。同时发现，通过长枝木霉T61处理的稻田土壤有机质、水解性氮含量均高于其它处理。由此可知，添加长枝木霉T61颗粒剂还可提高稻田土壤有机质含量，改善土壤理化性质。
序列表
<110> 武汉合缘绿色生物股份有限公司
<120> 一种长枝木霉菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 609
<212> DNA
<213> 长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)
<400> 1
aaggtcactc caaccccatg tgacgttacc aatctgttgc ctcggcggga ttctcttgcc 60
ccgggcgcgt cgcagccccg gatcccatgg cgcccgccgg aggaccacct ccaaactctt 120
ttttctctcc gtcgcggctc ccgtcgcggc tctgttttat ttttgctctg agcctttctc 180
ggcgacccta gcgggcgtct cgaaaatgaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt 240
ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatcc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg 300
aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgtcc 360
gagcgtcatt tcaaccctcg aacccctccg gggggtcggc gttggggatc ggcccctcac 420
cgggccgccc ccgaaataca gtggcggtct cgccgcagcc tctcctgcgc agtagtttgc 480
acactcgcac cgggagcgcg gcgcggccac agccgtaaaa caccccaaac ttctgaaatg 540
ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc atatcataaa gcgggaggaa 600
aagggtacc 609

Claims (6)

1.一种具有降镉和生防功能的长枝木霉菌株，其特征在于：该长枝木霉菌株在2017年8月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其提议的分类命名为长枝木霉T61（Trichodermalongibrachiatum T61），保藏编号为CCTCC NO：M2017447。
2.一种具有降镉和生防功能的菌剂，其特征在于：所述菌剂以权利要求1所述的长枝木霉T61（Trichoderma longibrachiatum T61）为主要功能菌。
3.根据权利要求2所述的一种具有降镉和生防功能的菌剂，其特征在于：所述菌剂中长枝木霉T61（Trichoderma longibrachiatum T61）的活菌含量为5.0×108～5.0×1010CFU/g。
4.一种具有降镉和生防功能的长枝木霉菌剂的应用，其特征在于：所述长枝木霉菌剂应用于降解污染物中的重金属镉和作物防病；所述长枝木霉菌剂包括长枝木霉T61（Trichoderma longibrachiatum T61），保藏编号为CCTCC NO：M2017447。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用于降解土壤中的重金属镉。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用于抑制作物病原菌。
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Removal of heavy metals - lead, cadmium and nickel by fungi and bacteria from liquid medium;P.K. Joshi等;《Journal of Soil Salinity and Water Quality》;20131231;第5卷(第1期);第60-64页 *
耐镉木霉菌株的筛选、鉴定及其降镉能力探究;吴翰林;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（工程科技Ⅰ辑）》;20170815;B027-45 *
长枝木霉菌抑菌谱测定及其抑菌作用机理研究;张瑾等;《中国生态农业学报》;20140630;第22卷(第6期);第661-667页 *

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