CN108559711A - 一种霉菌的密闭式培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种霉菌的密闭式培养方法，该方法经过称样、稀释、倾注等步骤，获得琼脂平板，并将所有的琼脂平板按照1个琼脂平板和至少1个无菌空白培养皿的比例，转移至气密装置中，排出多余空气封口后形成密封状态，于28℃恒温培养箱内培养。在所述的密闭式培养方法中，处于密封状态的气密装置，将其内部空间与外界环境隔离，并阻断了物质的交换，从而杜绝琼脂平板上生长的霉菌及其孢子的扩散、以及逃逸至气密装置的外部环境引起环境污染和健康危害。

Description

一种霉菌的密闭式培养方法

技术领域

本发明涉及一种霉菌的密闭式培养方法。

背景技术

霉菌是丝状真菌的统称，广泛分布于土壤、水、空气等自然环境中。一些有害真菌在生长繁殖过程中可破坏食物结构、造成食物营养损耗，每年由此造成的食物损失达5 %～10 %。此外，食品中生长的霉菌在进入人体后，极易损害人体健康，霉菌形成的有毒有害产物（如真菌毒素等），可引起人类的急慢性食物中毒。所以食品中霉菌的检测是评判食品质量是否合格、是否健康的重要指标之一。近年来随着霉菌及霉菌毒素污染所造成的损失逐渐被人们所高度重视，世界各国纷纷制订食品中霉菌的各种限量标准，同时加强对霉菌检测技术的研究，并不断提出新的见解，完善该项技术。我国随着食品安全网的逐渐建立和建全，也将霉菌作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌数来判定食品被污染的程度。在食品检测和食品卫生质量评定中，霉菌的检测已经成为一项重要的检测项目。我国在2011年颁布了国家标准GB2761-2011《食品中真菌毒素限量》，其它许多种类的食品也制定了霉菌的卫生标准。因此，各级食品监督检测机构全面开展霉菌的检测工作。

霉菌生理和形态复杂多样，其生长发育受各种外界条件和自身因素的影响，培养环境中氧气的多少对霉菌的影响巨大。充足的氧气是霉菌正常生长发育的基础，一般空气中氧气含量为21 ％，霉菌利用空气中的氧气即可正常生长发育。霉菌生长过程中不断吸收氧气、释放二氧化碳，而环境中二氧化碳浓度是衡量霉菌能否正常生长的重要指标。如果培养环境的氧气充足，而二氧化碳含量不超过0.03 ％时，霉菌可正常生长；如果氧气浓度太低，二氧化碳含量达到5 ％时，霉菌将停止生长。霉菌不同的发育阶段对微氧胁迫的应激反应也各不相同：如果菌丝生长阶段缺氧，菌丝生长会受阻，导致生长缓慢或停止生长，且菌丝易衰老、死亡；子实体分化期间如果缺氧，原基则无法分化；如果发育期间缺氧，子实体会成畸形，甚至难以形成。

霉菌的菌落较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈蛛网状、绒毛状或棉絮状。霉菌菌落由孢子和菌丝组成，菌丝粗而长、易蔓延，甚至可扩展至整个培养皿。霉菌的孢子各种各样，具有小、轻、干、多、以及形态色泽各异、休眠期长和抗逆性强等特点，每个个体所产生的孢子数量巨大，有时达几千亿甚至更多。霉菌的繁殖能力极强，其任何一个孢子或者菌丝体上任一片段在适宜条件下都能发展成新的个体。霉菌孢子可通过空气传播使霉菌在培养中易随处散播、繁殖，从而造成污染和霉变。所以进行霉菌实验操作时应保持实验室平静、动作轻柔、减少空气流动，实验后应立刻将所有的霉菌培养物高压灭菌，防止进一步扩散。常规霉菌检测的培养过程中，为了维持充足的氧气供给通常需要保持空气的畅通，所以恒温培养箱的空气循环系统将主动促使空气流动，但是空气的流动可造成早期发育形成的霉菌孢子在培养皿内散落形成新的菌落，也会导致霉菌孢子溢出培养皿、扩散至外部造成大范围的环境污染，引起交叉污染和外部侵染，而环境中悬浮的孢子将严重污染后期其它霉菌的培养和检测。此外，在观察霉菌菌落时，培养皿的反转、移动将进一步加剧霉菌孢子的扩散。

因此，霉菌项目检测过程中霉菌孢子的扩散及污染是一种常见而又非常棘手的问题，始终困扰着相关科技人员，且目前无有效的控制措施。

发明内容

本发明的目的在于提供一种霉菌的密闭式培养方法,为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

所述的霉菌的密闭式培养方法，包括以下步骤：

a． 称取适量样品至均质袋中，补充适量无菌缓冲液（缓冲液与样品的比例为10:1），用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的样品稀释液；

b． 取1:10样品稀释液1 mL，注入含有9 mL无菌缓冲液的试管中，漩涡振荡至混匀，制成1:100样品稀释液；按如此10倍递增稀释的方法制备1:1000和1:10000等稀释度的样品稀释液，每递增稀释一次，换用一支无菌吸管；

c． 在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度的样品稀释液分别吸取1 mL至2个无菌平皿内；

d．另分别取1 mL无菌缓冲液加入2个无菌平皿作空白对照；

e． 及时将15 mL～20 mL冷却至46 ℃的琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀；待凝固后得到琼脂平板；

f．取1个琼脂平板和至少1个无菌空白培养皿，共同放置于气密装置中，排出多余空气并将气密装置封口，形成密封状态；如此将所有的琼脂平板置于气密装置中，于28 ℃恒温培养箱内培养；

g． 经过适当的培养时间后，将气密装置自恒温培养箱内取出，观察并计数琼脂平板上的霉菌菌落，之后将气密装置（包括气密装置内部的琼脂平板和空白培养皿）进行灭菌处理；观察和处理过程中不得将气密装置的封口打开，使其始终维持密封状态。

所述的无菌缓冲液的种类包括无菌水、无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液等。

所述的琼脂培养基包括孟加拉红培养基、高盐察式培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基等。

所述的气密装置包括自封袋、密封盒等。

所述的适当的培养时间包括不同技术规范中要求的培养3天或5天或7天等。

所述的灭菌处理包括121 ℃、30 min的高压蒸汽灭菌，或者180 ℃、2 h高温干热灭菌，以及其它可能的灭菌方式。

与现有技术比较，本发明的有益效果是：在所述的密闭式培养方法中，富含霉菌菌种的待培养琼脂平板被放置于气密装置内部，用于霉菌的培养。而所述的处于密封状态的气密装置，将其内部空间与外界环境隔离，独立的内部空间形成了相对独立的培养环境，气密装置的内部空间与外界环境的物质交换被完全阻止，因此可以杜绝琼脂平板上生长的霉菌及其孢子的扩散、以及逃逸至气密装置的外部环境，可以有效防止霉菌培养过程中的环境污染和健康危害。气密装置隔绝物质交换的同时，也使得气密装置内部空间中的氧气无法获得外部环境的补充。而所述的气密装置中，被放置了1个琼脂平板和至少1个无菌空白培养皿，当气密装置内多余的空气被排出后，在此技术条件下，气密装置内部的空气与琼脂培养基的体积比≥3，此培养体系中，虽然氧气无法得到外部环境的补充，但是气密装置内部的氧气量能够满足霉菌正常生长代谢的需求，琼脂平板的霉菌计数结果不受气密装置的影响。本发明的密闭式培养方法可以广泛应用于各检测机构和科研院所的霉菌定量检测时的密闭式培养方法。

在此技术方案中，所述密闭式培养方法的霉菌计数结果准确性高、代表性强，可以推广至各检测实验室以及相关企业用于相关产品霉菌项目的监督与评管，本发明的密闭式培养方法结构简单、使用方便、且能有效防止霉菌项目检测过程中霉菌孢子的扩散及污染.本发明的密闭式培养方法有利于霉菌检测的质量控制和污染防治，具有重要的理论价值和现实意义。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明，应当理解，所描述的实施例仅仅用以解释本发明，不用于限定本发明。凡是基于本发明的技术方案所作的简化或者等同变化，均属于本发明的保护范围。

实施例一：八珍丸药品的霉菌检测中密闭式培养与敞开式培养的计数结果比对

本发明公开了一种霉菌的密闭式培养方法，采用以下技术方案以达到本发明实施例一的有益效果：

1. 试验八珍丸样品

自福州市各药店购买10批次八珍丸药品，用于本实施例的测试，10个样品的编号分别为1~10。

2. 菌悬液制备

取适量无菌生理盐水于含有冠突散囊菌（Eurotium cristatum，CGMCC 3.0462，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心）新鲜培养物的孟加拉红琼脂平板内，用无菌涂布棒轻轻刮取，使霉菌孢子游离于生理盐水中，制备成菌悬液（孢子悬液），于4 ℃保藏备用，保藏时间不超过7天。

3. 菌悬液霉菌计数

取1 mL菌悬液注入含有9 mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡混匀，制成1:10稀释液。取1 mL 1:10稀释液注入含有9 mL无菌水的试管中, 混匀制成1:100稀释液。如此制备1:1000稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL无菌移液管。在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL稀释液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL无菌生理盐水加入2个无菌平皿作空白对照。及时将15 mL～20 mL冷却至46 ℃的孟加拉红培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待凝固后，置于28 ℃恒温培养，5天后观察读数。结果为X_p。

4. 样品检测

a 称取10 g样品至均质袋中，补充无菌生理盐水至100 mL，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。

b 取1 mL 1:10 样品匀液注入含有9 mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡至混匀，制成1:100样品匀液。

c 在进行10倍递增稀释的同时，1:10和1:100两个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL无菌生理盐水加入2个无菌平皿作空白对照。

d 及时将15 mL～20 mL冷却至46 ℃的孟加拉红琼脂培养基（可放置于46 ℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

e 待凝固后，置于28 ℃恒温培养，5天后观察读数。结果为Z_i。

5. 样品加标的密闭式培养与敞开式培养测试

a 向实施例一中3.a的1:10的样品匀液中，加入1 ml的菌悬液，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的加标样品匀液。

b 取1 mL 1:10样品匀液注入含有9 mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡至混匀，制成1:100样品匀液。

c 在进行10倍递增稀释的同时，1:10和1:100两个稀释度分别吸取1 mL加标样品匀液于4个无菌平皿内。同时分别取1 mL无菌生理盐水加入4个无菌平皿作空白对照。

d 及时将15 mL～20 mL冷却至46 ℃的孟加拉红琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

e 待凝固后，在4个含有样品匀液于的平皿中，取2个直接置于28 ℃恒温培养，5天后观察读数。结果为X_i

f 4个含有样品匀液于的平皿中，剩余的2个平皿，每个平皿与1个无菌空培养皿堆叠放置，共同转移至自封袋中，排出多余空气并封口，置于28 ℃恒温密闭式培养，5天后观察读数。结果为Y_i。

6. 计数后的无害化处理

观察并计数孟加拉红琼脂平板上的霉菌菌落后，将自封袋（包括其内部的琼脂平板和空白培养皿）于121 ℃条件下高压蒸汽灭菌30 min，观察和处理过程中不得将自封袋的封口打开，使其始终维持密封状态。所述的处于密封状态的自封袋，将其内部空间与外界环境隔离，独立的内部空间形成了相对独立的培养环境，使自封袋的内部空间与外界环境的物质交换被完全阻止，因此可以杜绝琼脂平板上生长的霉菌及其孢子的扩散、逃逸至自封袋的外部环境，可以有效防止霉菌培养过程中的环境污染和健康危害。

7. 霉菌的密闭式培养与敞开式培养的计数结果分析

统计步骤5（样品加标的密闭式培养与敞开式培养测试）中孟加拉红琼脂平板的霉菌菌落数，并计算1:10稀释度样品匀液的两个平行平板（培养皿1与培养皿2）的平均值（、、）和标准差（σ_Xi、σ_Yi）。之后计算回收率（R值，公式为：R=X_i/X_p-Z_i/X_p），和重复性相关系数（r值，公式为：）。计数和计算结果如表1所示，其中回收率的最大值为1.26，最小值为0.84，符合2015年中国药典四部关于R值（0.5≤R≤2)的要求，因此所采用的方法和培养基适用于八珍丸的检验与研究。重复性相关系数（r值）的最大值为0.036，因此1~10样品以及菌液P的r值均符合ISO4833-2013关于r≤0.25的要求，因此敞开式培养和密闭式培养的计数结果无显著性差异。在此实施例一中，所述密闭式培养方法在有效防止霉菌培养过程中的环境污染和健康危害的同时，还具有与敞开式培养方法相同的准确性和代表性。

表1 八珍丸中霉菌的敞开式培养与封闭培养式比对结果

注：P代表菌液，“/”代表未进行相关测试，“-”代表未进行相关计算。

实施例二：饲料的霉菌检测中密闭式培养与敞开式培养的计数结果比对

本发明公开了一种霉菌的密闭式培养方法，采用以下技术方案以达到本发明实施例二的有益效果：

1. 试验饲料样品

自福州市购买13个批次的饲料样品，编号分别为1~13，用于本实施例的测试。

2. 样品检测

a 分别称取25 g饲料样品至均质袋中，补充225 mL无菌磷酸盐缓冲液，用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的样品稀释液。

b 取1 mL 1:10样品稀释液注入含有9 mL无菌磷酸盐缓冲液的试管中，漩涡振荡至混匀，制成1:100样品稀释液。按如此10倍递增稀释的方法制备1:1000稀释度的样品稀释液，每递增稀释一次，换用一支无菌吸管；

c 在进行10倍递增稀释的同时，1:100和1:1000两个稀释度的样品稀释液分别吸取1mL至4个无菌平皿内；另分别取1 mL无菌磷酸盐缓冲液加入4个无菌平皿作空白对照；

d 及时将15 mL～20 mL冷却至46 ℃的高盐察式琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

e 待凝固后，在4个含有样品稀释液的平皿中，取2个直接置于28 ℃恒温培养，7天后观察读数。

f 4个含有样品稀释液的平皿中，剩余的2个平皿，每个平皿与1个无菌空培养皿堆叠放置，共同转移至密封盒中，排出多余空气并封口，置于28 ℃恒温内密闭式培养，7天后观察读数。

3. 计数后的无害化处理

观察并计数高盐察式琼脂培养基平板上的霉菌菌落后，将密封盒（包括其内部的琼脂平板和空白培养皿）于180 ℃条件下干热灭菌120 min，观察和处理过程中不得将密封盒打开，使其始终维持密封状态。所述的处于密封状态的密封盒，将其内部空间与外界环境隔离，并完全阻止内外部的物质交换，因此可以杜绝高盐察氏琼脂培养基平板上生长的霉菌及其孢子的扩散、逃逸至密封盒的外部环境，可以有效防止霉菌培养过程中的环境污染和健康危害。

4. 霉菌的密闭式培养与敞开式培养的计数结果分析

统计实施例二中步骤2（饲料样品的密闭式培养与敞开式培养测试）的高盐察氏琼脂培养基的霉菌菌落数，并计算适宜稀释度样品稀释液的两个平行平板（培养皿1与培养皿2）的平均值（、）和标准差（σ_Mj、σ_Nj）。之后根据ISO4833-2013计算敞开培养与密闭式培养的再现性相关系数（值，公式为：）。计数和计算结果如表2所示，再现性相关系数的最大值为0.159，因此13个样品均符合ISO4833-2013关于再现性相关系数不大于0.45的要求，因此敞开式培养和密闭式培养的计数结果无显著性差异。在此实施例二中，所述密闭式培养方法在有效防止霉菌培养过程中的环境污染和健康危害的同时，还具有与敞开式培养方法相同的准确性和代表性。

表2 饲料中霉菌的敞开式培养与封闭式培养比对结果

以上通过对所列实施方式的介绍，阐述了本发明的基本构思和基本原理。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，并非限定性穷举。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种霉菌的密闭式培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

a． 称取适量样品至均质袋中，补充适量无菌缓冲液,缓冲液与样品的比例为10:1，用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的样品稀释液；

b． 取1:10样品稀释液1 mL，注入含有9 mL无菌缓冲液的试管中，漩涡振荡至混匀，制成1:100样品稀释液；按如此10倍递增稀释的方法制备1:1000和1:10000等稀释度的样品稀释液，每递增稀释一次，换用一支无菌吸管；

c． 在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度的样品稀释液分别吸取1 mL至2个无菌平皿内；

d．分别取1 mL无菌缓冲液加入2个无菌平皿作空白对照；

e． 及时将15 mL～20 mL冷却至46 ℃的琼脂培养基,放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温,倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀；待凝固后得到琼脂平板；

f．取1个琼脂平板和至少1个无菌空白培养皿，共同转移至气密装置中，排出多余空气并将气密装置封口，形成密封状态；如此将所有的琼脂平板置于气密装置中，于28 ℃恒温培养箱内培养；

g． 经过适当的培养时间后，将气密装置自恒温培养箱内取出，观察并计数琼脂平板上的霉菌菌落，之后将气密装置,包括气密装置内部的琼脂平板和空白培养皿,进行灭菌处理；观察和处理过程中不得将气密装置的封口打开，使其始终维持密封状态;

所述的无菌缓冲液的种类包括无菌水、无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液;

所述的琼脂培养基包括孟加拉红培养基、高盐察式培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基;

所述的气密装置包括自封袋、密封盒;

所述的适当的培养时间包括不同技术规范中要求的培养3天或5天或7天;

所述的灭菌处理包括121 ℃、30 min的高压蒸汽灭菌，或者180 ℃、2 h高温干热灭菌，以及其它可能的灭菌方式。