CN108548922A - 检测yap k342甲基化修饰的试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测YAP K342甲基化修饰的试剂及其应用。具体公开了YAP K342甲基化修饰作为肿瘤诊断和预后分析标志物，尤其用于肺癌和肠癌肿瘤的诊断和预后。本发明发现YAP发生单甲基化修饰的位点K342，并且制备K342甲基化修饰多克隆抗体，实验显示YAP K342甲基化修饰在肺癌和肠癌中呈现特异性高表达现象，而在正常组织中没有这种特异性高表达现象。并且K342甲基化修饰与肿瘤病人预后呈明显负相关。因此YAP K342甲基化修饰可作为肿瘤诊断和预后分析的标志物，尤其是作为肺癌和肠癌诊断的标志性物质，能够明确清楚地表征肿瘤的发生与不良预后。本发明为临床诊断与治疗方案提供了重要参照依据。

Description

检测YAP K342甲基化修饰的试剂及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物技术领域，尤其涉及检测YAP K342甲基化修饰的试剂在肺癌和肠癌早期诊断及预后中的应用。
背景技术
肿瘤作为重大疾病，严重危险人类健康与生命。我国的癌症病人在发现癌症时，大多数已到中晚期，或者已经转移。因此，肿瘤的早期诊断对于肿瘤的防治与治疗具有重要意义，长期以来寻找能早期诊断的肿瘤标志物成为肿瘤研究关注的焦点之一。虽然目前已经研究出多种肿瘤标志物，包括肿瘤胚原性抗原(AFP)、肿瘤抗体CA、癌基因或者抑癌基因等等。然而，这些肿瘤标志物检测假阳性比率仍非常高，尤其是各种恶性肿瘤标志物尚未真正发现，这给肿瘤诊断和治疗带来了难题。
Hippo信号通路是近年来发现的重要的信号通路，主要通过细胞增殖和凋亡进行调控器官发育。Hippo信号通路与肿瘤的发生发展密切相关。YAP作为Hippo信号通路下游重要的信号因子，参与维持器官大小和组织稳态。近年来的研究报道表明，在微环境因子直接或间接的影响下，Hippo信号通路失活，导致下游效应因子YAP活性持续增强，参与肿瘤发生发展。Hippo信号通路调节异常与多种肿瘤相关，如乳腺癌，胰腺癌，胃癌，肝癌和肺腺鳞癌转分化等。因此，进一步探讨YAP与肿瘤发生发展的关系，对于肿瘤的诊断治疗及预后分析研究具有重要意义。
中国专利2015104636167公开YAP1基因在阿尔茨海默病诊治中的应用，具体公开YAP1 基因可以作为阿尔茨海默病早期诊断的分子标志物，QPCR实验证明与正常人群相比，阿尔茨海默病患者血液中的YAP1基因表达显著升高。中国专利2017100627435公开YAP1基因及抑制剂在增强膀胱癌干细胞化疗敏感性中的应用，具体公开YAP1基因及抑制剂在增强膀胱癌干细胞化疗敏感性中的应用，实验证明YAP1基因与膀胱癌干细胞化疗敏感性有关，YAP1基因高表达的抑制剂可以通过下调YAP1基因表达提高膀胱癌干细胞对化疗药物丝裂霉素C和顺铂的化疗敏感性，提高化疗药物丝裂霉素C和顺铂对膀胱癌干细胞的抑制率。现有技术中，关于本发明肿瘤诊断及预后分析标志物---YAP K342甲基化修饰，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤诊断和预后分析的标志物，尤其是作为肺癌和肠癌诊断的标志性物质，能够明确清楚地表征肿瘤的发生与不良预后。
本发明的第一个目的，提供检测SET1A表达的试剂或检测YAP K342甲基化修饰的试剂在制备检测肺癌或肠癌的试剂盒中的应用。
本发明的第二个目的，提供检测SET1A表达的试剂或检测YAP K342甲基化修饰的试剂在制备检测肺癌或肠癌患者预后的试剂盒中的应用，所述SET1A和YAP K342甲基化修饰在肿瘤组织中明显高表达，同时与肿瘤病人预后呈明显负相关。
作为本发明的一个优选实施方案，所述检测YAP K342甲基化修饰的试剂为YAPK342 甲基化修饰特异性抗体。
作为本发明的一个优选实施方案，所述检测SET1A表达的试剂为SET1A蛋白的特异性抗体。
作为本发明的一个优选实施方案，所述特异性抗体制备方法如下：将抗原多肽与载体蛋白钥孔血蓝蛋白偶联形成抗原并免疫宿主动物，通过特异性亲和纯化方法获得特异性识别 K342甲基化修饰的抗体。K342甲基化修饰多克隆抗体，特异性识别肿瘤组织中的YAP甲基化修饰水平。
作为本发明的一个优选实施方案，所述抗原多肽序列为：CQELALRSQLPTLC。
本发明提供YAP K342甲基化修饰作为肿瘤诊断和预后分析标志物，尤其用于肺癌和肠癌肿瘤的诊断和预后。本发明发现YAP发生单甲基化修饰的位点K342，并且制备K342甲基化修饰多克隆抗体，实验显示YAP K342甲基化修饰在肺癌和肠癌中呈现特异性高表达现象，而在正常组织中没有这种特异性高表达现象。并且K342甲基化修饰与肿瘤病人预后呈明显负相关。因此YAP K342甲基化修饰可作为肿瘤诊断和预后分析的标志物，尤其是作为肺癌和肠癌诊断的标志性物质，能够明确清楚地表征肿瘤的发生与不良预后。本发明通过检测YAP K342甲基化修饰在组织中的表达情况，可以快速、准备及清楚地判断肿瘤的发生及肿瘤病人预后状态。
本发明发现甲基转移酶SET1A催化YAP K342甲基化修饰，并且SET1A在肺癌和肠癌中呈现特异性高表达，而在正常组织中低表达。且SET1A高表达与肿瘤病人预后呈明显负相关。因此甲基转移酶SET1A可作为肿瘤诊断和预后分析的标志物，尤其是作为肺癌和肠癌诊断的标志性物质，能够明确清楚地表征肿瘤的发生与不良预后。
本发明提供了一种具有良好发展前景的检测方法。YAP已知在多种肿瘤中表达和活性异常，本发明发现K342甲基化修饰调控YAP活性持续增强，并在肺腺癌和肠癌肿瘤组织中高表达，同时呈现与病人预后负相关性。本发明提供了同时表征肿瘤诊断和病人预后分析的肿瘤标志物，并获得特异性检测的修饰性抗体，为临床诊断与治疗方案提供了重要参照依据。
附图说明
附图1为免疫共沉淀内源YAP后质谱鉴定结果示意图。
附图2为YAP K342位点在不同物种中保守性分析。
附图3为YAP K342甲基化修饰抗体特异性检测结果图。
附图4为SET1A、YAP和K342甲基化修饰在肿瘤组织中表达与肿瘤病人预后相关性分析。
具体实施方式
下面将针对本发明内容详细描述具体的技术方案与实施步骤。本领域技术人员将会理解，以下材料方法及实施步骤仅为本发明的优选方案，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例
1、实施方法与步骤
首先，作为本发明的优选，所述YAP K342甲基化修饰位点通过质谱方法确定。我们采用YAP抗体免疫共沉淀非小细胞肺癌细胞系H1299细胞的内源YAP，免疫共沉淀样本直接质谱分析。根据质谱结果，在YAP的342位赖氨酸(K)上发生单甲基化修饰(图1)。并且这一位点在哺乳动物中非常保守(图2)。
第二步，本发明制备K342甲基化修饰兔多克隆抗体。作为本发明的优选，所述K342甲基化修饰抗体的抗原多肽序列如下所示：
K342-monomethylated peptide(K342-me):TANSPK(me)CQELALRSQLPTLC
本发明提供新西兰大白兔作为宿主，合成抗原多肽与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联形成抗原免疫宿主动物。抗体血清采用特异性亲和纯化方法获得特异性识别K342甲基化修饰的抗体。本发明中，从Western blot、免疫荧光和免疫组化水平分别检测K342甲基化修饰抗体的特异性与效价(图3)。
第三步，本发明发现YAP K342甲基化修饰在肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤病人预后相关。作为本发明的优选，90例肺腺癌和90例肠癌组织芯片用于检测肿瘤组织和正常组织中YAP及K342甲基化修饰水平差异(图4)。同时，本发明发现甲基转移酶SET1A催化YAPK342甲基化修饰，并且SET1A表达水平在肿瘤组织和正常组织中明显不同(图4)。本发明中，SET1A、YAP和K342甲基化修饰水平与肿瘤病人预后分析明显相关(图4)。
2、实验结果及分析
本发明通过质谱分析获得YAP单甲基化修饰位点第342位赖氨酸，通过多克隆抗体的制备获得K342甲基化修饰特异性抗体，检测肺腺癌和肠癌肿瘤组织中SET1A、YAP和K342甲基化修饰水平，发现SET1A、YAP和K342甲基化修饰在肿瘤组织中表达水平明显高于正常组织，并且与肿瘤病人的预后分析呈明显负相关。
图1中(A)图为质谱鉴定显示YAP甲基化修饰位点，图中显示甲基化修饰的信号峰。
图2中(A)图为YAP K342位点在不同物种中序列分析，图中显示K342位点在哺乳动物中相当保守。
图3中(A-B)图为Western blot和Dot blot方法分别体外检测K342甲基化修饰只识别甲基化修饰多肽，而不识别没有甲基化修饰的多肽抗原。(C-D)图为分别选择YAP基因敲除细胞系(YAP KO 293A)和YAP基因敲除小鼠肝组织(Yap KO mouse liver tissue)检测K342 甲基化修饰抗体特异性识别内源性YAP。(E)图采用免疫荧光法在YAP KO 293A细胞系中检测K342甲基化修饰抗体特异性识别内源性YAP，且发生细胞核定位。(F)图采用免疫组化法在Yap KO mouse liver tissue中检测K342甲基化修饰抗体特异性识别内源性YAP。本发明从 Western blot、免疫荧光和免疫组化水平分别检测K342甲基化修饰抗体的特异性与效价。
图4中(A-B)图为分别在肺腺癌和肠癌肿瘤组织和正常组织中检测SET1A、YAP和K342 甲基化修饰的表达水平，结果显示SET1A、YAP和K342甲基化修饰在肿瘤组织中表达水平明显高于正常组织。(C-E)图为分析SET1A、YAP和K342甲基化修饰表达水平与肺腺癌病人预后相关性，结果显示SET1A、YAP和K342甲基化修饰表达水平与肺癌预后呈明显负相关。(F)图为分析SET1A、YAP和K342甲基化修饰表达水平与肠癌病人预后相关性，结果显示SET1A、YAP和K342甲基化修饰表达水平与肠癌预后呈明显负相关。本发明提供YAP K342 甲基化修饰作为肺腺癌和肠癌诊断和预后分析的肿瘤标志物。
YAP已知在多种肿瘤中表达和活性异常，本发明发现K342甲基化修饰调控YAP活性持续增强，并在肺腺癌和肠癌肿瘤组织中高表达，同时呈现与病人预后负相关性。本发明提供了同时表征肿瘤诊断和病人预后分析的肿瘤标志物，并获得特异性检测的修饰性抗体，为临床诊断与治疗方案提供了重要参照依据。
申请人申明，本发明通过上述实施步骤说明本发明的详细特征及检测方法，但本发明并不局限于上述详细特征及列举肿瘤类型。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进以及增加肿瘤类型的检测等，均属于本发明的保护和公开范围之内。

Claims (8)

1.检测SET1A表达的试剂或检测YAP K342甲基化修饰的试剂在制备检测肺癌或肠癌的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测YAP K342甲基化修饰的试剂为YAP K342甲基化修饰特异性抗体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SET1A表达的试剂为SET1A蛋白的特异性抗体。
4.检测SET1A表达的试剂或检测YAP K342甲基化修饰的试剂在制备检测肺癌或肠癌患者预后的试剂盒中的应用，所述SET1A和YAP K342甲基化修饰在肿瘤组织中明显高表达，同时与肿瘤病人预后呈明显负相关。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测YAP K342甲基化修饰的试剂为YAP K342甲基化修饰特异性抗体。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测SET1A表达的试剂为SET1A蛋白的特异性抗体。
7.根据权利要求2或权利要求5所述的应用，其特征在于，所述特异性抗体制备方法如下：将抗原多肽与载体蛋白钥孔血蓝蛋白偶联形成抗原并免疫宿主动物，通过特异性亲和纯化方法获得特异性识别K342甲基化修饰的抗体。
8.根权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗原多肽序列为：CQELALRSQLPTLC。
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