CN108546737A - 一种油菜转基因成分的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜转基因成分的检测方法，包括以下步骤：确定转基因成分、内源标准基因和外源标准基因；制备多重扩增引物；进行抽样并混合，得到混合样品；提取混合样品的基因组并加入外源标准基因，得到混合核酸；构建高通量测序文库；对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；获得待测样品中转基因成分的测序片段的数量；待检样品DNA在引物、Bst DNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；根据外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功并计算待测样品种中转基因成分的含量；根据转基因成分的含量判断待测样品中是否含有转基因成分。本发明能够同时定量检测待测样品中的任意多种转基因成分。

Description

一种油菜转基因成分的检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种油菜转基因成分的检测方法。

背景技术

油菜是我国主要作物，油菜转基因技术与产品均已成熟，需要对转基因油菜的推广进行监管，转基因成分检测是转基因监管的技术支撑。现有的转基因成分检测技术主要检测核酸或蛋白质，其中，基于核酸的检测方法主要流程为：提取待测样品中的核酸，利用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)的方法扩增样品中的转基因成分，利用实时定量、琼脂糖电泳或芯片技术检测转基因成分是否存在。

转基因成分多种多样，而现有技术一次只能检测其中一种或少数几种，因此，需要对可能的多种转基因成份逐一进行检测，才能确定为“非转基因”产品；一般检测的是共转化的转基因成分，而不是外源基因本身，因此，对于无标记转基因来说，采用现有的检测方法进行检测会失效；检测基本上是定性检测，但定量检测又有其现实需求，例如，相邻田块的转基因油菜品种的少量花粉被传到了非转基因品种上，在定性检测时，非转基因品种将被误判为转基因品种。

发明内容

本发明提供一种油菜转基因成分的检测方法，可以有效解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种油菜转基因成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为油菜植株或所述油菜植株的一部分；

S2、制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；

S3、对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；

S4、提取所述混合样品的基因组；

S5、向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；

S6、利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；

S7、对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；

S8、分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；

S9、待检样品DNA在引物、Bst DNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；

S10、结合所述外源标准基因的测序片段的数量以及根据扩增结果判断待检样品中是否存在转基因成分，判断实验是否成功；

S11、若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；

S12、根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。

进一步的，所述转基因成分为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种。

进一步的，所述内源标准基因为所述待测样品的基因组中的单拷贝基因。

进一步的，所述外源标准基因不存在于所有生物中。

进一步的，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量均≥α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败；其中，α1为判定阈值。

进一步的，所述判定所述待测样品是否含有转基因成分的方法为：当需要检测的任意一种所述转基因成分的含量≥α2时，判定所述待测样品含有转基因成分；当所有所述转基因成分的含量<α2时，判定所述待测样品不含有转基因成分；其中，α2为判定阈值。

进一步的，计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量的方法为：第 m种所述转基因成分的含量的计算公式为其中，i为所述第m种转基因成分的第i个所述测试区域，n1为所述第m种转基因成分的所述测试区域的个数， bi为所述第m种转基因成分的第i个所述测试区域的所述测序片段的数量，k 为第k种所述内源标准基因，n3为所述内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为所述第k种内源标准基因的所述测试区域的个数，aj为所述第k种内源标准基因的第j种所述测试区域的所述测序片段的数量；N为所有所述内源标准基因的所述测试区域的总数。

进一步的，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于1/100000。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明提供的检测方法可以在不同待测样品、不同检测的目标基因间通用，可以一次性检测任意多种需要检测的转基因成分，从而判定待测样品是否含有转基因成分，该方法可以实现定量检测，且检测结果几乎没有下限，结果准确可靠，是现有技术达不到的。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例：

通过农杆菌介导法将双丙氨酰磷抗性(Biolaphos resistance，Bar)基因导入湘油15油菜品种，自交纯化3代后，获得改造的湘油15油菜品种种子，作为本实施例的待测油菜品种。其中，湘油15油菜是转基因油菜受体品种，由湖南农业大学油料所育成，本实施例中使用的湘油15油菜种子由湖南农业大学油料所保存和繁殖。

油菜植物品种转基因成分检测方法，具体步骤如下：

S1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、待测样品中的内源标准基因和待测样品的外源标准基因，具体方法如下：待测样品为油菜植株或油菜植株的一部分，其中，油菜植株可以为油菜植株的根、茎、叶、花、果实和种子等器官，也可以是2种及2种以上的不同器官的混合物，如叶和茎的混合物，油菜植株的一部分可以为油菜植株的根、茎、叶、花、果实和种子等至少一个器官中的一部分。在本实施例中，待测样品为改造后的湘油15油菜的种子，转基因成分、内源标准基因和外源标准基因均≥1个，转基因成分可以为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种，即通过转基因技术手段向湘油15油菜品种中转入不存在于湘油 15油菜品种中的外源核酸序列；内源标准基因为待测样品的基因组中的单拷贝基因。在本实施例中，内源标准基因通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 在待测样品基因组上比对时为单一序列；外源标准基因不存在于所有生物中，在本实施例中，所使用的外源标准基因为ERCC04基因，其在NCBI上同源比对时，未发现同源序列，可以判定外源标准基因不存在于所有生物中。在本实施例中，检测的转基因成分共5种，内源标准基因1种，外源标准基因 1种，转基因成分不仅包括Bar基因，Bar基因为外源功能基因，还包括其他转基因成分，这些转基因成分在转基因作物中广泛使用，因此，本实施例提供的检测方法具有通用性。基因序列有两种表示方式，一种是直接写出基因序列，另一种是NBCI的基因编号，测序区域中的数字代表碱基的位置，该基因的第1个碱基的位置定义为1。

S2、制备用于扩增转基因成分、内源标准基因和外源标准基因的多重扩增引物，具体方法如下：

多重扩增引物的获取过程如下：登录赛默飞世尔公司多重PCR引物在线设计网页https://ampliseq.com/，在“Application type”选项选择“DNA Hot spot designs(single-pool)”。若选择multi-pool，则多重PCR将分多管进行，成本会有所增加，而single-pool的引物只需要一次多重PCR即可，节省成本，所以本实施例选择single-pool。将每一个基因的序列用100个N连接起来，形成一个人工参考基因组，并在“Select thegenome you wish touse”选项中选择“Custom”后，上传人工参考基因组。DNA Type(类型)选项选择“Standard DNA”(标准DNA)。在Add Hot spot选项中，每一个基因随机选择1个通过 NCBI同源比对获得的同源序列的同源性均低于80％的测试区域。其中，测试区域是指多重PCR的扩增区域，也是高通量测序的区域，由于测试区域与其它物种比较，无明显的同源序列，因此，可以代表被检测的基因，在高通量测序后，测试区域存在测序片段，则表明被检测的基因存在，测试区域的测序片段的数量，代表了被检测基因的量。此外，同源序列不包括转基因成分的原始来源物种中的序列，例如，CryIAc基因的原始来源物种为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)，因此，同源比对的对像不包括苏云金芽胞杆菌的基因组。为了保证本发明实施例的通用性，在NCBI上下载内源标准基因的种内的不同序列，通过同源比对，获得序列间的保守的区域，内源标准基因的测试区域选择为在种内边界序列保守的区域。进一步填写获得的每个测试区域的起始和终止位置，最后点击“Submittargets”按钮提交，获得扩增每一个基因的扩增引物的序列。多重扩增引物中每重引物的扩增效率均在95％～105％之间，因此，需要验证多重扩增引物的扩增效率。具体验证方法为：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成Bar基因的序列和扩增Bar 基因的测试区域的扩增引物序列，以合成的Bar基因的序列为模板，按照美国赛默飞世尔公司的Step One实时定量PCR仪的操作手册(Part Number 4376784Rev.E)检测扩增Bar基因的测试区域的扩增引物的扩增效率，若扩增效率不在95％-105％之间，则需要重新确定Bar基因的测试区域，设计并验证Bar基因的新的扩增引物的效率，直至其效率在95％-105％之间为止。按同样的方法，验证其它基因的扩增引物的扩增效率。最终入选的扩增引物的扩增效率、序列以及对应的扩增区域，所有最终入选的扩增引物称为多重扩增引物，多重扩增引物由美国赛默飞世尔公司合成并以混合液体的形式提供给使用者。本实施例采用美国赛默飞世尔公司提供的多重PCR技术，其能够同时扩增多至12000个测试区域，因此，本发明有能力一次性检测现有的所有需要检测的转基因成分。

S3、对待测样品进行抽样并混合，得到混合样品，具体方法如下：

将待测样品按照标准《转基因植物及其产品成分检测抽样》(标准号:农业部2031号公告-19-2013)的散装货物中油菜种子的抽样方法进行抽样，由于待测样品仅1种简单的来源，因此，抽样点改为1个，抽样样品的样本量>1000 粒种子，将所抽取的待测植物样本充分混合，得到混合样品。

S4、提取混合样品的基因组，具体方法如下：

参照标准《转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化》(标准号:农业部1485号公告-4-2010)中固态试样进行预处理后提取混合样品的基因组，提取出的为混合样品的基因组核酸。

S5、向混合样品的基因组中加入外源标准基因，得到混合核酸，具体方法如下：

利用分光光度计(美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中的双链DNA 程序，检测获得的混合样品的基因组的浓度。外源标准基因的质量与混合样品的基因组的总质量的比例大于1/100000，该比例用于保证在正常测序通量 (≥1M测序片段)下，高通量测序数据中可以检测到≥10条外源标准基因，若高通量测序通量更低或更高，可以对该比例做相应的调整。本实施例中，混合样品的基因组的总质量为1003ng，加入的外源标准基因为1.003ng，加入比例为1/1000，获得混合核酸。

S6、利用多重扩增引物对混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用扩增产物构建高通量测序文库，利用文库构建试剂盒2.0(由美国Life Technology 公司生产，货号为4475345)构建高通量测序文库。该文库构建试剂盒包括以下试剂：5×IonAmpli SeqTMHiFi Mix、FuPa试剂、转换试剂、测序接头溶液和DNA连接酶。文库构建的方法按该文库构建试剂盒的操作手册《IonAmpliSeqTMLibraryPreparation》(出版号：MAN0006735，版本：A.0) 进行。多重PCR的扩增体系如下：5×IonAmpli Seq TMHiFi Mix 4μL、制备的多重扩增引物的混合液体4μL、混合核酸10ng和无酶水11μL。多重PCR的扩增程序如下：99℃，2分钟；(99℃，15秒；60℃，4分钟)×25个循环；10℃保温。利用FuPa试剂消化掉多重PCR扩增产物中多余的引物后，再进行磷酸化，具体方法为：向多重PCR的扩增产物中加入2μLFuPa试剂，混匀后，在PCR仪上按如下程序反应：50℃，10分钟；55℃，10分钟；60℃，10分钟；10℃保存，得到混合物a，混合物a为含有经过磷酸化的扩增产物的溶液。将磷酸化的扩增产物连接上测序接头，具体方法为：向混合物a中加入转换试剂4μL、测序接头溶液2μL和DNA连接酶2μL，混匀后，在PCR仪上按如下程序反应：22℃，30分钟；72℃，10分钟；10℃保存，得到混合液b。利用标准的乙醇沉淀方法纯化混合液b后溶解于10μL无酶水中。利用美国 Invitrigen公司生产的dsDNAHS AssayKit(货号为Q32852)并按照其说明书进行检测，获得混合液b的质量浓度后，将纯化后的混合液b稀释至15ng/ml，得到浓度约100pM的高通量测序文库。

S7、对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组，具体方法如下：

利用获得的高通量测序文库和试剂盒IonPITemplateOT2200Kitv2(美国invirtrigen公司生产，货号为4485146)进行测序前的ePCR(EmulsionPCR，乳化聚合酶链反应)扩增，操作方法按该试剂盒的操作手册进行。利用ePCR产物和试剂盒IonPISequencing200Kitv2(美国invirtrigen公司生产，货号为 4485149)在Proton二代高通量测序仪上进行高通量测序，操作方法按该试剂盒的操作手册进行。在本实施例中，高通量测序量设置为1M测序片段(1M＝100万)，测序长度设置为500cycle(循环)，测序结束后，获得测序片段组。

S8、分析测序片段组，获得待测样品中转基因成分的测序片段的数量、内源标准基因的测序片段的数量和外源标准基因的测序片段的数量，具体方法如下：

根据测序片段的引物，利用blastall(version2.2.26)软件，按其默认的参数设置，将测序片段组比对到各对应检测基因上，比对成功的测序片段即代表检测到基因，从而分别获得待测样品中各种转基因成分的测序片段的数量、各种内源标准基因的测序片段的数量和外源标准基因的测序片段的数量。

S9、待检样品DNA在引物、Bst DNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；

S10、结合所述外源标准基因的测序片段的数量以及根据扩增结果判断待检样品中是否存在转基因成分，具体方法如下：

当外源标准基因的测序片段的数量和内源标准基因的测序片段的数量均≥α1时，则实验成功；当外源标准基因的测序片段的数量或内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败，实验失败后需要重新进行实验，直至实验成功为止；其中，α1为判定阈值，其大小依据要求的严格程度和经验人为判定，一般来说，若在高通量测序数据中，可以检测到10条以上的测序片段，表明所检测的基因是存在的。在本实施例中，α1可以取10条测序片段，外源标准基因的测序片段的数量和内源标准基因的测序片段的数量均≥10条，因此证实，本次实验是成功的。

S11、若实验成功，则计算待测样品种中转基因成分的含量，第m种转基因成分的含量的计算公式为其中，i为第m种转基因成分的第i个测试区域， n1为第m种转基因成分的测试区域的个数，bi为第m种转基因成分的第i 个测试区域的测序片段的数量，k为第k种内源标准基因，n3为内源标准基因的个数，j为第k种内源标准基因的第j个测试区域，n2为第k种内源标准基因的测试区域的个数，aj为第k种内源标准基因的第j种测试区域的测序片段的数量；N为所有内源标准基因的测试区域的总数。

在本实施例中，共检测了5种转基因成分，所以m＝5，每一种转基因成分分别检测了1个测试区域，所以，n1＝1，共检测了1个内源标准基因，所以n3＝1，每个内源标准基因共检测了1个测试区域，所以，n2＝1，N＝3，每一种转基因成分与每一个内源标准基因的测序片段的数量，将它们代入转基因成分的含量的计算公式中可得到每一种转基因成分的含量。本实施例通过5对多重扩增引物，一次性地定量检测了5种转基因成分的含量。在本实施例子的基础上，只需要增加更多的多重扩增引物，即可实现一次定量检测任意多种需要检测的转基因成分的含量。此外，也可以检测转基因成分、内源标准基因及外源标准基因的多个测试区域，通过平均数消除因不同基因或不同测试区域的不同扩增效率而造成的测试误差，本实施例由于将每一个检测的基因的每一个测试区域的扩增效率都控制在了95％-105％之间，误差较小，为节省成本，所以每一个基因只选择了一个测试区域。

S12、根据转基因成分的含量判断待测样品中是否含有转基因成分，具体方法如下：

当需要检测的任意一种转基因成分的含量≥α2时，则判定待测样品含有转基因成分；当所有转基因成分的含量<α2时，判定待测样品不含有转基因成分；其中，α2为判定阈值。

在国标《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》(标准号:GB/T19495.5-2004)中设定的转基因成份检测下限为0.1％。本实施例中，将α2的值设定为0.1％，用于判定待测样品是否为转基因产品。由于本发明采用测序检测转基因成分，而测序技术得到的是数字信号，即测到与没有测到两种情况，因此，几乎没有技术下限，与传统的芯片检测技术或实时定量 PCR检测技术比较，没有背景噪音干扰的问题，因此，判定待测样品是否为转基因产品的判定阈值可以根据具体情况要求的严格程度自由设定。本实施例子中，5种所检测的转基因成分之中，除CryIAc外，其余4种转基因成分的含量均≥α2＝0.1％，因此，判定本实施例中的待测样品含有转基因成分，该待测样品为转基因植物。

结果验证：根据《转基因植物及其产品成分检测Bar基因或pat基因定性 PCR方法》(标准号：农业部1782号公告-6-2012)所提供的方法对待测样品进行了检测，检测结果表明待测样品含有转基因成分，这与本实施例的结果一致，由此可见，本实施例提供的检测方法是正确的。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,包括以下步骤：

S1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为油菜植株或所述油菜植株的一部分；

S2、制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；

S3、对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；

S4、提取所述混合样品的基因组；

S5、向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；

S6、利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；

S7、对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；

S8、分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；

S9、待检样品DNA在引物、Bst DNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；

S10、结合所述外源标准基因的测序片段的数量以及根据扩增结果判断待检样品中是否存在转基因成分，判断实验是否成功；

S11、若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；

S12、根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。

2.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,所述转基因成分为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,所述内源标准基因为所述待测样品的基因组中的单拷贝基因。

4.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,所述外源标准基因不存在于所有生物中。

5.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量均≥α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败；其中，α1为判定阈值。

6.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,所述判定所述待测样品是否含有转基因成分的方法为：当需要检测的任意一种所述转基因成分的含量≥α2时，判定所述待测样品含有转基因成分；当所有所述转基因成分的含量<α2时，判定所述待测样品不含有转基因成分；其中，α2为判定阈值。

7.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量的方法为：第m种所述转基因成分的含量的计算公式为其中，i为所述第m种转基因成分的第i个所述测试区域，n1为所述第m种转基因成分的所述测试区域的个数，bi为所述第m种转基因成分的第i个所述测试区域的所述测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为所述第k种内源标准基因的所述测试区域的个数，aj为所述第k种内源标准基因的第j种所述测试区域的所述测序片段的数量；N为所有所述内源标准基因的所述测试区域的总数。

8.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于1/100000。