CN108541586A - 一种桉树三倍体的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物遗传育种领域，公开了一种桉树三倍体的诱导方法，包括对处于减数分裂时期的桉树花蕾注入秋水仙碱诱变剂，进行秋水仙碱诱变处理。本发明方法显著提高桉树三倍体的诱导率，增强施加诱导剂的时效性，同时避免嵌合体的产生，提高了三倍体桉树选育效率，具有很强的可操作性，并且对其他植物三倍体诱导等也具有重要借鉴意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导桉树三倍体的方法，尤其涉及一种通过在大孢子母细胞减数分裂的特定阶段利用毛细管原理或使用医用输液器将秋水仙碱溶液导入桉树花枝木质部钻孔内，以实现诱导桉树花蕾大孢子染色体加倍选育三倍体植株的方法，属于植物遗传育种领域。
背景技术
多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。自然界中植物多倍体的发生均来自细胞核内染色体组的倍数变异，即体细胞分裂过程中偶然发生的染色体加倍或减数分裂过程中产生的未减数配子与正常配子杂交。目前，人工诱导染色体加倍主要采用秋水仙碱等化学诱导方法，以及异常温度等物理诱导方法。
桉树属于二倍体(2n＝2x＝22)，是世界上最为重要的用材、纸浆用经济树种，在我国种植面积已超过440万hm2，每年为我国提供超过25％的木材产量和40％的木浆产量(项东云.广西桉树的产业贡献[J].广西林业,2014(5):16-17)。目前，桉树良种选育的主要途径是杂交育种，尽管已选育出一些用于推广生产的优良无性系，但年均蓄积生长量等重要指标相距同时期国际先进水平仍有较大差距，常规育种难有更大突破(谢耀坚.中国桉树育种研究进展及宏观策略[J].世界林业研究,2011,24(4):50-54)。而植物多倍体由于细胞核内染色体数目的倍增，在生长速度、增进品质、增强抗性等方面都具有巨大优势。已有研究报道，与普通毛白杨相比，三倍体毛白杨材积生长量提高2-3倍(朱之悌,林慧斌等.毛白杨异源三倍体B301等无性系选育的研究[J].林业科学,1995,31(6):499-506)，纤维长增加52.4％，木质素含量降低17.9％，α-纤维素含量提高5.8％(姚春丽和蒲俊文.三倍体毛白杨化学组分纤维形态及制浆性能的研究[J].北京林业大学学报,1998,20(5):18-21)。显然，采用综合倍性优势和杂交优势的多倍体育种途径，对于克服传统杂交育种技术的局限性，突破桉树育种停滞不前的现状具有重要意义。
目前，尚未有发现天然多倍体桉树的报道，因此必须采用人工诱导的方式开展桉树多倍体选育工作。胡洲鹤等曾以尾巨桉和尾叶桉的丛生芽和单芽为材料，采用0.50％秋水仙碱溶液经过48-144h的诱导处理，获得了少量多倍性的变异芽，但无法进一步从嵌合体中分离出纯和多倍体(胡洲赫,覃子海等.秋水仙素诱导桉树多倍体的初步研究[J].广西林业科学,2004,33(4):195-196,203)。此后，谭德冠等采用不同浓度秋水仙碱溶液对刚果12号桉愈伤组织和丛生芽进行处理，获得了四倍体植株(谭德冠,庄南生等.刚果12号桉离体组织的多倍体诱导[J].热带作物学报,2005,26(2):50-54)。韩超等则以尾巨桉和巨桉组培苗的腋芽为材料，经不同浓度、不同时长的秋水仙碱溶液处理，同样获得了四倍体植株(韩超,徐建民等.秋水仙素诱导尾巨桉多倍体的研究[J].中国农学通报,2010,26(15):149-153；韩超,徐建民等.秋水仙素诱导巨桉无性系Eg5多倍体的研究[J].中国农学通报,2010,26(24):128-132)。但需要指出的是，上述方法获得的植株嵌合率高难以分离纯化，且均为同源四倍体无生长优势，难以实现倍性优势和杂种优势的综合利用。
利用未减数2n花粉经授粉杂交可以获得三倍体，由于未有发现天然桉树2n花粉的报道，因此仍需要通过人工诱导途径获得。杨珺曾分别采用高温处理的物理方法和秋水仙碱处理的化学方法，获得了一定比率的桉树2n花粉，其中高温处理可以获得不超过1％的2n花粉，而秋水仙碱溶液处理的有效率最高为28.71％，但受限于2n花粉自身竞争力差等原因，并且桉树为虫媒树种，花粉量稀少且收集困难，无法进一步应用于三倍体的选育工作(杨珺.桉树生殖生物学基础与染色体加倍技术研究[D].北京林业大学,2015)。因此，采用人工诱导2n花粉授粉杂交选育桉树三倍体的技术途径也不可取。
与利用2n花粉相比，由于不存在配子竞争性的问题，利用人工诱导2n雌配子经授粉杂交选育三倍体具有更高的可行性。以应用该途径最为成熟的杨树三倍体选育过程为例，李云等曾以切枝水培1-5d的白杨雌花枝为材料，采用注射、棉浸、瓶浸等方法将0.25-0.75％秋水仙碱和1％二甲基亚砜混合液作用于雌花芽，经过授粉结实、播种育苗和子代植株倍性水平检测，共获得13株三倍体植株，并进一步证实使用0.50％秋水仙碱溶液经瓶浸法处理，诱导白杨大孢子染色体加倍选育三倍体的方法最为有效(李云,朱之悌等.秋水仙碱处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究[J].林业科学,2001,37(5):68-74)；康向阳等则将白杨花枝进行切枝水培，在完成授粉后8-48h内，采用0.50％秋水仙碱溶液对花序进行24-48h的浸泡处理，经过种子收集、播种育苗和子代倍性检测，获得21株三倍体植株(康向阳,张平冬等.秋水仙碱诱导白杨三倍体新途径的发现[J].北京林业大学学报,2004,26(1):1-4)，并经李艳华证实其来源为胚囊染色体加倍(李艳华.白杨雌配子染色体加倍技术研究[D].北京林业大学,2007)。然而，上述方法无法适用于桉树三倍体选育工作，这是由于桉树属于高大乔木，树高往往超过20m，并且由于种子成熟期长，从受精完成到种子成熟需要经历8-10个月，无法通过切枝水培后，便捷的进行化学处理。此外，由于桉树花蕾具备厚实的革质外皮，且花蕾蒴盖内部结构紧实，已有报道的直接对花蕾进行注射、棉浸、瓶浸等常规化学处理方法均会导致花蕾枯死，无法获得种子。
从已有的多倍体育种的成功经验来看，由于无论是通过秋水仙碱处理的化学方法，还是通过高温处理的物理方法，都是通过作用于细胞分裂的敏感时期使处于分裂阶段的细胞被阻止在中期，从而导致细胞内染色体数目的倍增(康向阳,王君.杨树多倍体诱导技术研究[M].北京:科学出版社,2010)。由于大孢子母细胞减数分裂进程不能即时观察，难以确定影响雌配子染色体加倍的减数分裂有效处理时期，因此，有关雌配子染色体加倍研究往往通过对大批量材料的处理及筛选，工作量大却往往不能取得理想的结果，可重复性较差。杨珺曾尝试利用桉树雌雄同花的特性，通过常规细胞学观察的方法分析了桉树同一花蕾内长、短两种花丝雄蕊小孢子母细胞减数分裂进程与该花蕾雌配子发生发育进程的时序性对应关系，并结合桉树花蕾直径发育规律，推测当选定的桉树花枝上发育进度最快的花蕾内短花丝雄蕊进入小孢子母细胞减数分裂细线期后的第3天时，直径小于4.0mm的花蕾，可能是理化处理诱导桉树大孢子染色体加倍的最佳处理对象，并在此基础上对非离体的尾细桉花蕾施加高温和秋水仙碱处理，但最终并未获得三倍体(杨珺.桉树生殖生物学基础与染色体加倍技术研究[D].北京林业大学,2015)。未能取得成功的原因在于桉树不同花蕾发育进程高度不同步，具体表现为不同花枝间，以及同一花枝不同位置上的花蕾减数分裂进程的高度不同步；不同种桉树，或同种桉树在不同生长环境下花蕾直径生长速率也有所不同，依靠花蕾直径预判大孢子母细胞减数分裂进程的方法具有很大的局限性。在处理时机的选择上，其提出的方法也未能全面考虑化学药剂在花枝内运输扩散到达作用部位所需的时间，以及作用于细胞分裂特定时期所需的反应时间，致使加倍处理时机的选择方法不准确，无法诱导获得桉树三倍体。此外，已有的针对桉树大孢子染色体加倍的化学处理方法的有效性同样未得到实践的验证。
目前，秋水仙碱处理诱导桉树大孢子染色体加倍选育三倍体的有效处理时期尚未揭示，其有效处理方法和处理条件也尚未明确；在桉树不同位置花蕾发育进程高度不同步的情况下，能够即时判别大孢子染色体加倍有效处理时机的方法也未解决。因此，解决秋水仙碱处理诱导桉树大孢子染色体加倍的有效处理时机以及相关技术问题，对于实现人工诱导桉树三倍体，以及将该方法引入其他植物三倍体选育工作等具有重要的实际价值。
发明内容
本发明针对现有桉树三倍体诱导方法存在的技术缺陷，提供一种诱导桉树三倍体的方法，本发明方法确定了秋水仙碱处理诱导桉树大孢子染色体加倍的有效处理时机及处理条件，解决了桉树花蕾发育进程同步性不一致导致开展处理的时机难以确定的问题，首次提出一种系统而有效的桉树三倍体诱导方法，并且三倍体桉树得率高，为进一步选育桉树三倍体优良品种创造有利条件。
为实现上述目的，本发明提供一种桉树三倍体诱导方法，包括对处于减数分裂时期的桉树花蕾注入秋水仙碱诱变剂，进行秋水仙碱诱变处理。
其中，所述减数分裂时期是指桉树花枝上直径最大，发育进度最快的花蕾内首次观察到小孢子母细胞处于减数分裂细线期后的5-10天。
特别是，所述减数分裂时期是指桉树花枝上直径最大，发育进度最快的花蕾内首次观察到小孢子母细胞处于减数分裂细线期后的6-7天。
尤其是，所述减数分裂时期是指桉树花枝上直径最大，发育进度最快的花蕾内首次观察到小孢子母细胞处于减数分裂细线期后的7天。
其中，所述桉树选择尾叶桉(Eucalyptus urophylla)、巨桉(E.grandis)、粗皮桉(E.pellita)或尾巨桉杂交种(E.urophylla×E.grandis)；优选的为尾叶桉(Eucalyptusurophylla)。
特别是，所述秋水仙碱诱变液的质量百分浓度为0.25-0.50％，优选为0.25％、0.5％，进一步优选为0.25％；诱变处理时间为3-12h，优选为6h。
尤其是，所述诱变处理过程中，秋水仙碱诱变液的用量为10-150ml。
本发明另一方面提供一种桉树三倍体的诱导方法，包括如下步骤：
1)选定待诱变处理桉树花枝，并观察选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂状态；
2)当观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现时，开始计时；
3)在观察到细线期出现后的第5-10天内，在直径为10-30mm的花枝基部钻孔，然后向孔内注入秋水仙碱诱变液，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
其中，步骤1)中所述观察为首先对选定的待诱变处理花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内花药进行醋酸洋红染色压片；然后将压片置于显微镜观察花药内小孢子母细胞的减数分裂状态。
其中，步骤3)中在观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现后第6-7天，对花枝钻孔，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
特别是，在观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现后第7天，对大花枝钻孔，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
其中，步骤3)中所述在直径为10-30mm的大花枝基部钻孔过程中，钻孔方向与花序生长方向相平行。
特别是，钻孔的孔径为1-2mm，优选为1.5mm；钻孔的深度为2-15mm，优选为10mm。
尤其是，步骤3)中在直径为(20±2)mm的大花枝的基部钻孔。
其中，所述秋水仙碱诱变液的质量百分浓度为0.25-0.50％，优选为0.25％、0.5％，进一步优选为0.25％；诱变处理时间为3-12h，优选为6h。
特别是，所述诱变处理过程中，秋水仙碱诱变液的用量为50-150ml，优选为100ml。
尤其是，采用医用输液器向所述钻孔内注入所述的秋水仙碱诱变液。
特别是，还包括步骤4)，在向孔内注入秋水仙碱诱变液结束后，使用保鲜膜缠绕封闭花枝上的钻孔。
本发明再一方面提供一种桉树三倍体的诱导方法，包括如下步骤：
A)选定待诱变处理桉树花枝，并观察选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂状态；
B)当观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现时，开始计时；
C)在观察到细线期出现后的第5-10天内，在距离花序5-12mm处，对直径为2-5mm的花枝钻孔，然后向孔内注入秋水仙碱诱变液，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
其中，步骤A)中所述观察为首先对选定的待诱变处理花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内花药进行醋酸洋红染色压片；然后将压片置于显微镜观察花药内小孢子母细胞的减数分裂状态。
其中，步骤C)中在观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现后第6-7天，对花枝钻孔，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
特别是，在观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现后第7天，对花枝钻孔，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
其中，步骤C)中在对所述直径为2-5mm的小花枝钻孔过程中，钻孔方向与花序生长方向相平行。
特别是，钻孔的孔径为1-2mm，优选为1.5mm；钻孔的深度为1-2mm，优选为1mm。
尤其是，步骤C)中在距离花序(10±1mm)处，对直径为(3±1)mm的小花枝钻孔。
其中，所述秋水仙碱诱变液的质量百分浓度为0.25-0.50％，优选为0.25％、0.5％，进一步优选为0.25％；诱变处理时间为3-12h，优选为6h。
特别是，所述诱变处理过程中，秋水仙碱诱变液的用量为10-30ml，优选为15ml。
尤其是，步骤C)中将棉线绳一端置于钻孔内，另一端置于秋水仙碱诱导液，利用毛细管原理，将所述秋水仙碱诱导液注入钻孔内，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
特别是，还包括步骤D)，在向孔内注入秋水仙碱诱变液结束后，使用保鲜膜缠绕封闭花枝上的钻孔。
本发明又一方面提供一种桉树三倍体的诱导方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)采用秋水仙碱溶液对处于减数分裂时期的桉树花蕾进行诱变处理；
2)诱变处理后的花蕾自然授粉，结实；
3)待种子成熟后，收集种子，播种育苗，检测子代植株倍性水平，筛选获得三倍体桉树植株。
其中，步骤1)中所述秋水仙碱诱变液的质量百分浓度为0.25-0.50％，优选为0.25％、0.5％，进一步优选为0.25％；诱变处理时间为3-12h，优选为6h。
特别是，所述诱变处理过程中，秋水仙碱诱变液的用量为10-150ml。
其中，所述诱变处理包括如下步骤：
1A)选定待诱变处理桉树花枝，并观察选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂状态；
1B)当观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现时，开始计时；
1C)在观察到细线期出现后的第5-10天内，在直径为10-30mm的大花枝基部钻孔，然后向孔内注入秋水仙碱诱变液，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
特别是，步骤1C)中所述诱变处理过程中，秋水仙碱诱变液的用量为50-150ml，优选为100ml。
其中，所述诱变处理包括如下步骤：
1a)选定待诱变处理桉树花枝，并观察选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂状态；
1b)当观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现时，开始计时；
1c)在观察到细线期出现后的第5-10天内，在距离花序5-12mm处，对直径为2-5mm的小花枝钻孔，然后向孔内注入秋水仙碱诱变液，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
特别是，步骤1c)中所述诱变处理过程中，秋水仙碱诱变液的用量为10-30ml，优选为15ml。
尤其是，还包括在秋水仙碱诱变处理结束后，使用保鲜膜缠绕封闭诱变处理后的花枝。
本发明对秋水仙碱诱导桉树大孢子染色体加倍过程中最佳诱导参数进行了研究和筛选。由于桉树花蕾内长花丝雄蕊小孢子母细胞减数分裂进程总是领先于短花丝雄蕊，因此不必解剖分离长短花丝，而是更为便捷的直接挑取各类型雄蕊的花药经显微镜进行压片观察，在选定的桉树花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现时作为标记时间点，在之后的第5-10天，分别采用在靠近花序处直径约为3mm的细小花枝钻孔并利用毛细管原理使用装满秋水仙碱溶液的离心管经棉线绳缓慢导入药液，和在直径约为20mm的粗花枝基部钻孔并使用医用输液器缓慢滴注药液的方法，各自分别选用浓度为0.25％和0.50％的秋水仙碱溶液进行连续6h的处理，在种子成熟后经播种育苗和子代倍性检测，统计各处理组的成苗数、三倍体株数和三倍体得率。结果表明：共选育获得桉树三倍体7株。在不同的处理组别中，处理的时期、秋水仙碱溶液的浓度和处理方法的选择均对三倍体得率产生了重要影响。选择以直径约为20mm的大花枝基部钻孔并使用医用输液器缓慢滴注药液的处理方法，可以收获更多的可育种子，但仅在第7天以0.25％浓度的秋水仙碱溶液处理组别内获得了1株三倍体子代，三倍体得率较低；选择以靠近花序处直径约为3mm的细小花枝钻孔空并利用毛细管原理使用装满秋水仙碱溶液的离心管经棉线绳缓慢导入药液进行处理的方法，收获的可育种子数较少，但在第6天以0.50％浓度的秋水仙碱溶液处理的组别和第7天以0.25％浓度的秋水仙碱溶液处理的组别中，分别得到了1株和5株三倍体子代，表明在更靠近花序处的细小花枝内导入秋水仙碱溶液可以省去药液在大花枝内的运输环节带来的扩散和损失，使得药液可以更为直接的作用于大孢子母细胞，尽管由此可能对花蕾产生更多的毒害作用使得结实率较前一种处理方法有所降低，但可以获得更高的三倍体得率。
本发明诱导桉树三倍体的方法，明确了桉树大孢子染色体加倍工作中选择花蕾发育合适时期的方法，并进一步对秋水仙碱处理诱导桉树大孢子染色体加倍的处理方法和处理条件进行了筛选和优化，提高了三倍体桉树选育效率，具有很强的可操作性。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
本发明具体实施方式中以尾叶桉为例进行说明，其他桉树如巨桉(E.grandis)、粗皮桉(E.pellita)或尾巨桉杂交种(E.urophylla×E.grandis)也适用于本发明。
实施例1桉树大孢子母细胞减数分裂进程的判定及染色体加倍处理时机选择
植物大孢子深埋于子房内的胚珠组织内，使得大孢子母细胞减数分裂进程不能即时观察。由于秋水仙碱诱导细胞染色体加倍的有效作用时期为细胞分裂期，因此需要找到一种方法能够便捷的判断其大孢子母细胞减数分裂进程，用以确定施加秋水仙碱处理诱导大孢子染色体加倍的有效处理时机。
尾叶桉花蕾为雌雄同花，具有双层蒴盖结构，研究发现：尾叶桉花蕾发育具有不同步性，具体表现为不同花枝间，以及同一花枝不同位置上的花蕾大、小孢子母细胞减数分裂进程的高度不同步。
在外层蒴盖脱落后，每天对选定的花枝上不同发育程度的花蕾进行采样，并对每个花蕾包含雄蕊和子房的部分进行分离后分别标号，立即用预冷的FAA固定液(体积分数:70％乙醇：冰乙酸：38％甲醛＝90:5:5(v/v/v))固定，采样直至花蕾发育至内层蒴盖变为白色为止。对固定的雄蕊的花药进行压片观察(2％醋酸洋红染色)；对固定的子房部分进行石蜡切片观察(海式苏木精染色)。
对同一花蕾不同类型雄蕊小孢子母细胞减数分裂进程和大、小孢子母细胞减数分裂进程的对应性关系，以及不同发育程度的花蕾间，其大、小孢子母细胞减数分裂进程的时序性关系进行统计分析，用以总结处于大孢子母细胞减数分裂期，适宜于进行大孢子染色体加倍处理的花蕾发育时期的快速辨别方法。
使用醋酸洋红压片、石蜡切片等技术方法，对不同时间里采集固定到的尾叶桉花蕾大、小孢子母细胞减数分裂进程进行细胞学观察。结果表明：尾叶桉花蕾内包含有小孢子母细胞减数分裂进程完全不同步的长、短两种雄蕊，长花丝雄蕊上小孢子母细胞发育进程总是领先于短花丝雄蕊；同一花蕾内，大孢子母细胞减数分裂进程，与其小孢子母细胞发育进程存在对应性关系；同一花枝上不同花蕾大、小孢子母细胞减数分裂进程具有不同步性。
为了便于进一步分析，同时也为了简化制片流程，以花蕾内能够观察到的发育时期最早的小孢子母细胞所处的减数分裂时期作为雄蕊发育时期的标准(即长花丝雄蕊小孢子母细胞减数分裂所处的时期)，统计结果如表1。
表1尾叶桉花蕾大、小孢子母细胞减数分裂时期对应关系
a选定的花枝上发育进度最快的花蕾内首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现时，
作为起始标记时间点；b减数分裂所处时期所占的百分比(％)
由表1的观察结果可知，同一花蕾内，小孢子母细胞的减数分裂进程领先于大孢子母细胞；当小孢子母细胞减数分裂率先进入细线期-终变期时，大孢子母细胞仍未进入分裂期；以此时(即选定花枝上直径最大、发育最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂进入细线期时)作为起始标记点，在之后的第5天，小孢子母细胞减数分裂已领先进入中期I-末期I，此时大孢子母细胞减数分裂开始进入细线期-粗线期，适宜于开始进行秋水仙碱溶液处理诱导尾叶桉大孢子染色体加倍工作，即选择在首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现时开始计时，作为标记时间点，在此之后的第5天及之后可以进行秋水仙碱诱导处理；
对于选定的花枝，因不同位置花蕾发育不同步带来的时序性差异，在首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现时开始计时的第5天之后发育进度靠后的花蕾不断进入大孢子母细胞减数分裂期，因而此后的数天均为秋水仙碱溶液处理诱导尾叶桉大孢子染色体加倍的合适时期。
实施例2秋水仙碱诱变处理
于7月中旬，根据实施例1确定的尾叶桉花芽进入大孢子母细胞减数分裂期时，即对选定的每个花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内的花药进行醋酸洋红染色压片并经显微镜观察，首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现时开始计时，作为标记时间点，对每个待处理花序进行标记；
在首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现之后的第5-10天，分别于第5、6、7、8、9、10天在选定的直径约为20mm(通常为10-30mm)的不同大花枝基部钻孔，其中：钻孔方向与花序生长方向相平行，孔径为1.5mm(通常为1-2mm)，孔的深度为10mm(通常为2-15mm)；
然后分别于第5、6、7、8、9、10天将医用输液器针头埋入不同的孔内；使用医用输液器缓慢滴注浓度分为0.25％、0.50％的秋水仙碱药液；每个处理的花枝注入秋水仙碱溶液的时间为6h(通常还可以为3-12h)，注入的秋水仙碱溶液的体积为100ml(通常还可以为50-150ml)。
对照例1
在处理的同时，标记处于相同发育状态的未进行化学处理的直径约为20mm的大花枝上的花蕾为对照组1。
实施例2A秋水仙碱处理
于7月中旬，根据实施例1确定的尾叶桉花芽进入大孢子母细胞减数分裂期时，即对选定的每个花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内的花药进行醋酸洋红染色压片并经显微镜观察，首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现时开始计时，作为标记时间点，对每个待处理花序进行标记；
在首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现之后的第5-10天，分别于第5、6、7、8、9、10天在选定的距离花序10mm(通常还可以是5-12mm)，直径约为3mm(通常为2-5mm)的细小花枝钻孔，其中：钻孔方向与花序生长方向相平行；孔径为1.5mm(通常为1-2mm)；孔的深度为1mm(通常为1-2mm)；
然后分别将棉线绳一端埋入不同的孔内；利用毛细管原理使装满秋水仙碱溶液的离心管内的秋水仙碱溶液经棉线绳缓慢导入孔内，对选定的非离体状态下处于不同发育时期的花枝上的花蕾进行秋水仙碱诱变处理；秋水仙碱溶液的浓度分为0.25％、0.50％；每个处理的花枝注入秋水仙碱溶液的时间为6h(通常还可以为3-12h)；每个处理中，每个小花枝吸收导入的秋水仙碱溶液的量为15ml(通常为10-30ml)。
对照例2
在处理的同时，标记处于相同发育状态的未进行化学处理的花序处直径约为3mm的细小花枝的花蕾为对照组2。
实施例3种子收集
秋水仙碱诱导处理结束后，桉树自然授粉，结实，于次年5月收集成熟的尾叶桉种子，为防止种子脱落，在蒴果开裂前进行采种。
采集下来的蒴果按诱变处理组和对照组的编号进行整理和人工晾晒，蒴果开裂后即可收集到脱落下来的成熟种子。成熟种子可以立即播种，也可在4℃温度下冷藏保存，待之后择机进行播种。
实施例4播种育苗
将沙土(黏土：河沙＝1：1(V/V))装入播种盆，高锰酸钾溶液喷淋消毒后，用清水多次浇淋，去除多余的消毒剂。种子撒播后覆土约5mm，同时搭建遮荫棚防晒，每日喷灌2-3次，种子萌发生长出子代植株，直至子代植株长出2片以上真叶时，将幼苗移植至轻基质营养杯中继续遮荫培养。当幼苗长至10cm以上并具有多片成熟叶片时，即可进行倍性水平检测。
实施例5倍性水平检测
取约0.5-1.0cm2大小的幼苗叶片，加入1ml冷藏的细胞核分离缓冲液(包含50mMGlucose(葡萄糖)，15mM Sodium chloride(NaCl)，15mM Potassium chloride(KCl)，5mMEDTA disodium salt(EDTA-Na)，50mM Sodium citrate(柠檬酸钠)，50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，0.5％Tween 20(吐温-20)，pH 7.2)，并用锋利的刀片迅速切碎，经50μm孔径尼龙网过滤后，滤液中再加入100μl浓度为50μl/ml的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole))染色液，混匀后静置5min。
使用倍性检测仪(倍性检测仪，Partec公司，德国)，以桉树二倍体叶片为对照，对诱变处理组获得的幼苗进行倍性水平检测，统计桉树三倍体得率。统计结果如表2。
表2秋水仙碱溶液处理诱导尾叶桉大孢子染色体加倍选育三倍体
a选定的花枝上发育进度最快的花蕾内首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现时，作为标记时间点；
b大花枝钻孔指在直径约为20mm的大花枝基部钻孔并使用医用输液器缓慢滴注药液的方法；小花枝钻孔指在靠近花序处直径约为3mm的细小花枝钻孔并利用毛细管原理使用装满秋水仙碱溶液的离心管经棉线绳缓慢导入药液进行处理的方法
由表2的统计结果可知：
1、本发明方法成功诱导获得尾叶桉三倍体植株，从不同的处理组别获得的子代苗中总共鉴定得到7株三倍体。
2、在不同的处理组别中，处理的时机、秋水仙碱溶液的浓度和处理方法的选择均对三倍体得率产生了显著影响：选择以直径约为20mm的大花枝基部钻孔并使用医用输液器缓慢滴注药液的处理方法，可以收获更多的可育种子，但仅在第7天以0.25％浓度的秋水仙碱溶液处理组别内获得了1株三倍体子代，三倍体得率较低；而选择以靠近花序处直径约为3mm的细小花枝钻孔并利用毛细管原理使用装满秋水仙碱溶液的离心管经棉线绳缓慢导入药液进行处理的方法，收获的可育种子数较少，但在第6天以0.50％浓度的秋水仙碱溶液处理组别和第7天以0.25％浓度的秋水仙碱溶液处理组别中，分别得到了1株和5株三倍体子代，表明在更靠近花蕾处的小花枝内导入秋水仙碱可以省去药液在大花枝内的运输环节带来的扩散和损失，使得药液可以更为直接的作用于大孢子母细胞，尽管由此可能对花蕾产生更多的毒害作用使得结实率较前一种处理方法有所降低，但可以获得更高的三倍体得率。
3、在第5-10天的处理组别中，得到的三倍体子代全部来源于第6-7天的处理，并且以第7天的处理最为有效，共获得6株三倍体，表明处理时机的选择对三倍体得率的影响更为显著。
4、本发明方法在选定的桉树花枝上，以直径最大、发育进度最快的花蕾内首次观察到有小孢子母细胞减数分裂细线期出现时作为标记时间点，在之后的第7天，采用以靠近花序处直径约为3mm的细小花枝钻孔并利用毛细管原理使用装满秋水仙碱溶液的离心管经棉线绳将药液缓慢导入细小花枝的方法，选用浓度为0.25％的秋水仙碱溶液连续处理6h，可以实现最高的三倍体得率。
Claims (10)
1.一种桉树三倍体的诱导方法，其特征是，包括对处于减数分裂时期的桉树花蕾注入秋水仙碱诱变剂，进行秋水仙碱诱变处理。
2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征是，所述减数分裂时期是指桉树花枝上直径最大，发育进度最快的花蕾内首次观察到小孢子母细胞处于减数分裂细线期后的5-10天。
3.如权利要求1所述的诱导方法，其特征是，所述减数分裂时期是指桉树花枝上直径最大，发育进度最快的花蕾内首次观察到小孢子母细胞处于减数分裂细线期后的6-7天。
4.如权利要求1-3任一所述的诱导方法，其特征是，所述桉树选择尾叶桉(Eucalyptusurophylla)、巨桉(E.grandis)、粗皮桉(E.pellita)或尾巨桉杂交种(E.urophylla×E.grandis)。
5.如权利要求1-3任一所述的诱导方法，其特征是，所述秋水仙碱诱变液的质量百分浓度为0.25-0.50％；诱变处理时间为3-12h。
6.一种桉树三倍体的诱导方法，其特征是，包括如下步骤：
1)选定待诱变处理桉树花枝，并观察选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂状态；
2)当观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现时，开始计时；
3)在观察到细线期出现后的第5-10天内，在直径为10-30mm的大花枝基部钻孔，然后向孔内注入秋水仙碱诱变液，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
7.如权利要求6所述的诱导方法，其特征是，步骤3)中所述秋水仙碱诱变液的质量百分浓度为0.25-0.50％；诱变处理时间为3-12h。
8.一种桉树三倍体的诱导方法，其特征是，包括如下步骤：
A)选定待诱变处理桉树花枝，并观察选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂状态；
B)当观察到选定花枝上直径最大、发育进度最快的花蕾内小孢子母细胞减数分裂细线期出现时，开始计时；
C)在观察到细线期出现后的第5-10天内，在距离花序5-12mm处，对直径为2-5mm的小花枝钻孔，然后向孔内注入秋水仙碱诱变液，进行所述的秋水仙碱诱变处理。
9.如权利要求8所述的诱导方法，其特征是，步骤C)中所述秋水仙碱诱变液的质量百分浓度为0.25-0.50％；诱变处理时间为3-12h。
10.一种桉树三倍体的诱导方法，其特征是，包括如下步骤：
1)采用秋水仙碱溶液对处于减数分裂时期的桉树花蕾进行诱变处理；
2)诱变处理后的花蕾自然授粉，结实；
3)待种子成熟后，收集种子，播种育苗，检测子代植株倍性水平，筛选获得三倍体桉树植株。
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| CN113575340A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-11-02 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种确定蝴蝶兰小孢子母细胞发育时期的方法 |
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- 2018-04-23 CN CN201810364809.0A patent/CN108541586A/zh active Pending
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