CN108514896A - 一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法及装置 - Google Patents
一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法及装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：以聚乙二醇水溶液为外水相，葡聚糖+海藻酸钠水溶液为内水相；通过同轴毛细管装置在其锥尖处产生双水相海藻酸钠液滴；其中外水相为连续进样，内水相为周期性间歇进样；将双水相海藻酸钠液滴通入氯化钙水溶液中，即生成所需要的单分散海藻酸钙微球；本发明不需要对海藻酸钠或双水相经过复杂的前处理过程，生成方式简单快捷、生物相容性好；形成的微球均稳定，微球大小可控制；装置结构简单、制作灵活方便，操作控制精准，易于批量生产。
Description
技术领域
本发明涉及海藻酸钙微球的制备方法及装置，具体涉及一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法及装置。
背景技术
海藻酸凝胶微球具有良好的生物降解性、生物兼容性以及无毒性等特点，可用做包封细胞、药物的载体，被广泛用于药物输送、药物释放、酶工程反应以及3D细胞培养等；目前传统工艺大多通过滴入法、电喷雾法、喷墨印刷法等来产生海藻酸钙微球；2016年顾晓龙等人(顾晓龙，广州化工，2016，19，120)用于模拟药物释放，虽然这种方法能够产生大小均一的微球，但是微球尺寸较大，且不可调控；2013年Alessandri等人(Alessandri,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2013,37,14843)实用喷墨印刷法产生海藻酸盐微凝胶，但是产生的海藻酸盐微凝胶尺寸不均一、大小不可控；2015年Nguyen等人(Duy Khiem Nguyen,Advanced HealthcareMaterials,2015,10,1537)使用电喷雾法来产生海藻酸钙微凝胶，但是该设备中的高压电场对细胞有损伤，不能直接包裹细胞进行后续操作，限制了微凝胶的使用。
近年来，利用新兴的微流控技术可以产生尺寸单一且可控的海藻酸微球，然而大多数微流控方法主要利用油水两相来产生油包水的海藻酸液滴进而产生微球；这类方法虽然能产生单分散性好的微球，但是由于引入了油相和表面活性剂，会降低微球的生物相容性(Marcoux,Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2011,377,54)；另外，将油水海藻酸钠液滴导入芯片外交联，由于液滴在下落到接收液的过程中以及在穿过接受液的油水界面时受到多种不平衡的作用力而发生变形，生成的微球往往带有“尾巴”，呈泪滴或蝌蚪状(Yung-Sheng Lin,Electrophoresis,2013,34,425)，球形度不好，会影响药物释放效果。
一定浓度的聚乙二醇和葡聚糖水溶液可自发分相从而形成双水相体系，由于该体系具有良好的生物相容性和选择分配性，常被用作蛋白质、核酸等生物大分子物质的分离提取；近些年，用微流控制备海藻酸钙微球的研究都集中在油水液滴来制备，却很少有人研究用生物相容性良好的双水相来制备海藻酸钙微球；究其原因是双水相间低的表面张力和剪切力很难直接形成水包水的稳定液滴；需要对海藻酸钠进行前处理，操作繁琐；2017年Liu等人(Yang Liu,Biomedical Microdevices,2017,19,55)通过PDMS微流控芯片可制备双水相海藻酸钙微球；但是这种方法不仅需要将海藻酸钠进行改性，且使用了影响生物相容性的氧化剂和过氧化氢酶，同时产生的微球尺寸不均一。
发明内容
本发明提供一种无需引入油相和表面活性剂，并且微球尺寸均一可控，生物相容性好的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法及装置。
本发明采用的技术方案是：
一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
以聚乙二醇水溶液为外水相，葡聚糖+海藻酸钠水溶液为内水相；通过同轴毛细管装置在其锥尖处产生双水相海藻酸钠液滴；其中外水相为连续进样，内水相为周期性间歇进样；
将双水相海藻酸钠液滴通入氯化钙水溶液中，即生成所需要的单分散海藻酸钙微球。
进一步的，所述聚乙二醇、葡聚糖和海藻酸钠水溶液的配制过程如下：
分别配制质量分数为8％(w/w)的聚乙二醇水溶液和8％(w/w)的葡聚糖水溶液；通过旋转培养器充分混合后，静置6小时后分相；
其中上相为聚乙二醇溶液作为外水相，下相为葡聚糖溶液；下相中加入海藻酸钠，形成葡聚糖+海藻酸钠水溶液；葡聚糖+海藻酸钠水溶液中海藻酸钠质量分数为0.5％。
进一步的，所述氯化钙溶液浓度为10％(w/w)。
进一步的，所述单分散海藻酸钙微球直径为200～400μm。
进一步的，所述外水相和内水相均通过空气泵进行进样；外水相进样压强为0.016MPa；内水相进样过程中开启空气泵0.2s，关闭1.5s作为一个进样周期，进样压强为0.017MPa～0.047MPa。
一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球制备方法的装置，包括内水相进料毛细管和套设在其外部的外水相进料毛细管；内水相进料毛细管一端连接内水相进料口一端连接锥形管；外水相进料毛细管一端连接外水相进料口，另一端连接外水相出料口；锥形管出口设置在外水相进料毛细管内靠近外水相出料口一端；外水相进料毛细管和内水相进料毛细管之间形成外水相间隙；外水相进料口和内水相进料口均连接空气泵；外水相出料口连接氯化钙溶液。
进一步的，所述内水相进料毛细管外径为700～1000μm内径为300～650μm；锥形管出口内径为50～650μm；外水相进料毛细管内径为1000～1200μm。
进一步的，所述外水相进样压强为0.016MPa，内水相进样压强为0.017MPa，形成双水相海藻酸钠液滴，滴入氯化钙溶液中得到的单分散海藻酸钙微球直径为215μm。
进一步的，所述外水相进样压强为0.016MPa，内水相进样压强为0.047MPa，形成双水相海藻酸钠液滴，滴入氯化钙溶液中得到的单分散海藻酸钙微球直径为381μm。
进一步的，所述外水相进样压强为0.016MPa，内水相进样压强为0.027MPa，形成双水相海藻酸钠液滴，滴入氯化钙溶液中得到的单分散海藻酸钙微球直径为332μm。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过直接生成双水相海藻酸钠液滴外部交联法形成，不需要对海藻酸钠或双水相经过复杂的前处理过程，生成方式简单快捷；并且由于制备过程完全水溶液中进行，因此具有良好的生物相容性；
(2)本发明一步法制备完成，制备方法简便快捷、形成的微球均稳定，微球大小可控制，其范围在200～400μm；
(3)本发明装置结构简单、制作灵活方便，利用空气泵控制流速、操作控制精准，易于批量生产。
附图说明
图1为本发明微流控原理示意图。
图2为本发明微流控装置结构示意图。
图3为本发明实施例中带空气泵的整体结构示意图；其中A为空气泵通道A，通入内水相；B为空气泵通道B，通入外水相。
图4为本发明实施例1所制备的双水相海藻酸钙微球的显微图片。
图5为本发明实施例2所制备的双水相海藻酸钙微球的显微图片。
图6为本发明实施例3所制备的双水相海藻酸钙微球的显微图片。
图7为本发明实施例4所制备的双水相海藻酸钙微球的显微图片。
图8为本发明实施例5所制备的双水相海藻酸钙微球的显微图片。
图9为本发明实施例6所制备的双水相海藻酸钙微球的显微图片。
图10为本发明实施例7所制备的双水相海藻酸钙微球的显微图片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，包括以下步骤：
以聚乙二醇水溶液为外水相，葡聚糖+海藻酸钠水溶液为内水相；通过同轴毛细管装置在其锥尖处产生双水相海藻酸钠液滴；其中外水相为连续进样，内水相为周期性间歇进样；
将双水相海藻酸钠液滴通入氯化钙水溶液中，即生成所需要的单分散海藻酸钙微球。
进一步的，所述聚乙二醇、葡聚糖和海藻酸钠水溶液的配制过程如下：
分别配制质量分数为8％(w/w)的聚乙二醇水溶液和8％(w/w)的葡聚糖水溶液；通过旋转培养器充分混合后，静置6小时后分相；
其中上相为聚乙二醇溶液作为外水相，下相为葡聚糖溶液；下相中加入海藻酸钠，形成葡聚糖+海藻酸钠水溶液；葡聚糖+海藻酸钠水溶液中海藻酸钠质量分数为0.5％。
进一步的，所述氯化钙溶液浓度为10％(w/w)。
进一步的，所述单分散海藻酸钙微球直径为200～400μm。
进一步的，所述外水相和内水相均通过空气泵进行进样；外水相进样压强为0.016MPa；内水相进样过程中开启空气泵0.2s，关闭1.5s作为一个进样周期，进样压强为0.017MPa～0.047MPa。
如图1-3所示，一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法的装置，包括内水相进料毛细管100和套设在其外部的外水相进料毛细管300；内水相进料毛细管100一端连接内水相进料口110一端连接锥形管200；外水相进料毛细管300一端连接外水相进料口310，另一端连接外水相出料口330；锥形管出口210设置在外水相进料毛细管300内靠近外水相出料口330一端；外水相进料毛细管300和内水相进料毛细管100之间形成外水相间隙320；外水相进料口310和内水相进料口110均连接空气泵；外水相出料口330连接氯化钙溶液；内水相进料毛细管100外径为700～1000μm内径300～650μm；锥形管出口210内径为50～650μm；外水相进料毛细管300内径为1000～1200μm；采用间歇式进样方式将内水相通过内水相进料口110注入装置即可产生双水相海藻酸钠液滴；将产生的双水相海藻酸钠液滴通过硅胶管导入氯化钙溶液中，即可得到海藻酸钙微球。
本发明所用装置采用玻璃毛细管与不锈钢点胶机针头组合的构造，外水相进料毛细管300为长10cm，外径为1200～1500μm内径1000～1200μm的毛细玻璃管；内水相进料毛细管100为长2.5cm，外径700～1000μm内径300～650μm的毛细玻璃管；将内水相进料毛细管100的一端经显微拉针仪拉制微处理得到的尖头处内径为50～650μm的锥形管；按照图2所示的装置示意图组装并采用市售的AB胶密封固定在载玻片上；得到如图3所示的装置；装置的尺寸可根据实际情况做出适当调整。
实施例1
(1)溶液的配制，分别配制50mL质量分数分别为8％(w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和8％(w/w)的葡聚糖(Dex)水溶液；充分混合后，静置6小时后分相；上相为PEG溶液，下相为Dex溶液；分别抽取上下相于两个烧杯中备用；在抽取后的Dex溶液中加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠质量分数为0.5％(w/w)的葡聚糖+海藻酸钠溶液，混合均匀，置于烧杯备用；用去离子水配制10％(w/w)的CaCl2溶液。
(2)双水相海藻酸钙微球的制备，分别取葡聚糖+海藻酸钠溶液、PEG溶液置于空气泵小瓶A、B中；使用空气泵周期性的间歇式输入内相，开启时间0.2s、关闭时间1.5s；外相采用连续式输入；设置输入A的压强为0.017MPa，输入B的压强为0.016MPa；通过如图3所示的装置即可在外水相进料管300内形成海藻酸钠液滴，将生成的液滴通入到CaCl2溶液中即可得到双水相的海藻酸钙微球。
图4为本实施例制备的双水相海藻酸钙微球显微图；从图中可以看出在氯化钙溶液中分散有尺寸均一的海藻酸钙微球，微球的平均直径为215μm。
实施例2
(1)溶液的配制，分别配制50mL质量分数分别为8％(w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和8％(w/w)的葡聚糖(Dex)水溶液；充分混合后，静置6小时后分相；上相为PEG溶液，下相为Dex溶液；分别抽取上下相于两个烧杯中备用；在抽取后的Dex溶液中加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠质量分数为0.5％(w/w)的葡聚糖+海藻酸钠溶液，混合均匀，置于烧杯备用；用去离子水配制10％(w/w)的CaCl2溶液。
(2)双水相海藻酸钙微球的制备，分别取葡聚糖+海藻酸钠溶液、PEG溶液置于空气泵小瓶A、B中；使用空气泵周期性的间歇式输入内相，开启时间0.2s、关闭时间1.5s；外相采用连续式输入；设置输入A的压强为0.022MPa，输入B的压强为0.016MPa；通过如图3所示的装置即可在外水相进料管300内形成海藻酸钠液滴，将生成的液滴通入到CaCl2溶液中即可得到双水相的海藻酸钙微球。
图5为本实施例制备的双水相海藻酸钙微球显微图；从图中可以看出在氯化钙溶液中分散有尺寸均一的海藻酸钙微球，微球的平均直径为251μm。
实施例3
(1)溶液的配制，分别配制50mL质量分数分别为8％(w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和8％(w/w)的葡聚糖(Dex)水溶液；充分混合后，静置6小时后分相；上相为PEG溶液，下相为Dex溶液；分别抽取上下相于两个烧杯中备用；在抽取后的Dex溶液中加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠质量分数为0.5％(w/w)的葡聚糖+海藻酸钠溶液，混合均匀，置于烧杯备用；用去离子水配制10％(w/w)的CaCl2溶液。
(2)双水相海藻酸钙微球的制备，分别取葡聚糖+海藻酸钠溶液、PEG溶液置于空气泵小瓶A、B中；使用空气泵周期性的间歇式输入内相，开启时间0.2s、关闭时间1.5s；外相采用连续式输入；设置输入A的压强为0.027MPa，输入B的压强为0.016MPa；通过如图3所示的装置即可在外水相进料管300内形成海藻酸钠液滴，将生成的液滴通入到CaCl2溶液中即可得到双水相的海藻酸钙微球。
图6为本实施例制备的双水相海藻酸钙微球显微图；从图中可以看出在氯化钙溶液中分散有尺寸均一的海藻酸钙微球，微球的平均直径为332μm。
实施例4
(1)溶液的配制，分别配制50mL质量分数分别为8％(w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和8％(w/w)的葡聚糖(Dex)水溶液；充分混合后，静置6小时后分相；上相为PEG溶液，下相为Dex溶液；分别抽取上下相于两个烧杯中备用；在抽取后的Dex溶液中加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠质量分数为0.5％(w/w)的葡聚糖+海藻酸钠溶液，混合均匀，置于烧杯备用；用去离子水配制10％(w/w)的CaCl2溶液。
(2)双水相海藻酸钙微球的制备，分别取葡聚糖+海藻酸钠溶液、PEG溶液置于空气泵小瓶A、B中；使用空气泵周期性的间歇式输入内相，开启时间0.2s、关闭时间1.5s；外相采用连续式输入；设置输入A的压强为0.032MPa，输入B的压强为0.016MPa；通过如图3所示的装置即可在外水相进料管300内形成海藻酸钠液滴，将生成的液滴通入到CaCl2溶液中即可得到双水相的海藻酸钙微球。
图7为本实施例制备的双水相海藻酸钙微球显微图；从图中可以看出在氯化钙溶液中分散有尺寸均一的海藻酸钙微球，微球的平均直径为337μm。
实施例5
(1)溶液的配制，分别配制50mL质量分数分别为8％(w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和8％(w/w)的葡聚糖(Dex)水溶液；充分混合后，静置6小时后分相；上相为PEG溶液，下相为Dex溶液；分别抽取上下相于两个烧杯中备用；在抽取后的Dex溶液中加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠质量分数为0.5％(w/w)的葡聚糖+海藻酸钠溶液，混合均匀，置于烧杯备用；用去离子水配制10％(w/w)的CaCl2溶液。
(2)双水相海藻酸钙微球的制备，分别取葡聚糖+海藻酸钠溶液、PEG溶液置于空气泵小瓶A、B中；使用空气泵周期性的间歇式输入内相，开启时间0.2s、关闭时间1.5s；外相采用连续式输入；设置输入A的压强为0.037MPa，输入B的压强为0.016MPa；通过如图3所示的装置即可在外水相进料管300内形成海藻酸钠液滴，将生成的液滴通入到CaCl2溶液中即可得到双水相的海藻酸钙微球。
图8为本实施例制备的双水相海藻酸钙微球显微图；从图中可以看出在氯化钙溶液中分散有尺寸均一的海藻酸钙微球，微球的平均直径为342μm。
实施例6
(1)溶液的配制，分别配制50mL质量分数分别为8％(w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和8％(w/w)的葡聚糖(Dex)水溶液；充分混合后，静置6小时后分相；上相为PEG溶液，下相为Dex溶液；分别抽取上下相于两个烧杯中备用；在抽取后的Dex溶液中加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠质量分数为0.5％(w/w)的葡聚糖+海藻酸钠溶液，混合均匀，置于烧杯备用；用去离子水配制10％(w/w)的CaCl2溶液。
(2)双水相海藻酸钙微球的制备，分别取葡聚糖+海藻酸钠溶液、PEG溶液置于空气泵小瓶A、B中；使用空气泵周期性的间歇式输入内相，开启时间0.2s、关闭时间1.5s；外相采用连续式输入；设置输入A的压强为0.042MPa，输入B的压强为0.016MPa；通过如图3所示的装置即可在外水相进料管300内形成海藻酸钠液滴，将生成的液滴通入到CaCl2溶液中即可得到双水相的海藻酸钙微球。
图9为本实施例制备的双水相海藻酸钙微球显微图；从图中可以看出在氯化钙溶液中分散有尺寸均一的海藻酸钙微球，微球的平均直径为376μm。
实施例7
(1)溶液的配制，分别配制50mL质量分数分别为8％(w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和8％(w/w)的葡聚糖(Dex)水溶液；充分混合后，静置6小时后分相；上相为PEG溶液，下相为Dex溶液；分别抽取上下相于两个烧杯中备用；在抽取后的Dex溶液中加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠质量分数为0.5％(w/w)的葡聚糖+海藻酸钠溶液，混合均匀，置于烧杯备用；用去离子水配制10％(w/w)的CaCl2溶液。
(2)双水相海藻酸钙微球的制备，分别取葡聚糖+海藻酸钠溶液、PEG溶液置于空气泵小瓶A、B中；使用空气泵周期性的间歇式输入内相，开启时间0.2s、关闭时间1.5s；外相采用连续式输入；设置输入A的压强为0.047MPa，输入B的压强为0.016MPa；通过如图3所示的装置即可在外水相进料管300内形成海藻酸钠液滴，将生成的液滴通入到CaCl2溶液中即可得到双水相的海藻酸钙微球。
图10为本实施例制备的双水相海藻酸钙微球显微图；从图中可以看出在氯化钙溶液中分散有尺寸均一的海藻酸钙微球，微球的平均直径为381μm。
本发明制备方法可解决在微流控中用油水相、现有的双水相或者用喷墨打印、喷雾法和滴入法产生的海藻酸钙微球生物相容性差、尺寸不均一、大小不可控等问题；通过空气泵循环周期性的注入内相，克服了双水相表面张力和剪切力弱的问题；不需要在装置中进行诸如预交联反应或海藻酸钠前处理等复杂操作；本发明利用空气泵循环周期性的输入内水相从而使其被截断形成水包水液滴，生成的液滴通入氯化钙溶液即形成海藻酸钙微球；该微球稳定性好、尺寸可调控并且产生过程在生物相容性良好的水相溶液中进行；因此有望在食品、药物研究开发、组织工程和酶工程等领域得到广泛应用。该方法与其他微流控制备海藻酸钙单分散微球的方法相比，无需引入油相和表面活性剂，且海藻酸钠和双水相均无需经过复杂的预改性、前处理以及加入氧化剂等程序，具有简便快捷、微球尺寸均一可控(直径为200～400μm)并且生物相容性好的优点，具有更广泛的用途。
Claims (10)
1.一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以聚乙二醇水溶液为外水相，葡聚糖+海藻酸钠水溶液为内水相；通过同轴毛细管装置在其锥尖处产生双水相海藻酸钠液滴；其中外水相为连续进样，内水相为周期性间歇进样；
将双水相海藻酸钠液滴通入氯化钙水溶液中，即生成所需要的单分散海藻酸钙微球。
2.根据权利要求1所述的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇、葡聚糖和海藻酸钠水溶液的配制过程如下：
分别配制质量分数为8％(w/w)的聚乙二醇水溶液和8％(w/w)的葡聚糖水溶液；通过旋转培养器充分混合后，静置6小时后分相；
其中上相为聚乙二醇溶液作为外水相，下相为葡聚糖溶液；下相中加入海藻酸钠，形成葡聚糖+海藻酸钠水溶液；葡聚糖+海藻酸钠水溶液中海藻酸钠质量分数为0.5％。
3.根据权利要求1所述的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，所述氯化钙溶液浓度为10％(w/w)。
4.根据权利要求1所述的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，所述单分散海藻酸钙微球直径为200～400μm。
5.根据权利要求1所述的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，所述外水相和内水相均通过空气泵进行进样；外水相进样压强为0.016MPa；内水相进样过程中开启空气泵0.2s，关闭1.5s作为一个进样周期，进样压强为0.017MPa～0.047MPa。
6.一种如权利要求1所述微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法的装置，其特征在于，包括内水相进料毛细管(100)和套设在其外部的外水相进料毛细管(300)；内水相进料毛细管(100)一端连接内水相进料口(110)一端连接锥形管(200)；外水相进料毛细管(300)一端连接外水相进料口(310)，另一端连接外水相出料口(330)；锥形管出口(210)设置在外水相进料毛细管(300)内靠近外水相出料口(330)一端；外水相进料毛细管(300)和内水相进料毛细管(100)之间形成外水相间隙(320)；外水相进料口(310)和内水相进料口(110)均连接空气泵；外水相出料口(330)连接氯化钙溶液。
7.根据权利要求6所述的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球制备方法的装置，其特征在于，所述内水相进料毛细管(100)外径为700～1000μm内径300～650μm；锥形管出口(210)内径为50～650μm；外水相进料毛细管(300)内径为1000～1200μm。
8.根据权利要求5所述的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，所述外水相进样压强为0.016MPa，内水相进样压强为0.017MPa，形成双水相海藻酸钠液滴，滴入氯化钙溶液中得到的单分散海藻酸钙微球直径为215μm。
9.根据权利要求5所述的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，所述外水相进样压强为0.016MPa，内水相进样压强为0.047MPa，形成双水相海藻酸钠液滴，滴入氯化钙溶液中得到的单分散海藻酸钙微球直径为381μm。
10.根据权利要求5所述的一种微流控双水相单分散海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，所述外水相进样压强为0.016MPa，内水相进样压强为0.027MPa，形成双水相海藻酸钠液滴，滴入氯化钙溶液中得到的单分散海藻酸钙微球直径为332μm。
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